Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Moxi Z Mini Otomatik Hücre Sayacı Kullanımı Memeli Hücre Sayımı, Hücre Boyutu ve Hücre Sağlık Belirlenmesi

Published: June 21, 2012 doi: 10.3791/3842
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Orflo Technologies, 2University of Utah

Summary

Moxi Z minyatür otomatik hücre sayıcı patentli ince film sensör teknolojisi ve boyutlandırma gerçekleştirmek için özel bir yazılım algoritması ve parçacıkların geniş bir ebat aralığında sayma gibi kümil potasyum başlatıcısı varlığında genel sağlık belirlemek için Coulter İlke birleştiren yeni bir enstrümandır memeli hücre kültürleri. Bu protokol, hücre kültürlerinin sağlık sayma ve değerlendirme için bir aracın kullanılması açıklanmaktadır.

Abstract

Parçacık ve hücre sayımı rutin hücre kültürü, hematolojik analizi, ve endüstriyel kontrol 1-5 dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılır. Hücre / partikül sayma teknolojileri kritik bir atılım 50 yılda önce Wallace Coulter tarafından Coulter tekniğinin geliştirilmesi idi. Teknik bir mikron büyüklüğünde diyafram boyunca bir elektrik alan uygulama içerir ve hidrodinamik delikten tek parçacıklar duruluyor. Parçacıklar tarafından diyafram çıkan tıkanıklığı, doğrudan ve kesin hücre boyutu / hacim ile korele edilebilir elektrik empedansı ölçülebilir bir değişiklik verir. - Hücre / parçacık sayma kriter olarak yaklaşımın tanınma, partikül boyut ve sayıları olağanüstü hassasiyet ve doğruluk kaynaklanıyor, özellikle de el ve görüntüleme dayalı teknolojiler (75 karşı Coulter sayaçlar için% 98 sipariş doğrulukları karşılaştırıldığında manuel ve görüntü tabanlı sistemler için% 80). Buhücre sayımı için görüntüleme-temelli yaklaşımlar aksine, Coulter Tekniği hassas hacimsel bilgi hesaplayarak dramatik enkaz ve kümeleme gelen sayım girişim azaltır hücre / parçacıkların bir gerçek üç boyutlu (3-D) ölçümü yapar, aslında atfedilebilir hücreler / partikülleri ile ilgili. Genel olarak bu diğer sayma teknikleri 6 daha doğru, daha az sıkıcı, daha az zaman alıcı ve daha az öznel anlamda hücrelerin numaralandırma ve boyutlandırma için bir yol sağlar.

Hücre sayımı yılında Coulter tekniğin önem kazanmasına rağmen, rutin biyolojik çalışmalarda yaygın kullanımı nedeniyle geleneksel araçların maliyeti ve büyüklüğü için engelleyici olmuştur. Bir daha az pahalı Coulter bazlı aleti imal edilmiş olmasına rağmen, iki ya da daha fazla hücre diyafram geçmekte ve eş zamanlı olarak tespit edildiği "tesadüf olaylar" için düzeltme içindeki daha pahalı benzerleri ile karşılaştırıldığında, bu sınırlamaları vardır. AnotheMevcut Coulter teknolojileri ile r sınırlama hücre örneklerinin genel sağlık ölçümleri eksikliğidir. Sonuç olarak, ek teknikler genellikle Coulter hücre canlılığını değerlendirmek için sayma ile birlikte kullanılması gerekir. Canlılığı değerlendirme geleneksel yöntemlerle hücre boyama ve / veya böyle bir akış sitometresinin kadar pahalı ve hantal ekipman kullanımı gerektiren bu yana bu deneysel kurulum süresi ve maliyetini uzanır.

