Summary
ECIS / Taksiler sistemi hücresel kemotaksis ölçer otomatik, gerçek zamanlı bir testtir. Bu deneyde, bir hedef hücreler elektrot varmak için agaroz bir katmanı altındaki hareket eder. Hücresel hareketi AC akım 0 direnç başlangıcı ile ölçülür.
Abstract
Dış uyaranlara yanıt Hücresel hareket yara iyileşmesi, enflamasyon ve enfeksiyona yanıt dahil, birçok hücresel süreçleri için esastır. Kemotaksi ölçmek için ortak bir yöntem hücreleri ve kemoatraktan bir gözenekli zar ile ayrılmış edildiği Boyden haznesi assay vardır. Hücreleri kemoatraktan doğru zarından göç gibi, onlar membran veya temel ortamı içine düşme alt uymak ve daha sonra boyandı ve görsel 1 sayılır. Bu yöntemde, hücreler dokuları 2'de bulunan geçişlerini kötü bir temsil olduğu düşünülmektedir dik ve geçici kemoatraktan degrade, maruz kalmaktadır.
Başka bir deney sisteminde, altında-agaroz kemotaksi deneyi, 3, agaroz tabakasının altında oluşturan bir sulu ince film bir alt tabaka arasında bir katı 4 önlemleri hücre hareketi. Agaroz gelişir degrade sığ ve bir uygulama olduğu düşünülmektedirdoğal eğimleri meydana gelen temsili uygun olur. Kemotaksis katedilen mesafe mikroskopik görüntüleme ile değerlendirilebilir. Boyden çemberinin tahlil ve altı agaroz testi genellikle iki nokta deneyleri olarak yapılandırılır.
Otomatik ECIS / Taksiler sistemi Elektrik Hücre-substrat Empedans Algılama (ECIS) 5, 6 altı agaroz yaklaşımı birleştirir. Bu deneyde, hedef elektrotlar 8 odalarına her yer alır. Büyük bir karşı-elektrot 8 odalarına (Şekil 2) her biri aracılığıyla çalışır. Her bir odacık agaroz ile doldurulur ve iki küçük kuyu hedef elektrot her iki tarafında da agaroz kesilmiş olan edilir. Diğer difüzyon kemoatraktan kaynakları (Şekil 3) tutarken biri de, test hücre popülasyonu ile doludur. Sistem geçirilir Mevcut hücreleri hedef elektrot üzerine çıkması olarak ortaya çıkar direnç değişim belirlemek için kullanılabilir. Hedef Hücreler elektrodlarıe sistemi 6 direncini artırır. Buna ek olarak, dalgalanma direnci hızlı elektrot yüzey ile hücre etkileşim içinde değişikliklerin temsil eden ve hücresel şekil değişikliği işaret etmektedir. ECIS / Taksiler sistemi uzun süre üzerinden gerçek zamanlı olarak hücre popülasyonunun hareketini ölçmek değil, aynı zamanda hedef elektrot tek bir hücrenin varış algılayacak kadar duyarlıdır.
Dictyostelium discoidium bir folat gradyanı 7, 8 ve kemotaktik tepkisi doğru ECIS / Taxis 9 ile ölçülebilir varlığında geçirmek bilinmektedir. Lökosit kemotaksi, SDF1α ve kemotaksi antagonistleri yanıt olarak, aynı zamanda ECIS / Taksiler 10, 11 ile ölçülmüştür. SDF1α için lökosit tepkisi bir örnek Şekil 1 'de gösterilmiştir.
Protocol
1. ECIS / Taksiler Elektrot Hazırlanması
- ECIS / taksiler elektrot dizisine (sürgülü başına 8 odadan oluşan) ve altın yüzeyinin ilk steril koşullar altında, oda sıcaklığında 15 dakika için deiyonize su (2 dH O) steril 10 mM sistein ile ön-muamele ile stabilize edilir.
- Her bir elektrot odasının sistein çözüm aspire, steril dH 2 O ile 3 kez yıkayın ve tam orta 250 ul (RPMI 1640,% 10 FBS, 25 mM HEPES tampon) ile değiştirin.
- Elektrot denetimi gerçekleştirmek için enstrüman dizi tutucu pimleri irtibata elektrot dizisi bağlayın.
