Fastställande av däggdjurscellinjer Räknar och cellstorlek och cell hälsa Använda Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Summary

Den Moxi Z miniatyr automatiserad cellräknare är ett nytt instrument som kombinerar Coulter principen med patenterad tunn film sensorteknik och en proprietär programvara algoritm för att utföra dimensionering och räkning av ett brett storleksintervall av partiklar samt för att bestämma det allmänna hälsotillståndet i monodispers däggdjurscellkulturer. Detta protokoll beskriver användningen av detta instrument för att räkna och utvärdera hälsa cellkulturer.

Abstract

Partikel-och cellräkning används för en mängd tillämpningar inklusive rutin cellodling, hematologiska analyser och industrifastigheter ^1-5. En kritisk genombrott i cell / partikelräkning teknik var utvecklingen av Coulter tekniken av Wallace Coulter över 50 år sedan. Tekniken involverar applicering av ett elektriskt fält över en mikrometerstorlek bländare och hydrodynamiskt fokusering enstaka partiklar genom öppningen. Den resulterande ocklusion av öppningen av partiklarna ger en mätbar förändring i elektrisk impedans som kan direkt och exakt korrelerade med cellstorlek / volym. Erkännandet av det tillvägagångssätt som riktmärke i cell / partikelräkning härrör från extra precision och noggrannhet av dess partikel storlek och räknas, särskilt i jämförelse med manuella och bildbehandling baserade tekniker (noggrannhet i storleksordningen 98% för Coulter räknare kontra 75 - 80% för manuella och vision-baserade system). Dettakan tillskrivas det faktum att till skillnad från imaging-baserade metoder för cellräkning gör Coulter Technique en äkta tredimensionell (3-D) mätning av celler och partiklar vilket dramatiskt minskar antalet störningar från skräp och klustring genom att beräkna exakta volymetrisk information om ca cellerna och partiklar. Sammantaget ger detta ett medel för räkning och dimensionering celler i en mer korrekt, mindre tråkiga, mindre tidskrävande och mindre subjektiva metoder än andra räknar tekniker ^6.

Trots framträdande av Coulter tekniken i cell räkning har dess omfattande användning i rutinmässiga biologiska studier varit alltför grund av kostnaden och storleken på traditionella instrument. Även om en billigare Coulter styrmedel har producerats, har det begränsningar i förhållande till sina dyrare motsvarigheter i korrigeringen för "tillfällighet händelser" där två eller flera celler passerar genom öppningen och mäts samtidigt. Another begränsning med existerande Coulter tekniker är bristen på statistik på det allmänna hälsotillståndet i cellprover. Följaktligen måste ytterligare tekniker ofta användas tillsammans med Coulter-räkning för att bedöma cellviabilitet. Detta förlänger experimentuppställning tid och kostnad eftersom de traditionella metoderna för lönsamheten bedömning kräver cellfärgning och / eller användning av dyra och besvärliga utrustning såsom en flödescytometer.

Den Moxi Z Mini automatisk cellräknare, som beskrivs här är ett extremt litet bänk instrument som kombinerar noggrannhet Coulter principen med en tunn film sensorteknik för att exakt dimensionering och räkning av partiklar från 3-25 mikrometer, beroende på den cellräkning kassetten användas. M typ kassett kan användas för att räkna partiklar från med medeldiametrar av 4 - 25 mikron (dynamiskt område 2 - 34 mikrometer), och den typ S kassetten kan användas för att räkna partiklar med och genomsnittlig diameter av 3 - 20 mikrometer (dynamisk ringdee 2 - 26 mikrometer). Eftersom systemet använder en volymetrisk mätmetod, motsvarar de 4-25 mikrometer till en cellvolym intervallet 34 - 8180 fL och 3 - 20 mikrometer motsvarar en cellvolym intervallet 14 till 4200 FL, som är relevant när icke-sfärisk partiklar som mäts. Att utföra däggdjurscellinjer räknas med hjälp av Moxi Z är cellerna som skall räknas först spädas med ORFLO eller liknande utdrygningsmedel. En cellräkning kassett är införd i instrumentet, och provet laddas in i porten av kassetten. Tusentals celler dras, enda fil via en "Cell Sensing Zone" (CSZ) i den tunna film membran över 8-15 sekunder. Efter körningen använder instrumentet egenutvecklade kurvanpassning i samband med en proprietär programvara algoritm för att ge korrigering tillfällighet evenemanget tillsammans med en bedömning av den totala kulturen hälsa genom att bestämma förhållandet mellan antalet celler i populationen av intresse för det totala antalet partiklar. De totala partikelkoncentrationen inklue krympta och bryts ner döda celler, liksom andra skräp och föroreningar. Resultaten presenteras i histogrammet format med en automatisk kurvanpassning med grindar som kan justeras manuellt efter behov.