Burada anlatılan Moxi Z Mini otomatik hücre sayıcı, etkinleştirmek için bir ince-film sensör teknolojisi ile Coulter İlke doğruluğunu birleştiren ultra-küçük benchtop araçtır boyutlandırma ve 3-25 mikron arasında değişen parçacıklar sayma, bağlı hassas hücre sayımı kaset kullanılabilir. 25 mikron (dinamik aralığı 2 - - 34 mikron) M tipi kaset 4 ortalama çaplı partiküllerin hesaplamak için kullanılabilir, ve Type S kaset ile parçacıklar ve 3 arasında ortalama çapı hesaplamak için kullanılabilir - 20 mikron (dinamik çaldıe 2 - 26 mikron). Sistemin bir hacimsel ölçüm yöntemi kullanır yana, 4-25 mikron 34 bir hücre hacmi aralığına karşılık gelen - 8,180 fL ve 3 - 20 mikron 14 bir hücre hacmi aralığına karşılık gelen - 4200 fL, ilgili olduğunda Küresel olmayan parçacıklar olarak ölçülmüştür. Moxi Z kullanılarak memeli hücre sayımı gerçekleştirmek için, sayılmasına hücreleri birinci ORFLO ya da benzer bir seyreltici madde ile seyreltilir. Bir hücre sayımı kaset alet sokulur ve örnek kaset portuna yüklenir. Hücrelerin binlerce 8-15 saniye içinde ince-film membran bir "Hücre Algılama Zone" (CSZ) aracılığıyla Tek dosya çekilir. Run ardından, enstrüman sayısı ilgi popülasyonda hücre sayısının oranı belirleyerek genel kültür sağlık bir değerlendirmesi ile birlikte tesadüfen olay düzeltme sağlamak için özel bir yazılım algoritması ile birlikte eğri özel kullanır parçacıklar. Toplam tanecik sayısı dahil olmak üzeree çekmiş ve ölü hücreleri, hem de diğer artıkları ve kirletici bozuldu. Sonuçlar gerektiği gibi el ile ayarlanabilir geçitleri ile otomatik bir eğri ile uyum histogram format, sunulmuştur.

Ek kültür sağlık bilgileri sağlarken Sonuçta, Moxi Z, bir Coulter Z2, günümüzde altın standart karşılaştırılabilir bir kesinlik ve doğruluk ile sayım sağlar. Ayrıca önemli ölçüde daha kolay operasyon ve bakım ile daha küçük ayak izi, ve karşılaştırılabilir teknolojilerin maliyetinin bir kısmını, daha az zamanda bu sonuçları elde ediyor.

Protocol

1. Numunelerin Hazırlanması

  1. Hücre yoğunluğu aleti (3000 ila 500,000 hücre / mL Tip M kaset için, ya da 3.000 ila 2.500.000 hücre / S kaset tipi için mL) çalışma aralığı içinde kalacak biçimde ORFLO seyreltici ya da uygun bir seyreltici ile hücre süspansiyonu ile seyreltilir.
  2. 01:20 (M Tipi kaset) veya 1:5 seyreltme (Type S kaset) için seyreltme 1:5 bir seyreltme en memeli hücre hatları için tavsiye edilir, ancak uygun seyreltme hücre tipi ve tohum yoğunluğu bağlıdır. Doğru bir sayım için gerekli hacmi yaklaşık 75 uL olup.

