Summary
Le système ECIS / Taxis est un système automatisé, en temps réel test qui mesure la chimiotaxie cellulaire. Dans cet essai, les cellules se déplacent sous une couche d'agarose pour arriver à une électrode cible. Mouvement cellulaire est mesurée par l'apparition de la résistance en courant alternatif courant 0.
Abstract
Mouvement cellulaire en réponse à des stimuli externes est fondamental pour de nombreux processus cellulaires, y compris la cicatrisation des plaies, l'inflammation et la réponse à l'infection. Procédé pour mesurer la chimiotaxie commune est le dosage chambre de Boyden, dans lequel les cellules et chimioattractants sont séparées par une membrane poreuse. Comme les cellules migrent à travers la membrane vers le chimioattractant, ils adhèrent à la face inférieure de la membrane, ou à l'automne dans les médias sous-jacentes, et sont ensuite colorées et comptées visuellement 1. Dans cette méthode, les cellules sont exposées à un fort gradient chimiotactique et transitoire, qui est pensé pour être une mauvaise représentation des gradients trouvés dans les tissus 2.
Un autre système de dosage, la sous-agarose chimiotaxie dosage, 3, 4 mouvement cellulaire mesures sur un substrat solide dans un film mince aqueuse qui se forme sous la couche d'agarose. Le gradient qui se développe dans l'agarose est peu profond et est pensé pour être une applicationropriate représentation des gradients d'origine naturelle. Chimiotactisme peut être évaluée par imagerie microscopique de la distance parcourue. Tant le dosage chambre de Boyden et le dosage de la sous-agarose sont généralement configurés en tant que tests de point de terminaison.
Le processus automatisé ECIS / Taxis système combine l'approche sous-agarose avec impédance électrique cellulaire substrat Sensing (ECIS) 5, 6. Dans ce test, électrodes cibles se trouvent dans chacune des chambres 8. Un grande contre-électrode traverse chacune des chambres (8 figure 2). Chaque chambre est remplie avec de l'agarose et deux petits godets sont la coupe dans l'agarose sur chaque côté de l'électrode cible. Un puits est rempli avec la population de cellules d'essai, tandis que l'autre contient les sources de chimioattractant diffusion (Figure 3). Courant passé à travers le système peut être utilisé pour déterminer le changement de résistance qui se produit en tant que cellules passer l'électrode cible. Les cellules sur la cible Electrodee augmenter la résistance du système 6. En outre, des fluctuations rapides de la résistance représentent des changements dans les interactions des cellules avec la surface des électrodes et sont en cours indicatif de changements de forme cellulaire. Le système ECIS / Les taxis peuvent mesurer le mouvement de la population cellulaire en temps réel sur de longues périodes de temps, mais il est aussi assez sensible pour détecter l'arrivée d'une cellule unique à l'électrode cible.
Dictyostelium discoidium est connu pour migrer en présence d'un folate gradient 7, 8 et sa réponse chimiotactique peut être mesurés avec précision par ECIS / taxis 9. Chimiotactisme des leucocytes, en réponse à SDF1α et aux antagonistes de chimiotaxie a également été mesurée avec ECIS / Taxis 10, 11. Un exemple de la réponse des leucocytes à SDF1α est illustré à la figure 1.
Protocol
1. Préparation des électrodes ECIS / Taxis
- La surface d'or du réseau d'électrodes ECIS / taxis (constitué de 8 chambres par lame) est d'abord stabilisée par un traitement préalable avec la cystéine 10 mM stérile dans l'eau déminéralisée (dH 2 O) pendant 15 min à température ambiante dans des conditions stériles.
- Aspirer la solution cystéine à partir de chaque chambre d'électrode, rincer 3 fois avec O stérile dH 2, et les remplacer par 250 pi de milieu complet (RPMI 1640, 10% de FBS, 25 mM de tampon HEPES).
- Connectez le réseau d'électrodes à broches de contact sur support tableau instrument pour effectuer une vérification de l'électrode.
- Les chambres qui sont correctement connectés seront mis en évidence en vert sur l'écran d'ordinateur. Si les chambres sont surlignées en rouge, ils ne sont pas connectés et l'électrode doit être repositionné dans le support de tableau à établir des contacts pour toutes les chambres.
