Summary
ECIS /タクシーシステムは、細胞走化性を測定する自動化された、リアルタイムのアッセイである。このアッセイにおいて、細胞は、ターゲット電極に到達するためにアガロースの層の下に移動します。携帯電話の動きはAC電流0〜抵抗の発症によって測定されます。
Abstract
外部刺激に応答して細胞の動きは、創傷治癒、炎症や感染症への対応を含む多くの細胞プロセスの基本である。走化性を測定するための一般的な方法は、細胞と化学誘引物質が多孔質膜で区切られたボイデンチャンバーアッセイである。細胞が走化性因子に向かって膜を介して移行するように、彼らは、膜の底面に付着し、または基礎となるメディアに分類され、その後、染色し、視覚的に1カウントされます。この方法では、細胞組織2で見つけた勾配の貧しい表現であると考えられている急と一時的な走化性勾配にさらされている。
別のアッセイ系、下のアガロース走化性アッセイ、3、アガロース層を形成し、薄い水性膜の固体基板全体の4小節の細胞運動。アガロースに発症勾配が浅く、アプリであると考えられている自然勾配を発生するの表現をropriate。走化性は、走行距離の顕微鏡イメージングにより評価することができる。 Boydenチャンバーアッセイと下のアガロースアッセイの両方は、通常、エンドポイントアッセイとして設定されています。
自動化された留学生センター/タクシーシステムは、電気細胞-基質インピーダンスセンシング（ECIS）5、6アンダーアガロースのアプローチを組み合わせたものです。このアッセイでは、ターゲット電極は、8室の各々に配置されています。大対向電極は、8室（ 図2）のそれぞれを介して実行されます。各チャンバは、アガロースを充填し、二つの小さな井戸は、ターゲット電極の両側にアガロースにカットされています。他の拡散誘引物質の発生源（ 図3）を保持しながら、一つはよく、試験細胞集団で満たされている。システムを通過する電流は、細胞がターゲット電極を通過として発生する抵抗値の変化を決定するために使用することができます。ターゲット上の細胞はelectrod電子システム6の抵抗を増加させる。さらに、抵抗の急激な変動は、電極表面と細胞の相互作用の変化を表しており、継続的な細胞の形状変化を示すものである。 ECIS /タクシーシステムは、長期間にわたって、リアルタイムで細胞集団の動きを測定するだけでなく、ターゲット電極で単一のセルの到着を検出するのに十分な感度であることができます。
細胞性粘菌discoidiumは、葉酸勾配7、8の存在下で移行することが知られており、その走化性応答が正確に留学生センター/タクシー9によって測定することができます。白血球走化性は、SDF1αへと走化性拮抗薬への応答にも留学生センター/タクシー10、11で測定されています。 SDF1αへの白血球の応答の例を図1に示されています。
Protocol
1。 ECIS /タクシー電極の調製
- ECIS /タクシー電極アレイ（スライドあたり8室から成る）の金表面は、最初の無菌条件下で室温で15分間脱イオン水（のdH 2 O）中の滅菌10mMのシステインによる前処理によって安定化されています。
- 各電極室からシステイン溶液を吸引し、無菌のdH 2 Oで3回リンスし、完全培地250μlの（RPMI1640、10％FBS、25mMのHEPES緩衝液）に置き換えます。
- 電極チェックを実行するために楽器の配列ホルダーのピンを接触する電極アレイを接続します。
- 正しく接続されているチャンバーは、コンピュータの画面上に緑色で強調表示されます。チャンバーは赤で強調表示されている場合は、それらが接続されていないと電極がすべてのチャンバーの連絡先を確立するために配列ホルダーに再配置する必要があります。
- すべてのチャンバが接続されたら、阻止するためのソフトウェアのコントローラで "チェック"ボタンをクリックしてください各チャンバの初期抵抗値と容量値を採掘。抵抗値は1600〜2000オームである必要があり、容量値は、8室配列の5〜6ナノファラッドでなければなりません。室は、これらの許容パラメータの範囲内にない場合は、個々のチャンバーは、データを収集するために使用すべきではありません。
- 個々のアガロース室を準備するために配列ホルダーから電極を外します。チャンバーから培地を吸引除去し、無菌のdH 2 Oで、それぞれの室を3回洗浄
2。アガロースチェンバースの準備
- Seakem GTGアガロースの滅菌15 mlのポリプロピレンコニカルチューブ、測定0.03グラムで、1 mlの滅菌PBSを追加します。大まかにチューブのキャップを交換し、（電子レンジで融解がこのアッセイのために有効ではありません）2分液体サイクルのオートクレーブ中でアガロースを溶かす。この短い時間では、コニカルチューブを溶かすことはありません。培養のための血清を必要としない以下の気難しい細胞（例えば、 キイロタマホコリカビ ）0.5％アガロースは、適切な培地中で行われ、電子レンジで溶融させることができる。電子レンジで溶かした場合、これは変性されるように、オートクレーブは、血清が必要な細胞が必要です。
- 水浴（55℃-60℃）を直接、熱いアガロースに穏やかに混合するための上下0.5％アガロースとピペットの最終濃度に温め完全RPMI培地5mlを追加します。
- 各チャンバーに溶かしたアガロース培地のピペットで300μlのは、留学生センター/タクシー配列のカバーを交換し、室温でゲル化することができます。
- アガロースゲルを評価するために、15 mlのチューブのキャップにアガロースを残りのピペット。この過剰なアガロースは、パート4にも使用されます。アガロースに井戸を切断。
3。カニューレも切削工具を構築し、シャープ