2. Koşu Örnekleri

  1. Güç düğmesine basarak ve Ana ekranda görüntülenir tarafından Moxi Z çevirin.
  2. Tepsiye bastırın ve Moxi Z. Pipet 75μL örnek ... ekranı göreceksiniz içine bir kaset yerleştirin.
  3. Kaset doldurma portu (mavi oval bir 75 uL örnek PipetiHangi kasetinin ucu bağlı olarak 1 ya da 2, etiketli) alet içine yerleştirilmiştir. Bunlar, 2 testleri için de kullanılabilir atılabilir kasetleri, bulunmaktadır. Not: Yeri ucu iyi ön dudak altında yakalanan böylece ~ 45 ° açıyla de, doğrudan yükleme içine pipet. Dağıtma zaman, kaset girmek için hava cepleri neden olabilecek şekilde vakumla sıvı dozaj arasında "ileri" alın değildir olması önemlidir. Bu dağıtım sırasında oldukça üzerinde sıvı formunda küçük bir boncuk (iyi giriş boyutu) olması tavsiye edilir.
  4. Çoğu memeli hücre sayımı için, başlamak için ekranın herhangi bir yerine dokunun. Çok küçük parçacıklar (4 ila 8 mikron M Tipi ve 3-8 mikron Type S için ortalama çapı ortalama çapı) sayma için Moxi Z Küçük Parçacık modunda çalıştırılabilir. Not: kaset tipi ekran üstündeki siyah çubuk endikedir. Bu modda, Moxi Z varsayılan olarak 2 ila 10 um çapı ölçekli ayarlar ve sayımı u gerçekleştirirküçük hücrelerin saptanması için optimize edilmiş parametreler şarkı. BURAYA TOUCH testi başlatmak ve bu modda çalıştırmak için Küçük Parçacık Modu düğmesine (siyah kare) tuşuna basın.
  5. Moxi Z testi başlayacak ve hücre sayımı sonuçları yaklaşık 8 saniye (M tipi kaset) veya 15 saniye (Type S kaset) içinde tamamlanmış olacaktır.
  6. Eğri Uydurma MVI ve hesaplamaları otomatik olarak başlayacak ve sadece birkaç saniye ek gerektirir. Uygun bir formda bulunduğunda, sonuçlar daha sonra otomatik olarak ekranda görüntülenir.
  7. Ayırıcı varsayılan kazanım modu yapmak için, Eğri Ayırıcı moduna geçiş yapmak için Kont düğmesine Fit basın.
  8. Bu noktada, kaset ünitesi çıkarılabilir.

3. Veri Yönetimi

  1. AutoMode ölçekleme kapalıysa, sonuçlar başlangıçta bir eğri uyum 2-34 m çaplı ölçeği (M Tipi kaset) üzerinde sayısı veya 2-26 μ için görüntülenirm (Type S kaset). Otomatik mod ölçekleme açıksa, o Moxi Z otomatik olarak tüm eğri-fit verileri görüntülenir sağlarken eğrisi-fit nüfusun genişliği en yakın aralığında yatay eksen (x ekseni) dönüşebilecek.
  2. AutoMode ölçekleme elle yüksek çözünürlükte sonuçlarını görüntülemek için, kapalı ise, 2-26 mikron simgesini (M Tipi) veya 2-18 mikron simgesini (Type S) dokunun. Not: Kaset tipi ekranın sol üst kısmında mavi kutu içinde gösterilir. Eğri yetenekleri gibi görsel verilerin nüansları ayırmak için kullanıcının yeteneğinde iyileştirmek için küçük parçacıkların hücreleri veya sayma takdirde önerilir.
  3. Yatay çözünürlük artan üzerine, ölçekleme düğmesini dinamik olarak mümkün olan x-ekseni ölçeği aralıkları arasında bisiklet sağlamak için ayarlar: 2-34, 2-26, 2-18, ve M Tipi kaset için 2-10 mikron veya 2 Type S kaset için -26, 2-18 ve 2-10 mikron. Bu özellik sadece availa olduğunuhemen bir hücre sayımı takip ble.
  4. Eğri-fit veya kapı bölge için sayın bilgileri (hücre / ml) histogramın sol tarafında küçük siyah bir kutu görüntülenir. Ortalama hücre boyutu bilgi histogramın sağ tarafında küçük siyah kutu görüntülenir.
  5. MVI değeri histogramın sağ üst köşesinde mavi bir kutu görüntülenir. Test küçük parçacık modunda çalıştırmak ise, MVI geçerli değildir ve "MVI = SPM" olarak gösterilir. Hücrelerin konsantrasyonuna MVI çalışma aralığı, "Aralığı MVI = yetersiz" bir mesajın dışındaysa Ek olarak gösterilir.
  6. Mevcut histogram kaydetmek için, Bitti simgesine dokunun. Bu XXX ilgili test sayıdır "Test XXX" bir isim ile verileri kaydeder.
  7. Elle kapısı histogram için, Curve Fit sayımı sonuçları düğmesine geçiş yapmak için dokunun. Bu Ayırıcı varsayılan satın mod yapar. Sonra inci kapıları ayarlamak veya dokunun her mavi yolluk işaretleyici kaydırınince kapısı ayarlamaları için e sağ ve sol ok (bu mavi yolluk işaretleyici dokunulduğunda görünür) işaretleri arasında sadece hücre sayılır. Histogram dikey ölçeğini otomatik olarak eğri-fit nüfus genlik göre tartılır. Bu dikey ölçeğini ayarlamak için, histogram bölgede tokatlamak ekranı aşağı veya yukarı.
  8. Eğri sığdırma modu ekranına geri dönme ve eğri uygun modu, varsayılan toplama modu yapmak için Gated Sayım sonuçları düğmesine dokunun.
  9. Sonra sonuçları kaydetmek ve Ana ekrana geri dönmek için Done simgesine basın. Sonuçlarını silmek için, kalıcı test sonuçlarını silmek için her zaman Sil simgesine basın.