- Une fois toutes les chambres sont reliées, cliquez sur le bouton "Vérifier" dans le logiciel du contrôleur pour dissuaderminer la résistance initiale et des valeurs de capacité pour chaque chambre. Les valeurs de résistance devrait se situer entre 1600 et 2000 ohms, et des valeurs de capacité devrait se situer entre 5 et 6 nanofarads pour un tableau 8 Chambre. Si une chambre n'est pas dans ces paramètres acceptables, la chambre individuelle ne doit pas être utilisé pour recueillir des données.
- Débranchez l'électrode du porte-tableau à préparer les chambres individuelles d'agarose. Aspirer à moyen de chambres et laver chaque chambre stérile 3 fois avec dH 2 O.
2. Préparation Agarose Chambers
- Dans un tube de 15 ml stérile conique en polypropylène, mesure 0,03 g d'agarose GTG Seakem et ajouter 1 ml de PBS stérile. Remplacer le capuchon du tube lâche, et faire fondre l'agarose en autoclave pour un cycle de 2 min liquide (fusion dans un four micro-ondes n'est pas efficace pour ce test). Ce court laps de temps ne va pas fondre le tube conique. Pour les cellules moins exigeants qui ne nécessitent pas de sérum pour la culture (par exemple, Dictyostelium discoideum) 0,5%agarose peut être fait dans le milieu approprié et fondu dans un four micro-ondes. L'autoclave est nécessaire pour les cellules qui nécessitent du sérum, comme ce sera dénaturé si fondu au micro-ondes.
- Ajouter 5 ml de milieu RPMI complet chauffé dans un bain d'eau (55 ° -60 ° C) directement à l'agarose à chaud, à une concentration finale de 0,5% d'agarose et de haut en bas pipette doucement pour mélanger.
- Pipeter 300 ul d'agarose milieu fondu dans chaque chambre, remplacer les ECIS / couverture réseau taxis et de permettre au gel à la température ambiante.
- Pipeter en restant dans le capuchon d'agarose de tube de 15 ml d'évaluer gélifiant agarose. Cet excès d'agarose sera également utilisé dans la partie 4: coupe des puits dans l'agarose.
3. Construire et Affûtage de la canule outil de coupe bien
- Aiguisez deux jeunes de 14 canules fin calibre émoussée, l'aide d'un 5/64 "bits. Tourner la pointe du foret dans chaque ouverture canule avec une perceuse à vitesse lente, en s'assurant que la foret coupe toute bord intérieur de chaque op canuleforcement pour former un bord tranchant (figure 4A).
- Percez deux trous à travers 1 "x 2" x ¼ "en plexiglas (figure 4B-D) avec un 5/64" bits dans une perceuse à colonne. Insérez chaque aiguisé 14 canule de calibre de sorte qu'il dépasse d'une distance égale dans chaque trou en plexiglas.
4. Coupe Wells en Agarose
- Stériliser les canules de calibre 14 par une légère flamme des conseils. Avant la coupe de puits dans la chambre de ECIS, permettre à la canule à refroidir à température ambiante, ou refroidir la canule en touchant l'agarose dans le capuchon du tube de 15 ml. Si la température de la canule est trop élevé, l'agarose va fondre comme les puits de la chambre sont coupés, rendant les puits difforme et défectueux.
- Aligner le couple de canule au-dessus des deux points d'or autour de l'électrode cible dans chaque chambre (Figure 2c et 5). Insérez le verticalement canule, sans aucun mouvement horizontal, l'arrêt lors d'un contact en douceur entre la canule etla surface d'électrode. Retirez délicatement la canule, à nouveau, sans aucun mouvement horizontal. Mise en place de puits supplémentaires pour s'opposer à gradients est également possible avec une reconfiguration du gabarit canule.
- Aspirer doucement le bouchon d'agarose laissé par la canule, l'aide d'un stérile à 9 "pipette Pasteur, reliée à la pression sous vide à basse, avec un piège à vide attraper des déchets d'agarose.
