Summary
L'ECIS / Taxi sistema è un sistema automatico, in tempo reale test che misura chemiotassi cellulari. In questo saggio, cellule si muovono sotto uno strato di agarosio per arrivare ad un elettrodo bersaglio. Movimento cellulare è misurata dalla comparsa di resistenza a 0 corrente alternata.
Abstract
Movimento cellulare in risposta a stimoli esterni è fondamentale per molti processi cellulari compresa la guarigione della ferita, infiammazione e la risposta alle infezioni. Un metodo comune per misurare chemiotassi è il dosaggio camera di Boyden, in cui vengono separate le cellule e chemioattrattore da una membrana porosa. Come cellule migrano attraverso la membrana verso il chemioattraente, aderiscono alla parte inferiore della membrana, o rientrano nei mezzi sottostanti, e vengono successivamente colorate e visivamente contato 1. In questo metodo, le cellule sono esposte a un gradiente ripido e transitoria chemiotattico, che si ritiene essere una rappresentazione povera di gradienti trovano nei tessuti 2.
Un altro sistema di dosaggio, il sotto-agarosio chemiotassi saggio, 3, 4 misure cella movimento su un substrato solido in un film sottile che forma acquosa sotto lo strato di agarosio. Il gradiente che si sviluppa in agarosio è bassa e si ritiene sia un appropriate rappresentazione della natura gradienti. Chemiotassi può essere valutata mediante imaging microscopico della distanza percorsa. Sia il test camera di Boyden e il sotto-agarosio test di solito sono configurati come i saggi degli endpoint.
Il automatizzato ECIS / Taxi sistema combina la sotto-agarosio approccio con impedenza di rilevamento elettrico Cell-substrato (ECIS) 5, 6. In questo saggio, elettrodi bersaglio si trovano in ciascuna delle camere 8. Una grande contro-elettrodo attraversa ciascuna delle camere 8 (Figura 2). Ciascuna camera è piena di agarosio e due pozzetti sono il taglio in agarosio su entrambi i lati dell'elettrodo bersaglio. Un pozzetto viene riempito con la popolazione cellulare di test, mentre l'altra contiene le fonti di chemioattraente diffusione (Figura 3). Corrente passata attraverso il sistema può essere usato per determinare la variazione di resistenza che si verifica come cellule passare l'elettrodo bersaglio. Celle sul bersaglio elettrodoe aumentare la resistenza del sistema 6. Inoltre, rapide fluttuazioni della resistenza rappresentano cambiamenti nelle interazioni delle cellule con la superficie dell'elettrodo e sono indicative di variazioni di forma in corso cellulari. Il ECIS / taxi sistema può misurare il movimento della popolazione cellulare in tempo reale per lunghi periodi di tempo, ma è anche abbastanza sensibile da rilevare l'arrivo di una singola cellula all'elettrodo bersaglio.
Dictyostelium discoidium è noto di migrare in presenza di un gradiente di folato 7, 8 e la sua risposta chemiotattica può essere misurato da ECIS / Taxis 9. Chemiotassi dei leucociti, in risposta a SDF1α e antagonisti di chemiotassi è stata misurata con ECIS / Taxi 10, 11. Un esempio della risposta di leucociti SDF1α è mostrato in Figura 1.
Protocol
1. ECIS / Taxi elettrodi Preparazione
- La superficie d'oro del ECIS / taxi matrice di elettrodi (composto 8 camere per vetrino) viene prima stabilizzato mediante pre-trattamento con sterile cisteina 10 mM in acqua deionizzata (dH 2 O) per 15 min a temperatura ambiente in condizioni sterili.
- Aspirare la soluzione cisteina da ciascuna camera di elettrodo, risciacquare 3 volte con sterile dH 2 O, e sostituirlo con 250 pl di mezzo completo (RPMI 1640, FBS 10%, 25 mM di tampone HEPES).
- Collegare la matrice di elettrodi a contatto pin sul possessore dello strumento matrice per eseguire il controllo elettrodo.