4. Daha önce Edinsel Veri Analizi

  1. Kaydedilmiş bir testi açmak için, Ana ekranda Histogram simgesine basın.
  2. Dokuz kaydedilen histogramlarına simgeleri ekranda görüntülenir.Ilgi testi için uygun simgesine basın veya daha fazla test sonuçlarını görüntülemek için ikonlar Aşağı Page Up veya Page basın.
  3. Her histogram kaydettiğiniz nasıl bağlı olarak, Curve Fit Kont modu veya Gated Sayısı modunda da açılacaktır. Gated Kont modunda, yolluk belirteçler bağımsız olarak her mavi yolluk işaretleyici kaydırarak istenilen şekilde yerleştirilebilir. Otomatik Kapı istenen tepe üzerine dokunarak. Gated Kont ve Curve Fit Kont modları arasında geçiş yapmak için dokunun.
  4. Histogramın dikey ölçeğini ayarlamak için Yakınlaştırma ve Unzoom simgeleri basın. Dikey ölçek dikey olarak da aşağı yukarı ekran (artırmak için) veya (azaltmak için) bir parmak swiping tarafından değiştirilebilir.
  5. Sürekli test sonuçlarını silmek için Sil simgesine basın.
  6. Için Done simgesine basıntest sonuçları kapatın ve Ana ekrana geri dönmek. (Not: Yakınlaştırılmış görünümü kaydedilmez.)