- 5/64 "ビットを使用して、2つの14ゲージの平滑末端カニューレを強めています。ドリルビットは、各カニューレオペアンプの内部全体エッジをカットし、特定の製造、低速ドリルで各カニューレ開口部にドリルビットの先端を回転させる鋭い切れ刃（ 図4A）を形成するening。
- ドリルプレスのビット1 "×2"×¼ "5/64プレキシガラス（ 図4B-D）"を介して2つの穴を開けます。それはそれぞれのプレキシガラスの穴から等しい距離を突出するように、各シャープ14ゲージのカニューレを挿入します。
4。アガロースにウェルズを切断
- 軽くヒントを炎で14ゲージのカニューレを殺菌。前のECISチャンバー内に井戸を切断し、カニューレを室温まで冷却し、15 mlチューブのキャップにアガロースをタッチしてカニューレを冷却することができます。カニューレの温度が高すぎるとチャンバーのウェルが切断されると、アガロースは、不格好な、欠陥の井戸をレンダリングし、溶けてしまいます。
- 各チャンバー内のターゲット電極（ 図2cおよび5）を囲む2つの金のドットの上にカニューレペアの位置を合わせます。カニューレとの間に穏やかな接触時に停止し、任意の水平移動することなく、カニューレを垂直に挿入電極表面。慎重に、任意の水平移動せずに再度、カニューレを削除します。グラデーションに反対するための追加の井戸の配置は、カニューレ治具の再構成でも可能です。
- 静かにアガロース廃棄物をキャッチし、真空トラップを低真空圧に接続されている無菌9 "パスツールピペットを使用して、カニューレによって残されたアガロースプラグを吸引除去する。
- アガロースを飽和させるために2分間、37℃で各チャンバーの表面°Cに完全RPMI培地300μlを追加して、静かにアガロースを乱すことなく、表面、ウェルから培地を吸引除去する。
5。ウェルズのロード
- 各ウェルは7μlのボリュームを保持できます。各チャンバー内の1つのウェルに、細胞懸濁液7μlを追加します。 Jurkat T細胞は、2×10 7細胞/ mlを使用しています。これらの細胞は、血清欠けている不完全なRPMIで希釈し、200 ng / mlのSDF-1αの7μlに対応させていただきます。負の続きとして単独で完全なメディアを使用してROL。
- 井戸がロードされた後、全てのウェルが適切にカットし、満たされたことを確認するために倒立顕微鏡で配列の各チャンバーを表示します。細胞はよくの境界の範囲内でなければなりません。彼らは井戸の両方で見られている、またはセルだけでなく国境を越えて広がっている場合は、そのギャップはアガロースの下で形成されています。データは確実にそれらのチャンバーから解釈することはできませんので、不適切な設定の井戸に注意してください。
6。データ収集
- 配列ホルダーに電極を配置して、ホルダーのバネ付きのポゴ·ピンに電極アレイ上の金パッドを再接続し、 "セットアップ"をクリックしてください。正しく接続されている井戸は、緑色で強調表示されます。井戸が赤になっている場合、それらが接続されていないと電極が配列ホルダーに再配置する必要があります。
- アレイ構成を示すために、ソフトウェアのパネルのドロップダウンメニューから "8WE1"（8ウェル1電極）を選択します。
- ソフトウェアCONTRに "チェック"を選択します。各ウェルの初期抵抗値と容量値を決定するオールパネル。静電容量値が5〜6ナノファラッドである必要がありますが抵抗値は、1600〜2000オームでなければなりません。
- いくつかの周波数での抵抗を測定するために、複数の周波数を選択します。周波数をカスタマイズ、または推奨される周波数のセットを使用しての選択があります。標準的な複数の周波数の取得設定は、8ウェル/分の速度で（52.5、125、250、500、1,000、2,000、4,000、8,000、16,000、32,000と64,000 Hzの）11あらかじめ設定した周波数でデータをキャプチャします。測定間の時間間隔はカスタマイズすることもできます。複数の周波数データを収集すると、静電容量、インピーダンス、抵抗の分析が可能になります。 4000 Hzでの抵抗値を収集すると、哺乳動物細胞の走化性研究のために通常は十分ですが、追加の周波数が他のコンテキスト12,13に情報を提供することがあります。
- 合計テスト期間は、右手に、設定することができますパネル、または実験は、細胞が電極に到着の指標である抵抗を作り出した後、 "Finish"をクリックして、手動で停止することができます。細胞が電極に到達するのにかかる時間は、使用する細胞の種類によって異なります。
- データ収集を開始する "スタート"をクリックします。
7。データ管理
- データはExcelにエクスポートすることもできますが、ECISθシステムに付属のECIS 1600Rソフトウェアは、留学生センター/タクシーデータを分析するための最も効率的な方法です。
- ソフトウェアのデータ解析ツール·バー、ラジオボタンが含まれているZ、R、Cのこれらは、それぞれのインピーダンス、抵抗、容量かどうかを判断するには、x軸（経過時間）に対する縦軸にプロットされます。
- ECIS /タクシーのデータが最も効率的に4000 Hzで時間をかけて抵抗として表示されます。急激な抵抗の変動、またはmicrotransients（ 図1）は 、電極上の細胞の移動の証拠である。 oが、コンパイルそれはデータのmicrotransientsを平均化するので、rのビニングていないすべての点がグラフ化されるように、データポイントは、留学生センター/タクシーはお勧めしません。