- Chambers che sono collegati correttamente sarà evidenziato in verde sullo schermo del computer. Se i contenitori sono evidenziati in rosso, non sono collegati e l'elettrodo deve essere riposizionato nel supporto matrice di stabilire contatti per tutte le camere.
- Una volta che tutte le camere sono collegati, fare clic sul pulsante "check" nel software di controllo per scoraggiareminare la resistenza iniziale e valori di capacità per ogni camera. I valori della resistenza deve essere compresa tra 1600 e 2000 ohm, e valori di capacità deve essere compresa tra 5 e 6 nanofarads per una matrice 8 camera. Se una camera non è all'interno di questi parametri accettabili, la camera individuo non deve essere utilizzato per raccogliere dati.
- Scollegare l'elettrodo dal titolare array per preparare le singole camere agarosio. Aspirare il terreno dalle camere e lavare ogni camera 3 volte con sterile dH 2 O.
2. Preparazione Agarose Chambers
- In un tubo di polipropilene sterile 15 ml conica, misura 0,03 g di Seakem GTG agarosio e aggiungere 1 ml di PBS sterile. Rimettere il tappo del tubo in modo impreciso, e sciogliere l'agarosio in autoclave per un ciclo di 2 min liquido (fusione in un forno a microonde non è efficace per questo test). Questo breve periodo di tempo non si scioglierà il tubo conico. Per le celle meno esigenti che non richiedono siero per la cultura, (ad esempio Dictyostelium discoideum) 0,5%agarosio può essere fatto nel mezzo appropriato e fusi in un forno a microonde. L'autoclave è necessaria per le celle che richiedono siero, come sarà denaturato se fuso in forno a microonde.
- Aggiungere 5 ml di mezzo RPMI completo riscaldato in un bagno di acqua (55 ° -60 ° C) direttamente al agarosio caldo, ad una concentrazione finale di 0,5% agarosio e pipettare su e giù delicatamente per miscelare.
- Pipettare 300 pl di mezzo fuso agarosio in ciascuna camera, sostituire le ECIS / matrice copertura taxi e permettono di gel a temperatura ambiente.
- Pipettare rimanente agarosio nel tappo della provetta 15 ml di valutare gelificazione agarosio. Questo eccesso di agarosio sarà utilizzato anche in parte 4: Taglio di pozzi in agarosio.
3. Costruzione e affilatura la cannula strumento Well taglio
- Contrasta due cannule 14 estremità smussata calibro, con un "5/64 bit. Ruotare la punta del trapano in ciascuna apertura cannula con un trapano a bassa velocità, rendendo certa la punta taglia tutta bordo interno di ogni op cannulazare per formare un bordo tagliente (Figura 4A).
- Praticare due fori attraverso i 1 "x 2" x "in plexiglass (Figura 4B-D) con un 5/64" ¼ bit in un trapano a colonna. Inserire ogni affilato cannula calibro 14 in modo che sporga una distanza uguale in ogni foro plexiglass.
4. Taglio Wells in agarosio
- Sterilizzare il 14 cannule di calibro con una leggera fiammeggianti le punte. Prima di taglio pozzetti nella camera ECIS, permettono la cannule raffreddare a temperatura ambiente, o raffreddare le cannule toccando l'agarosio nel tappo del tubo 15 ml. Se la temperatura della cannula è troppo elevata, l'agarosio si scioglierà come i pozzetti camera sono tagliate, rendendo i pozzetti deformi e difettoso.
- Allineare la coppia cannula sopra i due punti d'oro che circondano l'elettrodo bersaglio in ciascuna camera (figura 2c e 5). Inserire la cannula verticalmente, senza alcun movimento orizzontale, fermandosi al contatto tra la cannula dolce ela superficie dell'elettrodo. Rimuovere con cautela la cannula, ancora una volta senza alcun movimento orizzontale. Posizionamento dei pozzi aggiuntivi per opporsi gradienti è possibile anche con una riconfigurazione del jig cannula.
- Aspirare delicatamente il tappo di agarosio lasciato dalla cannula, con una sterile 9 "pipetta Pasteur, collegato alla bassa pressione di vuoto, con una trappola a vuoto cattura dei rifiuti agarosio.