5.. PC'ye veri aktarma

  1. Veri, bir PC veya Mac için Moxi Z USB kablosu takarak Orflo Moxichart uygulamasını kullanarak bir PC veya USB aktarım yoluyla aktarılabilir. Bluetooth transferi için (MoxiChart), ilk Moxi Z biriminin Ana ekranda Bluetooth simgesini basarak cihazı Bluetooth kimliğini belirlemek.
  2. Bilgisayarda, MoxiChart uygulamasını açın ve sağ üst köşede Bluetooth simgesini tıklayın. Sonra, Moxi Z Bluetooth kimliği karşılık cihaz seçin ve yüklenen dosyalar için hedef klasörü seçin.
  3. Moxichart otomatik Bluetooth bağlantısı ile belirtilen dizine tüm dosyaları transfer olacak.
  4. Bluetooth (MoxiChart) veya USB tarafından aktarılan dosyaları analy açılıp edilebilironlar biçimlendirilmiş, çünkü MoxiChart uygulama ile doğrudan zed veya. csv dosyaları, doğrudan ek / özel analiz için Microsoft Excel veya diğer veri analiz programları açılabilir.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Moxi Z hassas ve kesin değerlendirmek için, HEK-293 hücreleri, HeLa hücreleri, CHO-K1, maya, Jurkat E6-1 hücreleri, PC12, ve sayım 0-500,000 hücreleri arasında değişen konsantrasyonlarda sahip boncuk süspansiyonlar hassas kalibre / mL (Tip M kaset) ve 0-2-2.5e 6 hücre / ml (Tip S kaset) sayıldı ve tüm memeli hücrelerinin Amerikan Tip Kültür Koleksiyonundan (ATCC) elde edildi, bir Coulter Z2 ve Moxi Z. ile karşılaştırıldı ve kültür olarak daha önce 7-11 nitelendirdi. Kısaca, hücreler RPMI 1640 (Jurkat E6-1, PC12), MEM (HEK-293, HeLa) hücreler veya F12K (CHO-K1) hücrelerin çekirdek ortam ile 75 mm 2 doku kültür şişeleri içinde süspansiyon içerisinde kültüre edildi. Tüm medya ile tamamlanıyor% 10 fetal sığır serumu ve 100 U penicillin/100 mikrogram Streptomisin. Flasks% 5 CO2 ile 37 ° C 'de bir inkübatör muhafaza edildi. Hücreler 3 gün boyunca her pasajlanmağa devam edildi. Maya hücreleri (X5, C. albicans, Vin 13) bağışlanan ve hemen olarak verilmiştir kullanılmıştır. M Tipi kaset veri ve Type S kaset için ~ 2-2.5e 6 hücre / ml için ~ 500.000 hücre / ml İlk örnek konsantrasyonları Coulter Z2 kullanılarak oluşturuldu. Müteakip teorik konsantrasyon seviyesi fizyolojik tamponlar (ISOTON II ya da Hank'in dengeli tuz çözeltisi) ile seri seyreltiler vasıtasıyla hazırlandı. Her konsantrasyondaki, aynı örnekleri her iki sistem ile ölçüldü ve birbirlerine karşı çizilmiştir. Şekil 2'de görüldüğü gibi, güçlü bir doğrusal ilişki vardı (M Tipi r 2> 0,9886, Type S r 2> 0,9781) tüm örnekler için sayımları arasında. Konsantrasyonlar da Moxi Z ve Z2 her ikisi ile teorik / beklenen hücre konsantrasyonları ile karşılaştırılmıştır ( 2> 0,9758, Type S r 2> 0,9774).

Hassas değerlendirmek için, HEK-293 ve HeLa hücre sayımı Coulter Z2, Moxi Z, ve bir hemasitometre ile yapıldı. CV 200,000-300,000 hücre / ml aralığında 5 ayrı sayıları ile ölçülür ile Moxi Z (M Tipi kaset), Coulter Z2 ve hemasitometre kullanarak hücre sayıları varyasyon ortalama katsayısı (CV, n = 19) hesaplandı. Moxi Z küçük ortalama CV (Şekil 4) Z2 ile karşılaştırılabilir ve Coulter tabanlı sayma teknolojileri ile sadece ulaşılabilir hassasiyet yüksek düzeyde temsilcisidir.

Moxi Z enstrüman boyutlandırma satın hassas, hassas kalibre polistiren boncuklar ölçümü yoluyla sonraki değerlendirildi. Moxi Z ortalama parçacık boyutu ölçümleri (n = 5) üretici rapor boyutları karşı grafiğe geçirildi. Görülebileceği gibi in Şekil 5, Moxi Z ölçümleri sürekli bir yüksek doğrusal korelasyon (r 2 = 0,9989) ile üretici değerler eşleştirilir.