I slutändan möjliggör Moxi Z räkna med en precision och noggrannhet jämförbar med en Coulter Z2, den aktuella guldmyntfoten, samtidigt som ytterligare information kulturen hälsa. Dessutom uppnår dessa resultat på kortare tid, med en mindre fotavtryck, med betydligt enklare drift och underhåll, och till en bråkdel av kostnaden för jämförbara tekniker.

Protocol

1. Framställning av prover

1. Späd cellsuspensionen med ORFLO utspädningsmedel eller en lämplig spädningsmedel så att cellkoncentrationen är inom driftsområdet för instrumentet (3000 till 500.000 celler / ml för Typ M kassetten, eller 3000 till 2.500.000 celler / ml för Typ S kassett).
2. En spädning av 1:5 till 1:20 (typ M-kassett) eller ingen utspädning till 1:5 spädning (typ S-kassetten) rekommenderas för de flesta däggdjurscellinjer, men den lämpliga utspädningen kommer att bero på celltypen och såddtäthet. Den volym som erfordras för en korrekt räkning är ungefär 75 | il.

2. Kör proven

1. Slå på Moxi Z genom att trycka på strömbrytaren och hemskärmen visas.
2. Tryck ner förpackningen och sätt in en kassett i Moxi Z. Pipettera 75 pl Sample ... skärmen visas.
3. Pipettera en 75 pl prov i påfyllningsporten av kassetten (blå ovalmärkt 1 eller 2, beroende på vilken ände av kassetten insattes i instrumentet). Dessa är engångskassetter, som kan användas för 2 tester. Anm: Placera pipettspetsen direkt in i satsrummet vid ~ 45 ° vinkel så att spetsen fångas under den främre läppen hos brunnen. När utmatning, är det viktigt att vakuumet inte "ta före" den dispensering av vätskan som skulle kunna orsaka fickor av luft att komma in i kassetten. Det rekommenderas att ha en liten pärla (storleken träder brunn) av flytande form över väl under dispensering.
4. För att räkna de flesta däggdjursceller, peka på skärmen någonstans att starta. För räkning av mycket små partiklar (4 till 8 ^ m medeldiameter för Typ M och 3-8 pm genomsnittlig diameter för Typ S) kan Moxi Z köras i små partiklar läge. Obs: kassetten indikeras i den svarta fältet längst upp på skärmen. I detta läge sätter Moxi Z diametern skala 2 till 10 m som standard och utför räkningen usjunga optimerade parametrarna för detektering av små celler. Tryck på tryck här för Small Particle Lägesknapp (svart fyrkant) för att initiera testa och köra i detta läge.
5. Den Moxi Z börjar testet och antalet celler resultatet kommer att vara komplett på cirka 8 sekunder (typ M kassett) eller 15 sekunder (typ S kassett).
6. Kurvan Montering och MVI beräkningarna startar automatiskt och kräver bara några extra sekunder. När en lämplig passform hittas, kommer resultaten automatiskt att visas på skärmen.
7. För att göra gating läget standard förvärvet genom att trycka på Curve Fit greven knappen för att växla in i gating-läge.
8. Vid denna punkt kassetten kan tas bort från apparaten.