- Aggiungere 300 pl di mezzi completi RPMI alla superficie di ciascuna camera a 37 ° C, per 2 min per saturare la agarosio, e quindi delicatamente aspirare il supporto dalla superficie ed i pozzetti senza disturbare l'agarosio.
5. Caricamento del Wells
- Ogni bene è in grado di contenere un volume di 7 pl. Per un pozzetto in ogni camera, si aggiungono 7 microlitri di sospensione di cellule. Per cellule T Jurkat, utilizzare 2 x10 7 cellule / ml. Queste cellule risponderà a 7 microlitri di 200 ng / ml SDF-1α diluito in RPMI incompleto, che manca di siero. Utilizzare mezzi completi da solo come un cont negativorol.
- Dopo che i pozzetti vengono caricati, visualizzare ogni camera della matrice con un microscopio invertito per garantire che tutti i pozzetti sono stati tagliati e riempito correttamente. Le cellule devono essere entro i confini del confine del pozzo. Se si sono visti in entrambi i pozzetti, o si stanno diffondendo al di là delle frontiere delle cellule e, quindi un divario si è formato sotto l'agarosio. Nota: i pozzi impropriamente istituiti, in quanto i dati non possono essere interpretati in modo affidabile da quelle camere.
6. Raccolta dei dati
- Posizionare l'elettrodo nel supporto matrice e ri-collegare gli elettrodi d'oro sulla matrice di elettrodi ai molla pogo pin del titolare e fare clic su "setup". I pozzi che sono stati collegati correttamente sarà evidenziato in verde. Se i pozzetti sono rossi, essi non sono collegati e l'elettrodo deve essere riposizionato nel supporto matrice.
- Selezionare "8WE1" (8 e 1 elettrodo) dal menu a tendina nel pannello software per indicare la configurazione dell'array.
- Selezionare "Controlla" nel software contrpannello olo per determinare la resistenza iniziale e valori di capacità per ciascun pozzetto. I valori di resistenza deve essere compresa tra 1600 e 2000 ohm, mentre i valori di capacità dovrebbero essere tra 5 e 6 nanofarads.
- Selezionare più frequenze per misurare la resistenza a diverse frequenze. Vi è una scelta di personalizzazione frequenze, o utilizzando un set di frequenze raccomandate. Le impostazioni standard, più frequenza di acquisizione acquisire i dati a 11 frequenze preimpostate (52,5, 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 8.000, 16.000, 32.000 e 64.000 Hz) ad una velocità di 8 pozzetti / min. L'intervallo di tempo tra le misurazioni possono anche essere personalizzati. La raccolta di dati di frequenza più consente di analizzare capacità, impedenza, e resistenza. Raccogliere valori di resistenza a 4.000 Hz è in genere sufficiente per gli studi chemiotassi di cellule di mammifero, ma le frequenze aggiuntive possono fornire informazioni in altri contesti 12,13.
- Durata dell'esperimento totale può essere impostata, sulla destrapannello o l'esperimento può essere fermato manualmente, facendo clic su "finish" una volta che le cellule hanno prodotto la resistenza che sono indicativi di arrivo dell'elettrodo. Il tempo necessario per le cellule per arrivare al elettrodo dipende dal tipo cellulare utilizzato.
- Fare clic su "Start" per avviare la raccolta dei dati.
7. Data Management
- Anche se i dati possono essere esportati in Excel, il software ECIS 1600R, che accompagna il sistema ECISθ è il metodo più efficiente per analizzare i dati di ECIS / Taxi.
- I dati del software di analisi barra degli strumenti contiene i pulsanti di opzione Z, R, e C. Si tratta di stabilire se l'impedenza, la resistenza, o di capacità, rispettivamente, viene tracciata sull'asse verticale contro l'asse x (tempo trascorso).
- ECIS / Taxi dati vengono visualizzati come più efficace resistenza nel tempo a 4.000 Hz. Rapide fluttuazioni resistenza, o microtransients (Figura 1), sono prove di movimento cellulare sull'elettrodo. Compilazione, obinning r i punti dati in modo che non tutti i punti sono rappresentati graficamente, non è raccomandato per ECIS / Taxi, dato che microtransients media fuori dei dati.