- Düzgün bağlandığından emin Odaları bilgisayar ekranında yeşil vurgulanır. Odalarına kırmızı olarak görünüyorsa, birbirlerine bağlı değildir ve elektrot tüm odaları için temas kurmak için dizi sahibinin yeniden yerleştirilmelidir.
- Tüm odaları bağlı olduğunda, caydırmak için yazılım denetleyicisi "onay" butonuna tıklayınHer oda için ilk direnç ve kapasite değerleri mayın. Direnç değerleri 1600 arasında ve 2000 ohm olmalıdır ve kapasitans değerleri 8 odası dizi için 5 ila 6 nanofarads olmalıdır. Bir oda, bu kabul edilebilir sınırlar dahilinde değil ise, tek tek odasına veri toplamak için kullanılmamalıdır.
- Bireysel agaroz odalarına hazırlamak için dizi sahibinin elektrot ayırın. Odalarından orta aspire ve steril dH 2 O, her odası 3 kez yıkayın
2. Agaroz Chambers hazırlanması
- Steril bir 15 ml polipropilen konik tüp, ölçü 0.03 Seakem GTG agaroz g ve 1 ml steril PBS ekleyin. Gevşek tüp kap yerleştirin ve 2 dakika sıvı döngüsü için otoklavda agaroz (mikrodalga fırında eritme Bu deneyde etkili değildir) eritin. Bu kısa zaman konik tüp eritmeyecek. (Örneğin Diktiyostelyum diskodeyum)% 0.5, kültür için serum gerekmez az titiz hücreler içinagaroz uygun ortamda yapılan ve mikrodalgada eritebilir. Mikrodalgada eritilip, bu doğallığından edileceği gibi, otoklav, serum gerektiren hücreleri için gereklidir.
- Bir su banyosu içinde ısıtılmış tam RPMI medyumu 5 mL (55 ° -60 ° C) doğrudan sıcak agaroz için,% 0.5 agaroz ve pipet kadar bir son konsantrasyon elde etmek ve aşağı doğru hafifçe karıştırılır.
- Her bir odacık içine eritilmiş agaroz orta pipet 300 ul, ECIS / taksiler dizi kapağı değiştirmek ve oda sıcaklığında jel izin verir.
- Agaroz jel değerlendirmek için 15 ml tüp kap içine agaroz kalan pipetleyin. Bu aşırı agaroz bölüm 4 de kullanılacaktır: agaroz içine kuyu Kesme.
3. Peki Kesici Takım Oluşturma ve Kanül Bileme
- , 5/64 "bit. Düşük devirli her kanül açılış matkap ucu döndürün kullanarak matkap her kanül op tüm iç kenarı keser belli yaparak, iki 14 gauge kör uç kanüller Keskinleştirkeskin bir kesme kenarı (Şekil 4A) oluşturmak için kısalmasının.
- Bir matkap basın bit 1 "x 2" x ¼ "5/64 ile pleksiglas (Şekil 4B-D)" ile iki delik açın. Her pleksiglas delikten eşit mesafede çıkacak şekilde her bilenmiş 14 gauge kanül takın.
4. Agaroz içine Wells Kesme
- Hafifçe ipuçları alev tarafından 14 gauge kanül sterilize edin. Önceden ECIS odacık içinde kuyu kesilmesi için kanül oda sıcaklığına soğumasına izin vermek, ya da 15 ml tüpün kap içinde agaroz dokunarak kanüller soğumaya. Kanül sıcaklığı çok yüksek ise odasına kuyular kesilir gibi, agaroz kuyuları şekilsiz ve kusurlu render eriyecek.
- Her bir odacık içinde hedef elektrot (Şekil 2C ve 5) çevreleyen iki altın nokta yukarıda kanül çifti hizalama. Kanül arasında hafif temas halinde durdurma, herhangi bir yatay hareket olmadan, kanül dikey olarak yerleştirinelektrod yüzey. Dikkatlice herhangi bir yatay hareket olmadan tekrar kanül kaldırın. Gradyanları karşıt için ek kuyuların Yerleştirme kanül jig bir yeniden yapılandırılması ile mümkündür.
- Yavaşça agaroz atık yakalamak Bir vakum tuzak düşük vakum basıncı bağlı steril bir 9 "Pasteur pipeti, kullanarak, kanül bıraktığı agaroz fişi aspire.
- Agaroz bombalamak için 2 dakika, 37 her odanın yüzeyine ° C ile tam RPMI medya 300 ul ekleyin ve sonra yavaşça agaroz bozmadan yüzey ve kuyulardan medya aspire.