- グラフはECIS1600Rソフトウェアを使用して行われていると、それは、ファイルメニューから "グラフのエクスポート"を選択してエクスポートします。tifファイルまたは。jpgファイルとして保存することができます。
8。代表的な結果
細胞走化性は、4,000 Hzの抵抗の増加によって示されます。ターゲット電極上の細胞の到着にもオップらに記載されmicrotransients、または微動と呼ばれる抵抗の急激な変動の出現によって示されます。ら 、2009（ 図1）14。陰性の結果が一貫性のある、または、 図1に赤で見られる4000 Hzの抵抗がわずかに減少し、で示されています。 microtransientsの欠如はまた、電極に細胞運動の不在の印である。抵抗の増加は、直接プロです。電極10を横断するセル数に比例します。 Gタンパク質共役受容体は走化性11をブロックすることができますに干渉することが知られている化学誘引物質または毒素に特異的なモノクローナル抗体の添加。
図1。 SDF1αへの応答におけるヒトJurkat T細胞の走化性。ヒトJurkat T細胞（2.0x10 6細胞/ ml）をネガティブコントロールとしてSDF-1αの勾配にさらされる（濃度100 ng / mlの開始）またはRPMI 1640されました。 4000 Hzの正規化された抵抗は、グラフにしました。抵抗とmicrotransientsの増加によって証明されるようには動きはRPMI 1640への暴露でみられなかったヒトJurkat T細胞は、SDF-1αに応答して移動した。
図2。 ECIS /タクシーのトップビューには、withou、電極tは、アガロース、各留学生センター/タクシー電極は、8個のチャンバーで構成されています。各チャンバは、大きな電極（）を共有し、個々のターゲット電極（B）が含まれています。各チャンバには、カニューレとアガロースのウェルを切り出す際のガイドとして使用されている2ゴールドサークル（c）を、持っています。金の正方形（d）は電極に交流電流を適用するためにポゴ·ピンに接続する接触パッドです。個々のターゲット電極は大きなカウンター電極（e）の各回路である。
図3。二つのウェルズは、各アガロース充填室にカットされています。化学誘引物質が1つに追加された場合もそれはよく誘引物質に最も近い化学的に誘引するの最高濃度で、アガロースのグラデーションを作成する拡散。細胞は、化学誘引物質の高濃度に向かってアガロースの下に移動するとターゲット電極上に渡すことができます。として細胞は、ターゲット電極を渡り、抵抗の増加はECIS 1600Rソフトウェアによって記録されています。
図4。プレキシガラスに2つの14ゲージのカニューレを挿入する。 A）5/64 "ドリルビットは、カニューレの先端をシャープにするために使用されます。B）二つの穴が、レイアウトショットによると14ゲージのカニューレを収容するためにプレキシガラスに掘削する必要があります。C）の穴を確保するためにドリルプレスを使用して垂直であるpleixglass面。D）への2つの尖ったカニューレは、¼ "プレキシガラス、離れて2ミリメートル（内側のエッジから測定）を介して挿入されます。これらの尖ったカニューレは、慎重に井戸を切るためにアガロースに挿入されます。
図5。 ECIS /タクシーチャンバー内の金ドットでカニューレを合わせます。ウェルをカットするには、尖ったカニューレはそうしなければなりませんECIS /タクシーチャンバーの底部にターゲット電極に隣接する金のドットと整列することができます。カニューレは、任意の水平移動することなく、垂直に挿入し、同じ方法で削除する必要があります。
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Discussion
ECIS /タクシーアッセイの小説の特性は、細胞が走化性因子に応答するようにリアルタイムデータの収集を自動化する能力が含まれています。この技術の最もありふれたアプリケーションは、個々の走化性勾配に、または走化性のアゴニストおよびアンタゴニストの混合物から成る勾配に対する細胞応答を測定することですが、留学生センター/タクシーのアプローチはまたで非常に有用である可能性があり、これらの構成に変動の影響を受けやすいです。細胞応答性の評価。重複または連続したグラデーションが斬新な方法で細胞の行動に影響を与えることができる十分な証拠があります。また、これらのより複雑なグラデーションが現場 12、13 のノルムている可能性があります。
ECIS /タクシーアッセイは、他の技術では不可能な方法でこれらの異なる勾配の構成のモデル化を有効にすることができます。たとえば、追加の井戸を追加することによって、人はgの向きを配布することができますよくセルとターゲット電極との関係でradient（秒）。それは、走化性因子の供給源としての井戸のいずれかにセルを配置するためのアッセイを設定することも可能です。
アッセイをセットアップするときには、各チャンバー内にターゲットと対向電極をオーバーレイゲルの完全な水和を維持するために、ターゲット電極に適切な空間的な関係を持っている井戸をカットすることが重要です。また、セルの下部には、よくアガロース層を形成し、液体の薄膜と連続する必要がある、それは細胞が覆っている勾配に応答して移動するということは、この映画である。これを行うためには、背後にゲル断片を離れることなく、アガロースプラグのすべてを吸引除去しなければなりません。カニューレにより切断、アガロースプラグの除去は、グラデーションを変形し、細胞がターゲット電極の間に自由に移動できるようにする効果を持つ2つの井戸間のトンネルを作成することができます。それは真空圧力はaspするために使用されることが重要ですゲルプラグはアガロースうまく整合性を損なうことを避けるために低く、激怒。