- Una volta che il grafico è stato realizzato con il software ECIS1600R, può essere esportato scegliendo "grafico export" dal menu file e salvato come. Tif o. File jpg.
8. Risultati rappresentativi
Chemiotassi cellulare è indicata da un aumento della resistenza a 4.000 Hz. L'arrivo di celle sul elettrodo bersaglio è anche indicata dalla comparsa di rapide fluttuazioni resistenza chiamati microtransients o micromovimento come descritto in Opp et. al., 2009 (Figura 1) 14. Un risultato negativo è indicato da costante, o una leggera diminuzione, in resistenza a 4.000 Hz, come visto in rosso in figura 1. L'assenza di microtransients è anche un segno di un'assenza di movimento delle cellule all'elettrodo. L'aumento della resistenza è direttamente proporzionaleproporzionale al numero di celle che attraversano l'elettrodo 10. L'aggiunta di anticorpo monoclonale specifico per un fattore chemiotattico o tossine conosciute per interferire con i recettori accoppiati a proteina G può bloccare chemiotassi 11.
Figura 1. La chemiotassi di cellule Jurkat T umane in risposta a SDF1α. Umane cellule T Jurkat (2.0x10 6 cellule / ml) sono stati esposti a un gradiente di SDF-1α (concentrazione iniziale 100 ng / ml) o RPMI 1640 come controllo negativo. La resistenza normalizzata a 4000 Hz è stata rappresentata graficamente. Umane cellule T Jurkat spostata in risposta a SDF-1α, come dimostra l'aumento di resistenza e microtransients, mentre nessun movimento è stato visto con esposizione a RPMI 1640.
Figura 2. Vista dall'alto di un ECIS / Taxi elettrodi without agarosio. Ogni ECIS / taxi elettrodo è composto da 8 camere singole. Ogni camera condivide un elettrodo grande (a), e contiene un singolo elettrodo bersaglio (b). Ogni camera ha anche 2 cerchi oro (c), che sono utilizzati come guida per il taglio dei pozzetti nel agarosio con le cannule. I quadrati oro (d) sono le piazzole di contatto che si collegano ai perni pogo per applicare la corrente AC all'elettrodo. Gli elettrodi target individuali sono ciascuno in circuito con controelettrodo maggiore (e).
Figura 3. Due pozzetti sono tagliati in ciascuna camera di agarosio-riempita. Quando il chemioattraente è aggiunto a un pozzetto si diffonde per creare un gradiente di agarosio, con la maggiore concentrazione di chemoattract più vicino al chemioattrattore bene. Le cellule viaggiano sotto l'agarosio verso alte concentrazioni di chemioattraente e può passare sopra l'elettrodo di destinazione. Comele cellule attraversano l'elettrodo di destinazione, un aumento di resistenza è registrato dal software ECIS 1600R.
Figura 4. Inserimento di due cannule calibro 14 in plexiglass. A) A 5/64 "punta viene usato per affilare la punta della cannula. B) Due fori devono essere praticati in plexiglass per ospitare il 14 cannule calibro secondo il colpo layout. C) Utilizzare un trapano a colonna per garantire che i fori sono perpendicolari alla superficie pleixglass. D) due cannule affilato vengono inseriti attraverso ¼ "in plexiglass, 2 mm di distanza (misurata dai bordi interni). Queste cannule vengono accuratamente affilati inseriti agarosio per tagliare i pozzi.
Figura 5. Allineamento cannule con punti d'oro in ECIS / Taxi da camera. Per tagliare i pozzi, le cannule affilata deveessere allineati con i punti d'oro che fiancheggiano l'elettrodo bersaglio sul fondo della ECIS / Taxis camera. La cannula deve essere inseriti verticalmente, senza alcun movimento orizzontale, e rimosso allo stesso modo.