- Ajouter 300 ul de milieu RPMI complet à la surface de chaque chambre à 37 ° C, pendant 2 min pour saturer l'agarose, puis aspirer délicatement les médias de la surface et les puits sans déranger l'agarose.
5. Chargement de la Wells
- Chaque puits est capable de contenir un volume de 7 pl. Pour un puits dans chaque chambre, ajouter 7 pl de suspension de cellules. Pour les cellules T Jurkat, utiliser 2 x10 7 cellules / ml. Ces cellules vont répondre à 7 pl de 200 ng / ml SDF-1α dilué dans du RPMI incomplètes, qui ne dispose pas de sérum. Utiliser les médias comme un seul complètes suite négativerol.
- Après les puits sont chargés, voir chaque chambre du tableau avec un microscope inversé afin de s'assurer que tous les puits ont été coupés et correctement remplie. Les cellules doivent être en dans les limites de la limite du puits. Si elles sont considérées à la fois dans les puits, ou se répandent au-delà de la bordure des cellules bien, puis un écart s'est formé en vertu de l'agarose. Notez les puits mal mis en place, comme les données peuvent ne pas être fiable interprété à partir de ces chambres.
6. Collecte des données
- Placer l'électrode dans le porte-matrice et re-connecter les pads d'or sur le réseau d'électrodes sur les broches pogo ressort du titulaire et cliquez sur "setup". Les puits qui sont correctement connectés seront surlignés en vert. Si les puits sont rouges, ils ne sont pas connectés et l'électrode doit être repositionné dans le support de tableau.
- Sélectionnez "8WE1" (8 et 1 électrode) à partir du menu déroulant dans le panneau de logiciels pour indiquer la configuration du réseau.
- Sélectionnez «vérifier» dans le contr le logicielpanneau de ol pour déterminer la résistance initiale et des valeurs de capacité pour chaque puits. Les valeurs de résistance devrait se situer entre 1600 et 2000 ohms, tandis que les valeurs de capacité devrait se situer entre 5 et 6 nanofarads.
- Sélectionnez plusieurs fréquences pour mesurer la résistance à plusieurs fréquences. Il ya un choix de personnalisation de fréquences, ou en utilisant un ensemble de fréquences recommandées. Les standards de multiples paramètres d'acquisition de fréquences de saisir les données à 11 fréquences préréglées (52,5, 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 8.000, 16.000, 32.000 et 64.000 Hz) à un taux de 8 puits par minute. L'intervalle de temps entre les mesures peuvent également être personnalisés. La collecte de données de fréquences multiples permet une analyse de la capacité, l'impédance, et la résistance. Collecte des valeurs de résistance à 4000 Hz est généralement suffisant pour les études de mammifères chimiotactisme des cellules, mais les fréquences supplémentaires peuvent fournir des informations dans d'autres contextes 12,13.
- Durée de l'expérience totale peut être réglé, sur la main droitepanneau, ou l'expérience ne peut être arrêté manuellement, en cliquant sur "Terminer" une fois les cellules ont produit la résistance qui sont indicatifs de l'arrivée à l'électrode. Le temps nécessaire pour que les cellules arrivent à l'électrode dépend du type cellulaire utilisé.
- Cliquez sur "Démarrer" pour lancer la collecte de données.
7. Gestion des données
- Bien que les données peuvent être exportées vers Excel, le logiciel ECIS 1600R, qui accompagne le système ECISθ est la méthode la plus efficace pour analyser les données ECIS / Taxis.
- Les données du logiciel outil d'analyse barre contient les boutons radio Z, R et C. Ces déterminer si l'impédance, la résistance ou la capacité, respectivement, est tracée sur l'axe vertical contre l'axe des x (temps écoulé).
- ECIS / Taxis de données est plus efficace affiché comme la résistance au fil du temps à 4.000 Hz. Les fluctuations rapides de la résistance, ou microtransients (Figure 1), sont la preuve du mouvement cellulaire sur l'électrode. Compiler, obinning r les points de données de sorte que tous les points sont tracés, n'est pas recommandé pour l'ECIS / taxis, car il sera microtransients moyenne sur les données.