Boyutu ve sayısı bilgileri ötesinde, Moxi Z bir rapor Moxi Canlılık Endeksi (MVI) değeri ile memeli hücre kültürü bir sağlık reaktif gerektirmeyen, genel bir değerlendirme sağlar. Bu indeks toplam parçacık sayımı ile ilgili olarak ilgi popülasyonda hücrelerin sayısının oranı, bir elde edilir. MVI ölçüm yetenekleri göstermek için, MVI değerleri (M Tipi kaset) standart manuel ve flow sitometri ölü / canlı ölçüm teknikleri ile karşılaştırıldı. Ölü (<% 10 canlı) HEK-293 ve HeLa hücre popülasyonları 37 seyreltici (ISOTON II, Beckman Coulter) içeren bir besin içermeyen, sodyum florür ° C'de canlı hücrelerin gecede inkübasyonlar yoluyla oluşturulan Kontrollü teorik canlılık düzeyleri canlı ve ölü hücreleri ratiometrically karıştırma bilinen konsantrasyonları tarafından hazırlanmıştır. Resulting çözümler hemositometre sayıları ve akış sitometresi ölçümleri ile her iki nüsha halinde canlılık düzeyleri incelendi. Hemasitometre ölçümler% 0.1 Tripan mavi bir çözelti ve hücrelerin geleneksel bir 50/50 karışım kullanılarak yapılmıştır. Flow sitometri ölçümleri Viacount reaktif ve üretici tarafından belirtilen protokol (Merck) kullanarak bir Guava PCA sitometresi (Merck) kullanılarak yapıldı. Şekil 6'da gösterildiği gibi, HEK hücreleri ve HeLa hücreleri "için analog bir hemasitometre canlılığı yüzdelere MVI verilerin lineer bir formda" Pearson katsayısı değerlerinin (R 2) = 0,9937 ve r 2 = 0,9728, sırasıyla, R 2 idi. Bu sonuçlar, bu yaklaşım bir sitometresi veya hemositometre kullanılarak elde edilen canlı / ölü ölçümleri üstünlügümüz hücre canlılığı geniş bir yelpazesinde kültür sağlık bilgileri sağladığını göstermiştir.

Tablolar ve Şekiller (Dittami ve ark, 2011). 15:


Şekil 1.. İnce film Coulter Sayma: Elektrik akımı ince-film kaseti Hücre Algılama Bölgesi geçirilir. Hücreleri CSZ aracılığıyla tek bir dosya akışı gibi, voltaj anlık artışlar Moxi Z. ile ölçülür

Şekil 2
Şekil 2. Moxi Z sayıları Coulter Z2 sayıları karşılaştırılabilir. Hücre ve boncuk süspansiyonların Özdeş sayıları bir Coulter Z2 ve Moxi Z. hem kullanılarak sayıldı Moxi Z sayıları sayısı değerleri (n = 3-4) Ortalamalı göre çizildi Coulter ilgili Z2 sayımı ve doğrusallaştırma r 2 değerleri tespit edilmiştir. A) M Tipi kaset - 0 konsantrasyon aralığı - 500.000 hücre / ml. B) Type S kaset - 0 konsantrasyon aralığı - 2-2.5e 6 / ml.Error Barlar işaret ± 1 standart sapma.


Şekil 3. Moxi Z konsantrasyonu ölçümleri teorik hücre konsantrasyonları vs. A) Type M kaset - Teorik konsantrasyonu değerlerinin bir başlangıç ​​500,000 hücre / ml numunesinin seri seyreltiler hazırlandı B) Type S kaset -. 2.5e 6 hücre / ml örnek - Teorik konsantrasyonu değerlerinin bir ilk 2 seri seyreltiler hazırlandı. Hata Barlar ± 1 standart sapma gösterir.

Şekil 4
Şekil 4. Coulter Z2, Moxi Z (M Tipi kaset) ve hemositometre için Değişim Katsayısı. Her yaklaşım için HEK-293 ve HeLa hücre sayıları varyasyon ortalama katsayısı (CV, n = 19) ayrı 5 ölçülen özgeçmişleri ile hesaplandı 300.000 hücre / ml aralığı - 200.000 içinde HEK-293 ve HeLa Hücreleri sayar. Hata Barlar ± 1 standart sapma gösterir.


Şekil 5. Moxi Z-Moxi Z kullanılarak partikül boyutu ölçüm Hassas boncuk büyüklüğü ölçülür (M Tipi kaset) vs üreticisi boncuk boyutu bildirdi. Hata Barlar ± 1 standart sapma gösterir.

Şekil 6
6 Şekil. MVI kullanarak Kültür Sağlık Değerlendirmesi - Bir hemasitometre kullanarak görsel, tripan-mavi lekeli canlılığı sayımları karşı MVI ölçümler (M Tipi kaset) ve Guava PCA Viacount canlılığının karşılaştırılması.