3. Hantera data

1. Om autoläge skalning är avstängd, visas resultaten initialt visas för en kurvanpassning räkna med en diameter skala 2-34 m (typ M kassett) eller 2-26 μm (typ S kassett). Om autoläge skalning är på, då Moxi Z automatiskt skala den horisontella axeln (x-axeln) för att det område som ligger närmast till bredden av kurvan-fit befolkningen samtidigt alla kurvpassningsreferenser data visas.
2. Om autoläge skalning är avstängd, att manuellt visa resultat vid en högre upplösning, tryck på 2-26 m ikonen (Type M) eller 2-18 m ikonen (Type S). Obs: Kassetten indikeras i den blå rutan högst upp till vänster på skärmen. Detta rekommenderas när man räknar mindre celler eller partiklar för att förbättra både kurvanpassningsförfarandet förmåga samt användarens förmåga att visuellt skilja nyanser av data.
3. Vid ökning av horisontella upplösningen kommer skalningen knappen anpassa dynamiskt för att möjliggöra cykling mellan de tillgängliga x-axeln Skalan går: 2-34 och 2-26 och 2-18 och 2-10 pm för typ M kassetten, eller 2 -26, 2-18 och 2-10 m för typ S kassetten. Denna funktion är endast tillgängble omedelbart efter en celltal.
4. Räkneinformation (celler per ml) för kurvanpassning eller grindas regionen visas i en svart låda under den vänstra sidan av histogrammet. Genomsnittlig cellstorlek information visas i den svarta rutan under höger i histogrammet.
5. Det MVI värdet visas en blå ruta längst upp till höger i histogrammet. Om testet kördes i små partiklar läget gäller inte MVI inte och kommer att visas som "MVI = SPM". Dessutom om koncentrationen av celler ligger utanför MVI arbetsområdet, ett budskap om "MVI = Out of Range" visas.
6. För att spara den aktuella histogrammet trycker du på Klar ikonen. Detta sparar data med ett namn "Test XXX" där XXX är motsvarande test nummer.
7. För att manuellt porten histogrammet, Tryck för att växla kurvan Anpassa antalet resultat-knappen. Detta gör gating läget standard förvärvet. Skjut varje blå gating markör för att ställa grindarna eller peka the vänster och höger pilar (dessa visas på vidrör den blå gating markören) för fina grind justeringar endast de celler mellan markörerna räknas. Histogrammet vertikala skalan automatiskt skalas bygger på kurvan-fit befolkningen amplitud. För att justera denna vertikala skalan, dra skärmen uppåt eller nedåt i histogrammet regionen.
8. Tryck på Gated greven resultat för att återställa displayen till kurvan passform läge och gör kurvpassning läget läget standard förvärvet.
9. Tryck sedan på Klar-ikonen för att spara resultatet och återgå till startskärmen. För att radera resultaten, tryck på ikonen Ta bort när som helst permanent radera resultatet av testet.

4. Analys av tidigare förvärvade Data

1. Vill öppna en sparad test trycker du på Histogram-ikonen på startsidan.
2. Ikoner för upp till nio sparade histogram visas på skärmen.Tryck på lämplig ikon för testet av intresse eller tryck på Page Up eller Page Down ikonerna för att visa fler testresultat.
3. Varje histogram öppnas i antingen Curve Fit greven läge eller Gated Count läge, beroende på hur den sparades. I Gated greve läge kan gating markörer placeras enligt önskemål genom att skjuta varje blå gating markör självständigt. Genom att trycka på önskad toppen Auto Gate. Tryck för att växla mellan Gated greven och Curve Fit lägen räknas.
4. Tryck på Zoom och Zooma ut ikonerna för att justera den vertikala skalan i histogrammet. Den vertikala skalan kan också ändras av vertikalt att dra ett finger på displayen uppåt (öka) eller nedåt (för att minska).
5. Tryck på ikonen Ta bort för att permanent ta bort resultatet av testet.
6. Tryck på Klar ikonenStäng testresultaten och återgå till startskärmen. (Obs: zoomas uppfattning inte kommer att sparas.)

5. Överföra data till en PC

1. Data kan överföras till en PC med hjälp av Orflo Moxichart ansökan eller via USB-överföring genom att ansluta Moxi Z USB-kabel till en PC eller Mac. För Bluetooth överföring (MoxiChart), först bestämma enhetens Bluetooth-ID genom att trycka på Bluetooth-ikonen på startskärmen på Moxi Z enheten.
2. På datorn öppnar MoxiChart programmet och klicka på Bluetooth-ikonen i övre högra hörnet. Välj sedan den enhet som motsvarar Bluetooth ID Moxi Z och välj en målmapp för de uppladdade filerna.
3. Moxichart automatiskt överföra alla filer till den angivna katalogen via Bluetooth-anslutningen.
4. Filer som överförs via Bluetooth (MoxiChart) eller USB kan öppnas och analyserzed direkt med MoxiChart ansökan eller, eftersom de är formaterade. csv-filer, kan de vara direkt öppnas i Microsoft Excel eller andra program för dataanalys för ytterligare / Anpassad analys.