5.. Wells Yükleniyor
- Her iyi 7 ul hacmi tutma yetisine sahiptir. Her odasında bir iyi için, hücre süspansiyonu 7 ul ekleyin. Jurkat T hücreleri için, 2 x10 7 hücre / ml kullanımı. Bu hücreler 200 serum yoksun eksik RPMI ile seyreltilen ng / ml SDF-1α, 7 ul cevap verecektir. Olumsuz bir devam olarak tek başına eksiksiz bir medya kullanınrol.
- Kuyular yüklendikten sonra, tüm kuyuları kesilmiş ve düzgün dolduruldu sağlamak için bir inverted mikroskop ile dizinin her odası görüntülemek. Hücreler de en sınır sınırları içinde olmalıdır. Bu kuyular hem görülür, ya da hücre de sınır ötesine yayılıyor, sonra bir boşluk agaroz altında oluşturmuştur. Veriler güvenilir olanlar odalarından yorumlanamaz gibi, yanlış kurmak kuyuları unutmayın.
6. Bilgi toplama
- Dizi tutucu elektrot yerleştirin ve sahibinin yaylı pogo iğne elektrot dizi altın yastıkları yeniden bağlanmak ve "Kur" butonuna tıklayınız. Düzgün bağlandığından emin kuyular yeşil vurgulanır. Kuyu kırmızı ise, birbirlerine bağlı değildir ve elektrot dizisi tutucu yeniden konumlandırılabilir olmalıdır.
- Dizi yapılandırması belirtmek için yazılım panelindeki açılır menüden gelen "8WE1" (8 sıra 1 elektrot) seçin.
- Yazılım Contr de "onay" seçeneğini seçinHer sıra için ilk direnç ve kondansatör değerlerini belirlemek üzere ol paneli. Kapasitans değerleri 5 ila 6 nanofarads olmalı ise direnci değerleri, 1600 ila 2000 ohm olmalıdır.
- Çeşitli frekanslarda direncini ölçmek için birden fazla frekans seçin. Frekansları özelleştirme, ya da tavsiye edilen bir frekans kümesini kullanarak bir seçim var. Standart çoklu frekans satın ayarları 8 kuyu / dak hızında 11 ön ayarlı frekans (52.5, 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 8.000, 16.000, 32.000 ve 64.000 Hz) veri yakalama. Ölçümler arasındaki zaman aralığı da özelleştirilebilir. Birden fazla frekans Veri Toplama kapasitans, empedans ve direnç analizi sağlar. 4.000 Hz direnç değerleri toplanıyor memeli hücre kemotaksisi çalışmaları için genellikle yeterli olur, ancak ek frekansları başka bağlamlarda 12,13 de bilgi sunabilir.
- Toplam deneme süresi sağ taraftan ayarlanabilirpaneli veya deney hücrelerin elektrotta varış göstergesidir direnci üretmişlerdir kez "finish" tıklayarak, elle durdurulabilir. Hücreler elektrot ulaşmak için geçen süre kullanılan hücre tipine bağlıdır.
- Veri toplama başlatmak için "Başlat" düğmesini tıklayın.
7. Veri Yönetimi
- Verileri Excel'e de, ECISθ sistemi eşlik ECIS 1600R yazılım, ECIS / Taksiler verilerini analiz etmek için en etkili yöntemdir.
- Yazılım veri analizi araç çubuğu radyo düğmeleri Z, R ve C Bunlar sırasıyla empedans, direnç, ya da kapasitans, x-ekseni (geçen süre) karşı dikey eksende çizilen olup olmadığını belirlemek içerir.
- ECIS / Taksiler verileri en verimli 4.000 Hz de zaman içinde direnç olarak görüntülenir. Hızlı direnç dalgalanmalar ya da microtransients (Şekil 1), elektrot üzerinden hücresel hareketin kanıtıdır. O, Derlemer binning veri noktaları öyle değil tüm noktaları grafikle olduğunu, ECIS / Taksiler için tavsiye edilmez bu verilerin ortalama microtransients dışarı edeceğinden.
- Grafik ECIS1600R yazılımı ile yapıldıktan sonra, dosya menüsünden "ihracat grafiği" seçerek ve bir. Tif veya. Jpg dosyası olarak kaydedilir tarafından ihraç edilebilir.