Discussion

Alttaki uygulaması Coulter yaklaşımı ölçümlerin genel doğruluk son derece belirleyici olabilir. Kritik bir bölgede iki veya daha fazla hücre aynı anda diyafram geçiyor ve tek bir elektrik olayı olarak ölçülür "tesadüf olaylar" için ham hücre sayımları düzeltmedir. "Tesadüf olaylar" hücre boyutu ve kümelenme derecesi (Davis ve ark 1967) 6 dahil olmak üzere bir dizi faktöre bağlı olarak değişir hata katkıda bulunur. Sonuç olarak, herhangi bir örnek için gerekli rastlantısal düzeltme yaygın olarak hücre / partikül tipleri arasında ve daha da özdeş hücre tipleri farklı kültür arasında değişen, önceden tahmin edilemeyen. Coulter tarafından ilk yayınlarında köklü teori, kurulan, gözlemlenen olaylar ve ampirik belirlenmiş, parçacık özel düzeltme faktörü, z sayısına göre ham sayıları bir logaritmik ayarlaması uygulama içerir. Doğru düzgün t sayımları ile elde edilebilir ikenkendi düzeltme algoritması, bu hücre tiplerinin ve doğru bir değeri tahmininde karşılık gelen zorluğu arasındaki z değerleri büyük farklılıklar bağlı olarak, pratik uygulanabilirliği sınırlıdır. Burada, rastlantısal düzeltme algoritması ile birlikte Moxi Z eğri tarafından tanımlanan "gerçek" hücre sayısı kullanılarak, Moxi Z dinamik gerçek konsantrasyonları elde etmek tesadüf düzeltir. 500.000 hücre / ml (M Tipi kaset) ve 3000 - 2 - 2.5e-6 hücre / ml (Type S kaset) high-end Coulter Z2 kullanılarak elde edilen sonuçlar karşılaştırıldığında, Moxi Z 0 bir konsantrasyon aralığında karşılaştırılabilir sayımları üretilen . Ayrıca, Moxi Z sayısında varyasyon benzer bir düşük katsayısı ve altın standart, hücre sayımı yılında Coulter-teknik karakteristik parçacık boyutlandırma bir hassasiyet ile bu sayı doğruluğu ulaşır.

Ayrıca, burada sunulan veriler Moxi Z değerli bilgiler sağlayabilir göstermektedirHücre kültürlerinin genel sağlığı ile ilgili. Moxi Z bu kültürün sağlık değerlendirmesi belirlemek için özel bir yazılım algoritması ile eğri yaklaşımı yararlanır. Ayırmak gibi blebbing gibi hücre ölümü ile ilişkili morfolojik değişiklikler, ve hacimsel çarpıtmalar (Kataoka ve Tsuruo 1996, Liegler ve ark 1995, Sheridan ve ark 1981) 12-14, mümkün Moxi-Z arasındaki impedimetric farklılıkları ayırt etmek için yapmak popülasyonları ve ölü hücre / enkaz nüfus yaşıyor. MVI parçacık enkaz göreceli katkıları, büzüşmüş nekrotik hücreler ve ilgi eğrisi takılan hücre popülasyonunu belirlemek için kültür / tanecik boyut dağılımı analiz tarafından üretilir. MVI değeri böylece toplam partikül nüfus profiline göre kümil potasyum başlatıcısı varlığında nüfus sayımları nüfusu dizin veya oranlı metrik ölçü yansıtır. Bu değer daha sonra algoritmik-ayarlanabilir dayalı nüfus istatistikleri ve ampirik gözlemler olduğunu. Because MVI geleneksel bir boyama yaklaşımlar başka parametrelerle bakar, bu teknikler ayna beklenmez fakat bunun yerine bir hücre kültürünün sağlığı ile ilgili önemli bir görünümü, özellikle bir alternatif döküntüleri ve kirletici maddeleri mikrobiyal ile ilgili olarak, sağlar.