6. Representativa resultat

För att bedöma precision och noggrannhet av Moxi Z, räkningar av HEK-293 celler, HeLa-celler, CHO-K1, jäst, Jurkat E6-1 celler, PC12 celler och precision-kalibrerad pärlor suspensioner med koncentrationer från 0-500,000 celler / ml (typ M-kassetten) och 0-2-2.5e ⁶ celler per ml (typ S-kassetten) räknades och jämfördes med användning av en Coulter Z2 och Moxi Z. Alla däggdjursceller erhölls från American Type Culture Collection (ATCC) och odlades såsom tidigare beskrivits ^7-11. Kortfattat odlades cellerna i suspension i 75 mm ² vävnadsodlingskolvar med kärna media från RPMI 1640 (Jurkat E6-1, PC12), MEM (HEK-293-, HeLa-celler), eller F12K-(CHO-K1-celler). Alla medium kompletterat med10% fetalt bovint serum och 100 U penicillin/100 pg streptomycin. Kolvarna hölls i en inkubator vid 37 ° C med _5% CO2. Cellerna passerades varje 3 dagar. Jästceller (X5, C. albicans, Vin 13) donerades och användas omedelbart enligt. Initiala provkoncentrationer av ~ 500.000 celler / ml för kassett typ M uppgifter och ~ 2-2.5e ⁶ celler / ml för typ S kassetten etablerades med hjälp av Coulter Z2. Efterföljande teoretiska koncentrationer var förberedd genom serieutspädningar med fysiologiska buffertar (Isoton II eller Hanks Balanced Salt Solution). Vid varje koncentration var identiska prover mättes genom båda systemen och plottades mot varandra. Såsom framgår av fig. 2, fanns det en stark linjär korrelation (typ M ^ ^2> 0,9886, Typ S ^r2> 0,9781) mellan de värden för alla prover. Koncentrationer jämfördes också med de förväntade / teoretiskt cellkoncentrationer med både Moxi Z och Z2 ( 2> 0,9758, typ S r ^2> 0,9774).

Att bedöma exakt, var HEK-293-och HeLa-cellräkningar utfördes med användning av Coulter-Z2, Moxi Z och en hemocytometer. Den genomsnittliga variationskoefficienten (CV, n = 19) av blodbilden med hjälp av Moxi Z (Type M kassett), Coulter Z2 och en hemocytometer beräknades med CV är mätt från 5 separata räkningar i 200.000-300.000 cellerna / ml. Den lilla genomsnittliga CV (figur 4) i Moxi Z är jämförbar med den Z2 och är representativ för den höga precision enbart uppnås med Coulter-baserade räkna teknik.

Dimensionering precision Moxi Z instrumentet utvärderades nästa genom mätning av köpta kalibrerade kulor precision polystyren. Medelvärdesbildade partikelstorleksmätningar (n = 5) från Moxi Z plottades mot tillverkarens rapporterade storlekar. Såsom kan ses iI figur 5, matchade Moxi Z mätningarna genomgående tillverkaren värdena med en hög linjär korrelation (r ² = 0,9989).