8. Temsilcisi Sonuçlar
Hücresel kemotaksis 4.000 Hz'de direnç artışı ile gösterilir. Hedef hücreler elektrot üzerine gelmesinden da Opp et açıklandığı gibi microtransients veya micromotion adlandırılan direnci hızlı değişimden görünüşü gösterilmektedir. ark., 2009 (Şekil 1) 14. Negatif bir sonuç tutarlı gösterilir, ya da Şekil 1'de kırmızı görülen 4.000 Hz direnci hafif bir azalma, edilir. Microtransients yokluğu da elektrot hücre hareketin yokluğu bir işaretidir. Direncinde artış, doğrudan doğruya bir proelektrot 10 geçmeye numarasını hücrelere portional. G proteinin reseptörler ile etkileşime bilinen monoklonal antikor ilave bir kemoatraktan için spesifik olan ya da toksin kemotaksi 11 bloke edebilir.
Şekil 1.. SDF1α. İnsan T hücreleri Jurkat (2.0x10 6 hücre / ml) yanıt olarak T İnsan Jurkat hücrelerinin kemotaksi SDF-1α bir gradyan maruz bırakıldı, bir negatif kontrol olarak ya RPMI 1640 (konsantrasyonu 100 ng / ml 'den başlayarak). 4000 Hz'de normalize direnci grafikle edildi. Herhangi bir hareket RPMI 1640 maruz kalma ile görülen iken insan Jurkat T hücreleri gibi direnci ve microtransients artışı gösterdiği, SDF-1α yanıt olarak hareket ettirilir.
Şekil 2. Bir ECIS / Taksiler üstten görünümü ezelî Elektrodt agaroz. Her ECIS / Taksiler elektrot 8 ayrı odadan oluşmaktadır. Her bir odacık büyük bir elektrot (a) Grubu ve her bir hedef elektrot (b) içerir. Her haznesi ayrıca kanülle agaroz içinde kuyu keserken bir kılavuz olarak kullanılan 2 altın halkalar (c) sahiptir. Altın kareler (d) elektrot için AC akım uygulamak için pogo pimleri bağlanmak temas pedleri vardır. Tekil hedef elektrotlar daha büyük karşı elektrot (e) ile her bir devre içinde bulunmaktadır.
Şekil 3. İki Wells her agaroz dolu odasına kesilir. Kemoatraktan iyi bir eklendiğinde iyi kemoatraktan en yakın chemoattract en yüksek konsantrasyon ile, agaroz bir degrade oluşturmak için yayılır. Hücreler kemoatraktan yüksek konsantrasyonda doğru agaroz altında seyahat ve hedef elektrot üzerinden geçebilir. Gibihücreleri hedef elektrot çapraz direnç artışı ECIS 1600R yazılım tarafından kaydedilir.
Şekil 4. Pleksiglas içine iki adet 14 gauge kanül yerleştirilmesi. A) 5/64 "matkap kanül ucu netleştirmek için kullanılır. B) iki delik düzeni atış göre 14 ölçü kanüller barındırmak için Pleksiglas Delinmiş edilmelidir. C) sağlamak üzere delikleri, bir sondaj pres kullanımı dik olan pleixglass yüzey. D) İki bilenmiş Cannulae ¼ "pleksiglas, birbirinden 2 mm (iç kenarlarından ölçüldüğünde) aracılığıyla eklenir. Bu bilenmiş kanüller dikkatle kuyuları kesmek için agaroz eklenir.
Şekil 5. ECIS / Taksiler odasındaki altın noktalarla kanüller hizalama. Kuyuları kesmek için, bilenmiş kanüller gerekirECIS / Taksiler odasının altındaki hedef elektrot kuşatan altın nokta ile uyumlu hale getirilmesi. Kanüller herhangi bir yatay hareketi olmadan, dikey olarak yerleştirilir, ve aynı şekilde kaldırılması gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ECIS / Taksiler testinin roman özelliklerine hücreleri kemoatraktan yanıt olarak gerçek zamanlı veri toplama otomatikleştirmek yeteneğini içerir. Bu teknolojinin en yaygın uygulama bireysel kemotaktik gradientinden hücresel tepkileri ölçmek veya kemotaksis agonistleri ve antagonistleri karışımlarından oluşan gradientinden üzere iken, ECIS / Taksiler yaklaşımı da oldukça yararlı olabilecek bu yapılandırmalar için varyasyonların mükellef olduğu hücresel yanıt değerlendirilmesi. Örtüşen veya ardışık gradyanlar yeni yollar hücresel davranışları etkileyebilecek dair sağlam kanıtlar vardır. Ayrıca, bu daha karmaşık geçişlerini yerinde 12, 13 norm olması muhtemeldir.