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Discussion
Caratteristiche innovative della ECIS / Taxi test includono la capacità di automatizzare la raccolta dei dati in tempo reale, come le cellule rispondono a chemoattractant. Mentre l'applicazione più comune di questa tecnologia è quello di misurare le risposte cellulari a gradienti chemiotattici individuali, o per gradienti costituiti da miscele di agonisti e antagonisti chemiotassi, la ECIS / Taxi approccio è anche soggetto a variazioni a queste configurazioni che possono essere molto utile nella valutazione della risposta cellulare. Ci sono buone evidenze che si sovrappongono o gradienti sequenziali possono influenzare il comportamento dei cellulari in modi nuovi. Inoltre, è probabile che questi gradienti più complessi sono la norma in situ 12, 13.
L'ECIS / Taxi dosaggio può consentire la modellazione di queste configurazioni gradiente diverse in modi che non sono possibili con altre tecnologie. Per esempio, aggiungendo ulteriori pozzi, si può distribuire l'orientamento della gradiosa (s) in relazione alla ben cellula bersaglio e l'elettrodo. È anche possibile configurare il saggio di inserire cellule in uno dei pozzetti come fonte di fattori chemiotattici.
Quando si imposta il saggio, è importante mantenere la completa idratazione del gel che si sovrappone il bersaglio e elettrodi contatore in ciascuna camera, e di tagliare pozzetti che hanno il corretto rapporto spaziale all'elettrodo bersaglio. Inoltre, il fondo della cella deve anche essere contiguo con il film sottile di liquido che forma il secondo strato di agarosio, è in questo film che le cellule si muovono in risposta al gradiente sovrastante. Per fare questo, si deve aspirare tutti i plug agarosio senza lasciare frammenti di gel alle spalle. La rimozione del taglio spina agarosio dalla cannula può creare un tunnel tra i due pozzetti, che ha l'effetto di deformare la sfumatura e consentendo alle cellule di muoversi liberamente attraverso l'elettrodo di destinazione. E 'fondamentale che la pressione di vuoto utilizzato per aspirate la spina gel è basso per non compromettere l'integrità e agarosio.
Abbiamo trovato che le variazioni della percentuale di agarosio utilizzato nel gel può differenziare le cellule che esprimono i difetti citoscheletrici da cellule di tipo selvatico, suggerendo che questa manipolazione può essere utilizzato per interrogare le forze che le cellule possono esercitare sul loro ambiente. Se il gel disidrata durante la coltura, cambiamenti si verificheranno che influenza i risultati sperimentali, inclusi un relativo aumento della rigidità gel che rallentare il movimento delle cellule e un aumento della concentrazione di soluto che diminuirebbe impedenza totale del sistema.
Il saggio è compatibile con la misurazione del movimento da leucociti e altri tipi di cellule che non permettono il flusso di corrente attraverso il corpo cellulare. Questa non è una caratteristica universale di cellule: cellule nervose ed alcune cellule epiteliali (per esempio) può trasmettere una corrente attraverso il corpo cellulare e sarebbe quindi produrre molto minore resistenza Values ogni singola cella.
Mentre questi approcci sono specificamente definiti per rilevare risposte cellulari a gradienti chemiotattici, è facile immaginare il dosaggio come analogamente applicabile a studi riguardanti metastasi ed i segnali extracellulari che aumentano movimento metastatica delle cellule. Inoltre, ci sono configurazioni di array aggiuntivi che possono essere utilizzati in altre cellula-substrato studi di interazione.
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Disclosures
David A Knecht e Michael A Lynes avere un brevetto rilasciato per la ECIS / Taxi tecnologia, che, come è stato autorizzato dalla University of Connecticut di Biofisica Applicata, Inc.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni da parte del National Institutes of Health (ES07408 e EB00208).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECIS Zθ | Applied Biophysics | www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS Electrode Array | Applied Biophysics | 8W Chemotaxis | www.biophysics.com/cultureware.php |
| Seakem GTG agarose | BioWhittaker | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH300703 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | Penicillin 5,000 IU/ml; Streptomycin 5 mg/ml |
| HEPES Buffer | MP Biomedicals | 1688449 | 1M solution, cell culture grade |
| 14 Gauge stainless steel Cannula (2) 4 inch | General Supply | 5-8365-1 | Blunt point |
References
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