- Une fois que le graphique a été réalisé avec le logiciel ECIS1600R, il peut être exporté en choisissant "graphique à l'exportation" dans le menu Fichier, et enregistré au format. Tif ou. Jpg.
8. Les résultats représentatifs
Cellulaire chimiotactisme est indiquée par une augmentation de la résistance à 4.000 Hz. L'arrivée de cellules sur l'électrode cible est également indiqué par l'apparition de fluctuations rapides de la résistance appelés microtransients ou MicroMotion tel que décrit dans Opp et. al., 2009 (Figure 1) 14. Un résultat négatif est indiqué par cohérente, ou une légère diminution, de la résistance à 4000 Hz, comme on le voit en rouge dans la figure 1. L'absence de microtransients est aussi un signe d'une absence de mouvement de la cellule à l'électrode. L'augmentation de la résistance est directement proproportionnelle aux nombre de cellules qui traversent l'électrode 10. L'ajout de l'anticorps monoclonal spécifique d'un facteur chimiotactique ou des toxines connues pour interférer avec les récepteurs couplés aux protéines G peuvent bloquer chimiotactisme 11.
Figure 1. Chimiotactisme des cellules T humaines Jurkat en réponse à SDF1α. Cellules humaines Jurkat T (2,0.10 6 cellules / ml) ont été exposés à un gradient de SDF-1α (à partir de la concentration de 100 ng / ml) ou RPMI 1640 en tant que contrôle négatif. La résistance normalisée à 4000 Hz a été représentée graphiquement. L'homme cellules Jurkat T déplacé en réponse à SDF-1α, comme en témoigne l'augmentation de la résistance et microtransients, alors qu'aucun mouvement n'a été observée avec l'exposition à RPMI 1640.
Figure 2. Vue de dessus un ECIS / taxis Electrode without agarose. Chaque électrode ECIS / Taxis est composé de 8 chambres individuelles. Chaque chambre de partage une grande électrode (a), et contient une électrode de cible individuelle (b). Chaque chambre possède également 2 cercles d'or (c), qui sont utilisés en tant que guide lors de la coupe des puits dans l'agarose avec les canules. Les carrés d'or (d) sont des plots de contact qui se connectent à des broches pogo en vue d'appliquer le courant alternatif à l'électrode. Les électrodes cibles individuelles sont chacun dans le circuit avec l'électrode supérieure compteur (e).
Figure 3. Deux puits sont coupés dans chaque chambre d'agarose-remplie. Lorsque le chimioattractant est ajoutée à un bien qu'elle diffuse pour créer un gradient dans l'agarose, avec la plus grande concentration de chemoattract plus proche de la chimioattractant bien. Les cellules se déplacer sous l'agarose vers des concentrations plus élevées de chimioattractant et peut passer au-dessus de l'électrode cible. Commeles cellules traversent l'électrode cible, soit une augmentation de la résistance est enregistré par le logiciel de l'ECIS 1600R.
Figure 4. Insertion de deux jeunes de 14 canules de calibre en plexiglas. A) A, B 5/64 "foret est utilisé pour affiner l'extrémité de la canule.) Deux trous doivent être forés dans plexiglas pour accueillir les canules de calibre 14 en fonction de la prise de vue mise en page. C) Utiliser une perceuse à colonne pour s'assurer que les trous sont perpendiculaires à la surface pleixglass. D) Deux canules aiguisé sont insérés à travers ¼ "en plexiglas, 2 mm d'intervalle (mesurée à partir des bords intérieurs). Ces canules sont soigneusement aiguisé inséré dans agarose pour couper les puits.
Figure 5. Alignement canules avec des points d'or dans l'ECIS / Taxis chambre. Pour couper les puits, les canules aiguisé doitêtre alignés avec les points d'or flanquantes l'électrode cible sur le fond de la chambre de ECIS / taxis. Le canules doit être inséré verticalement, sans aucun mouvement horizontal, et retiré de la même manière.