ECIS / Taksiler assay diğer teknolojilerle mümkün olmayan yöntemlerle bu farklı degrade yapılandırmaları modelleme etkinleştirebilirsiniz. Örneğin, ek bir kuyu ekleyerek, bir yönelimini g dağıtmakhücrenin ayrıca, hedef elektrot ile ilgili olarak radient (s). Bu kemotaktik faktörlerin kaynağı olarak kuyu birinde hücreleri yerleştirmek için tahlil konfigüre da mümkündür.
Tahlil kurarken, her odasında hedef ve sayaç elektrotlar kaplayan jeli tam hidrasyon sağlamak ve hedef elektrot için doğru mekansal ilişki kuyu kesmek için önemlidir. Dahası, hücrenin alt yanı agaroz tabakasının altında oluşturur ki sıvının ince bir film ile bitişik olması gerekir; bu hücreler örten gradyanı yanıt olarak hareket eder, bu filmin içindedir. Bunu yapmak için, bir arka jel fragmanları çıkmadan agaroz plug tüm aspire gerekir. Kanül ile agaroz fiş kesme kaldırılması degrade deforme ve hücreleri hedef elektrot boyunca serbestçe hareket sağlayan etkisi vardır iki kuyu arasında bir tünel oluşturabilirsiniz. Bu vakum basıncı asp için kullanılan son derece önemli olduğunujel fişi agaroz iyi bütünlüğünden ödün önlemek için düşük kızgın.
Bu jel kullanılan agaroz yüzdesi olarak varyasyonlar bu manipülasyon hücreler ortamı üzerine yarattığı konusunda kuvvetleri sorgulamak için kullanılabilir düşündüren, yabanıl tür hücrelerinde sitoskeletal kusurları ifade eden hücrelerdeki ayırt olduğunu bulduk. Jel kültürü sırasında kurutur, değişiklik ki etkisi, hücre hareketi ve sistemin toplam azalacaktır solüt konsantrasyonunda artış yavaş olur jel katılığı göreceli bir artış da dahil olmak üzere deneysel sonuçlar ortaya çıkar.
Testi hücre gövdesi üzerinden akım izin vermez lökosit ve diğer hücre türlerine göre hareket ölçümü ile uyumludur. Bu hücrelerin evrensel bir karakteristik değildir: sinir hücrelerini ve bazı epitel hücreler (örneğin) hücre gövdesi içinden akımı iletmek olabilir ve bu nedenle çok daha düşük rezistans valu üretecektiBireysel hücre başına es.
Bu yaklaşımlar özellikle kemotaktik gradientinden hücresel yanıtları algılamak için tanımlanmış olsa da, metastazı ve metastatik hücre hareketi geliştirmek ekstrasellüler sinyaller içeren çalışmalara benzer olarak uygulanan test hayal etmek kolaydır. Ayrıca, diğer hücre-substrat etkileşimi çalışmalarda kullanılan edilebilir ilave dizi konfigürasyonlar vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
David A Knecht ve Michael A Lynes olarak Uygulamalı Biyofizik, Inc Connecticut Üniversitesi tarafından lisans almış ECIS / Taksiler teknolojisi için verilen patent var
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (ES07408 ve EB00208) hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECIS Zθ | Applied Biophysics | www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS Electrode Array | Applied Biophysics | 8W Chemotaxis | www.biophysics.com/cultureware.php |
| Seakem GTG agarose | BioWhittaker | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH300703 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | Penicillin 5,000 IU/ml; Streptomycin 5 mg/ml |
| HEPES Buffer | MP Biomedicals | 1688449 | 1M solution, cell culture grade |
| 14 Gauge stainless steel Cannula (2) 4 inch | General Supply | 5-8365-1 | Blunt point |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays. Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).
- Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay. J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).
- Keese, C. G. I. A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).
- Laevsky, G., Knecht, D. A. Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments. J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).
- Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion. 11, 5-6 (1990).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).
- Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis. J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).
- Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury. J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).
- Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers. J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).
- Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity. Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).
- Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation. J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).