Utöver storlek och antal upplysningar, ger Moxi Z en reagens-fri, allmän bedömning av däggdjurscellodling hälsa med ett rapporterat Moxi viabilitet (MVI) värde. Detta index genereras från ett förhållande av antalet celler i populationen av intresse med avseende på de totala partikelformiga räknas. För att demonstrera MVI mätmöjligheterna var MVI avläsningar (typ M-kassett) jämfört med standard manuell och flödescytometriska levande / döda mätteknik. Populationer av döda (<10% viabla) HEK-293-och HeLa-celler skapades genom den över natten inkubationer av de levande cellerna i ett näringsmedium-fri, natriumfluorid innehållande utspädningsmedel (Isoton II, Beckman Coulter) vid 37 ° C. Kontrollerade teoretiska viabilitet nivåer framställdes genom ratiometrically kända blandningsmetoder koncentrationer av levande och döda celler. Resulting lösningar analyserades med avseende på lönsamhet nivåer i två exemplar med både Hemocytometerräkningar och flödesmätningar cytometern. Hemocytometer mätningar gjordes med användning av en traditionell 50/50 blandning av 0,1% lösning av trypanblått och celler. Flödescytometriska mätningar gjordes med användning av en guava PCA cytometer (Merck) med användning av Viacount reagenset och som specificerats av tillverkaren protokoll (Merck). Såsom visas i figur 6, var Pearson korrelationskoefficient värden ^(R2) "i linjär anpassning av MVI data till analoga procenttal hemocytometer viabilitet för" HEK-celler och HeLa-celler ^r2 = 0,9937 och r ² = 0,9728 resp. Dessa resultat visar att denna metod ger information kulturen hälsa inom ett brett spektrum av cell livsduglighet som jämför positiv till levande / döda mätningar som erhållits med hjälp av en flödescytometer eller hemocytometer.

Tabeller och figurer (från Dittami et al, 2011.) ^15:

Figur 1. Tunnfilm Coulter-räkning: Elektrisk ström bringas att passera genom cellen avkänningszonen i tunnfilms-kassett. Som celler flöda enda fil genom CSZ är tillfälliga ökningar i spänning mätt med Moxi Z.

Figur 2. Moxi Z pulser är jämförbara med Coulter Z2 räknas. Identiska räkningar av cell och pärla suspensioner räknades med användning av både en Coulter Z2 och Moxi Z. Averaged räknevärden (n = 3-4) i Moxi Z pulser plottades med avseende på Coulter motsvarande Z2 räknas och r ² värderingar linjär anpassning bestämdes. A) Typ M kassett - koncentrationsintervall 0 - 500.000 celler / ml. B) Typ S kassett - koncentration mellan 0 - 2-2.5e ⁶ / ml.Error Staplarna anger ± 1 standardavvikelse.

Figur 3. Moxi Z koncentrationsmätningar vs teoretiska cellkoncentrationer. A) Typ M kassett - Teoretiska koncentrationsvärden framställdes av seriella spädningar av en inledande 500.000 celler / ml prov B) Typ S kassettbandspelare -. Teoretiska koncentrationen värden framställdes av seriella spädningar av en initial 2 - 2.5e ⁶ celler / ml prov. Felstaplar anger ± 1 standardavvikelse.

Figur 4. Variationskoefficient för Coulter Z2, Z Moxi (typ M-kassett), och hemocytometer. Den genomsnittliga variationskoefficienten (CV, n = 19) av HEK-293-och HeLa-cellräkningar för varje metod beräknades med CV mätt från 5 separata räkningar av HEK-293 och HeLa celler i 200.000 - 300.000 celler / ml. Felstaplar anger ± 1 standardavvikelse.

Figur 5. Noggrannare mätningar partikelstorlek med Moxi Z-Moxi Z uppmätt pärlstorlek (typ M-kassett) vs tillverkaren rapporterat pärla storlek. Felstaplar anger ± 1 standardavvikelse.

Figur 6. Kultur Hälsoutvärdering med MVI - Jämförelse av MVI mätningar (typ M kassett) och guava PCA Viacount livskraft kontra visuella, trypan-blå färgade lönsamhet räknas med hjälp av en hemocytometer.