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Discussion
De nouvelles caractéristiques de l'essai ECIS / Taxis incluent sa capacité à automatiser la collecte des données en temps réel comme les cellules répondent aux chimiotactique. Bien que l'application la plus courante de cette technologie est de mesurer les réponses cellulaires à des gradients chimiotactiques individuelles, ou à des gradients constitués de mélanges d'agonistes et des antagonistes de chimiotaxie, l'approche ECIS / Taxis est également prête à des variations de ces configurations qui pourraient être très utile dans le l'évaluation de la réactivité cellulaire. Il ya de bonnes preuves que le chevauchement ou les gradients séquentielles peuvent influencer les comportements cellulaires dans de nouvelles façons. En outre, il est probable que ces gradients plus complexes sont la norme in situ 12, 13.
Le dosage ECIS / Les taxis peuvent permettre la modélisation de ces configurations différentes de gradient d'une manière qui ne sont pas possibles avec d'autres technologies. Par exemple, en rajoutant des puits supplémentaires, on peut distribuer l'orientation de la gRadient (s) par rapport à la même cellule et l'électrode cible. Il est également possible de configurer le dosage de placer les cellules dans l'un des puits comme source de facteurs chimiotactiques.
Lorsque la mise en place du test, il est important de maintenir l'hydratation complète du gel qui recouvre la cible et contre-électrodes dans chaque chambre, et de réduire les puits qui ont la relation spatiale correcte de l'électrode cible. En outre, le fond de la cellule doit ainsi être contiguë à la couche mince de liquide qui se forme sous la couche d'agarose; il est dans ce film ce que les cellules se déplace en réponse au gradient sus-jacente. Pour ce faire, il faut aspirer tous les plug agarose sans laisser derrière des fragments de gel. Le retrait de la coupe prise d'agarose par la canule peut créer un tunnel entre les deux puits, ce qui a pour effet de déformer la pente et permettant aux cellules de se déplacer librement à travers l'électrode cible. Il est essentiel que la pression sous vide utilisé pour aspfurieux le bouchon de gel est faible pour éviter de compromettre l'intégrité des puits d'agarose.
Nous avons constaté que les variations dans le pourcentage d'agarose utilisé dans le gel peut différencier des cellules qui expriment les défauts du cytosquelette de cellules de type sauvage, ce qui suggère que cette manipulation peut être utilisé pour interroger les forces que les cellules peuvent exercer sur leur environnement. Si le gel déshydrate pendant la culture, des changements se produiront que l'influence des résultats expérimentaux, y compris une augmentation relative de la rigidité du gel qui ralentirait le mouvement des cellules et une augmentation de la concentration du soluté qui diminuerait l'impédance totale du système.
Le dosage est compatible avec la mesure de circulation par les leucocytes et autres types de cellules qui ne permettent pas la circulation du courant à travers le corps cellulaire. Ce n'est pas une caractéristique universelle de cellules: les cellules nerveuses et des cellules épithéliales (par exemple) pourraient transmettre le courant à travers le corps cellulaire et serait donc produire une résistance beaucoup plus faible précieuxes par cellule individuelle.
Bien que ces approches sont précisément définies pour détecter des réponses cellulaires à des gradients chimiotactiques, il est facile d'imaginer que le dosage de la même applicable aux études portant sur les métastases et les signaux extracellulaires qui améliorent le mouvement des cellules métastatique. En outre, il existe des configurations de réseau supplémentaires qui peuvent être utilisés dans d'autres études sur les interactions cellule-substrat.
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Disclosures
David A Knecht et Michael Un Lynes avoir un brevet délivré pour la technologie ECIS / Taxis, qui comme on l'a autorisé par l'Université du Connecticut à Applied Biophysics, Inc
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions du National Institutes of Health (ES07408 et EB00208).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECIS Zθ | Applied Biophysics | www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS Electrode Array | Applied Biophysics | 8W Chemotaxis | www.biophysics.com/cultureware.php |
| Seakem GTG agarose | BioWhittaker | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH300703 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | Penicillin 5,000 IU/ml; Streptomycin 5 mg/ml |
| HEPES Buffer | MP Biomedicals | 1688449 | 1M solution, cell culture grade |
| 14 Gauge stainless steel Cannula (2) 4 inch | General Supply | 5-8365-1 | Blunt point |
References
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