我々は、ゲルに使用されるアガロースの割合の変化は、この操作は細胞がその環境に及ぼすことができる力を尋問するために使用することができていることを示唆し、野生型細胞から骨格欠陥を発現する細胞を区別できることを見出した。ゲルは培養中に脱水されていれば、変更はその影響の細胞運動と総システム·インピーダンスを減少させる溶質濃度の増加が遅くなるゲル剛性の相対的な増加を含む実験結果を、発生します。
アッセイは、白血球と細胞体を流れる電流を許可していない他の細胞型によって運動の測定と互換性があります。これは、細胞の普遍的な特徴ではありません。神経細胞および一部の上皮細胞は（例えば）細胞体を流れる電流を送ることができ、これまで低抵抗VALUを生成するでしょう個々のセルごとにES。
これらのアプローチは、特に走勾配に対する細胞応答を検出するために定義されていますが、それは転移と転移性細胞の動きを強化する細胞外シグナルを含む研究と同様に適用されるようにアッセイを想像するのは簡単です。また、他の細胞 - 基質相互作用の研究に使用できる追加のアレイ構成があります。
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Disclosures
デビッド·クネヒト、マイケル·Lynesは、応用物理学、Inc。にコネチカット大学にライセンス供与されECIS /タクシーテクノロジの発行された特許を持っている
Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所（ES07408とEB00208）からの補助金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECIS Zθ | Applied Biophysics | www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS Electrode Array | Applied Biophysics | 8W Chemotaxis | www.biophysics.com/cultureware.php |
| Seakem GTG agarose | BioWhittaker | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH300703 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | Penicillin 5,000 IU/ml; Streptomycin 5 mg/ml |
| HEPES Buffer | MP Biomedicals | 1688449 | 1M solution, cell culture grade |
| 14 Gauge stainless steel Cannula (2) 4 inch | General Supply | 5-8365-1 | Blunt point |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays. Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).
- Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay. J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).
- Keese, C. G. I. A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).
- Laevsky, G., Knecht, D. A. Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments. J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).
- Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion. 11, 5-6 (1990).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).
- Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis. J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).
- Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury. J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).
- Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers. J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).
- Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity. Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).
- Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation. J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).