Discussion

Den underliggande Genomförande Coulter tillvägagångssättet kan vara mycket deterministisk av den totala noggrannheten i mätningarna. Ett kritiskt område är att utjämna de de råa cell står för "tillfällighet evenemang" där två eller flera celler samtidigt passerar genom öppningen och mäts som en enda elektrisk händelse. "Tillfällighet händelser" bidra till fel som varierar beroende på ett antal faktorer, bland annat cellens storlek och graden av klustring (Davis et al 1967) ^6. Som ett resultat kan den nödvändiga tillfällighet korrektion för varje givet prov inte förutsägas, varierande kraftigt mellan celler / partikel typer och även mellan olika kulturer identiska celltyper. Etablerad teori, rotad i första publikationer av Coulter, innebär tillämpning av en logaritmisk anpassning av de råvaror räknas baserat på antalet observerade händelser och ett empiriskt bestämd, partikel-specifik korrektionsfaktor Z. Medan exakta räknas kan väl uppnås med thans korrigering algoritm, är den begränsad i sin praktiska tillämpbarhet på grund av de stora variationerna i z-värden mellan celltyper och motsvarande svårigheter att exakt förutspå dess värde. Här med den "sanna" cell count identifieras av Moxi Z kurvanpassning i samband med sammanträffande korrigering algoritmen, korrigerar Moxi Z dynamiskt för tillfällighet att uppnå de verkliga koncentrationerna. Vid jämförelse med resultaten med high-end Coulter Z2, producerade Moxi Z jämförbara räknas över en koncentration mellan 0 - 500.000 celler / ml (typ M-kassett) och 3.000 - 2-2.5e ⁶ celler / ml (typ S kassett) . Dessutom uppnår Moxi Z räkna noggrannhet med en liknande låg variationskoefficienten för räknas och en precision i partikel storlek som är karakteristisk för guldmyntfoten, Coulter-teknik i cell räkning.

Dessutom data som presenteras här indikerar att Moxi Z kan ge värdefull informationom det allmänna hälsotillståndet i cellkulturer. Den Moxi Z utnyttjar kurvanpassningsförfarandet tillvägagångssätt med en proprietär programvara algoritm för att avgöra denna bedömning kultur hälsa. Morfologiska förändringar som förknippas med celldöd, såsom blåsbildning, bryta isär och volymetriska förvrängningar (Kataoka och Tsuruo 1996, Liegler et al 1995, Sheridan et al 1981) ^12-14, att göra det möjligt för Moxi-Z för att skilja impedimetric skillnader mellan levande populationer och döda celler / skräp populationer. Den MVI genereras genom att analysera kultur / partikelstorleksfördelning att identifiera de relativa bidragen från partikel skräp, krympta nekrotiska celler och kurvan-monterade cellpopulation av intresse. Det MVI värdet motsvarar därmed en population index eller ratiometrisk mått på monodispersa befolkningen räknas med avseende på den totala partikeln befolkningen profil. Detta värde är sedan algoritmiskt-justeras baserat befolkningsstatistiken och empiriska observationer. BecausE MVI tittar på andra parametrar än traditionella färgning metoder, är det inte förväntas att spegla dessa tekniker utan ger ett värdefullt alternativ inblick i hälsa i en cell kultur, särskilt med avseende på skräp och föroreningar mikrobiella.

Sammanfattningsvis är Moxi-Z celltalsräknare en extremt liten bänk instrument som ger exakta, reproducerbara analyser av celltal, cell storlek och cell hälsa med hjälp av Coulter Princip och kurvanpassning algoritmer programvara i kombination med en patenterad tunn film sensorteknik . Med Typ M kassetten är i stånd att räkna partiklar som sträcker sig från 4 - 25 mikron i diameter (dynamiskt område av 2 - 34 mikron), i 8 sekunder. Med Typ S kassetten är i stånd att räkna partiklar varierande från 3 - 20 mikrometer i diameter (dynamiskt område av 2 - 26 mikron), i 15 sekunder. Vidare utför Moxi-Z hälsoundersökning utan användning av reagens. Det är mycket mindre arbetskraft integreradensive och subjektiva än manuell räkning. I jämförelse med vanlig Coulter räkningen är Moxi snabbare, betydligt mindre, ger mer information, kräver betydligt mindre underhåll, är lättare att använda och är en bråkdel av kostnaden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ORFLO Diluent	ORFLO	MXA006
Cassette Dispenser	ORFLO		Stores up to 25 cassettes for convenient dispensing
USB Cable	ORFLO		Connects instrument to PC/Mac or power adapter
Power Adapter (US and EU models only)	ORFLO		Connects USB cable to an AC outlet
USB Flash Drive	ORFLO		Stores Moxi Z software and user manual
Calibration Check Beads	ORFLO
Electronic Calibration Cassette	ORFLO		Electronic cassette for verifying proper system operation and calibration