Özetle, Moxi-Z hücre sayacı patentli bir ince-film sensör teknolojisi ile birlikte Coulter İlke ve eğri yazılım algoritmaları kullanarak hassas, tekrarlanabilir hücre sayısının deneyleri, hücre boyutunu ve hücre sağlığı sağlayan ultra küçük benchtop araçtır . 8 saniyede, - çapı 25 mikron (34 mikron 2 dinamik aralık -) M Tipi kaseti ile 4 arasında değişen parçacıklar sayma yeteneğine sahiptir. 15 saniye içinde, - çapı 20 mikron (26 mikron 2 dinamik aralık -) Type S kaset ile 3 arasında değişen parçacıklar sayma yeteneğine sahiptir. Dahası, Moxi-Z reaktiflerin kullanımı olmaksızın sağlık değerlendirmelerinin gerçekleştirir. Bu, daha az emek inte varnsive ve manuel sayım daha çok özneldir. Standart Coulter sayımı karşılaştırıldığında, Moxi, önemli ölçüde daha küçük daha hızlı, daha fazla bilgi sağlayan önemli ölçüde daha az bakım gerektirir, kullanımı kolay ve maliyetinin bir kısmını olduğunu.

Disclosures

Gregory M. Dittami ve HE Ayliffe Orflo Teknolojileri, dizayn, üretir ve satar Moxi Z. Richard D. Rabbitt Orflo Teknolojileri ödenen danışmanlık uzmanlığı, part-time sağladığı şirket çalışanlarıdır.

Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Orflo Teknolojileri tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ORFLO Diluent ORFLO MXA006
Cassette Dispenser ORFLO Stores up to 25 cassettes for convenient dispensing
USB Cable ORFLO Connects instrument to PC/Mac or power adapter
Power Adapter (US and EU models only) ORFLO Connects USB cable to an AC outlet
USB Flash Drive ORFLO Stores Moxi Z software and user manual
Calibration Check Beads ORFLO
Electronic Calibration Cassette ORFLO Electronic cassette for verifying proper system operation and calibration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fernyhough, M. E., Helterline, D. L., Vierck, J. L., Hill, R. A., Dodson, M. V. Coulter counter use in the enumeration of muscle and fat stem cells. Methods. Cell. Sci. 25, 221-225 (2003).
  2. Blades, A. N., Flavell, H. C. Observations on the use of the Coulter model D electronic cell counter in clinical haematology. J. Clin. Pathol. 16, 158-163 (1963).
  3. Morris, T. M. Particle Size Analysis of Beer Solids using a Coulter Counter. J. Inst. Brew. 90, 162-166 (1984).
  4. Marth, E. H. Electronic Somatic Cell Counting Procedure. Standard Methods for the Examination of Dairy Products. , Amer. Publ. Health Assoc., Inc. 134-140 (1978).
  5. Parks, L. R., Jurbergs, K. A. Number and size distribution of particles in cellulosic solutions. J. Appl. Polym. Sci. 11, 193-199 (1960).
  6. Davis, R. E., Green, R. E. Automatic platelet counting with the Couler particle counter. J. Clin. Pathol. 20, 777-779 (1967).
  7. Dittami, G. D., Rabbitt, R. D. Electrically evoking and electrochemically resolving quantal release on a microchip. Lab on a Chip. 10, 30-35 (2010).
  8. Nahreini, P., Hanson, A., Prasad, K. High-yield production of recombinant antibody fragments in HEK-293 cells using sodium butyrate. BioTechiques. 34, 968-972 (2003).
  9. Escuyer, V., Collier, R. J. Anthrax Protective Antigen Interacts with a Specific Receptor on the surface of CHO-K1 Cells. Infection and Immunity. 59, 3381-3386 (1991).
  10. Isaacs, R. D. Borrelia bugdorferi bind to epithelial cell proteoglycans. J. Clin. Invest. 93, 809-819 (1994).
  11. Saito, Y., Takahashi, K. Characterization of selenoprotein P as a selenium supply protein. Eur. J. Biochem. 269, 5746-5751 (2002).
  12. Kataoka, S., Tsuruo, T. Physician Education: Apoptosis. Oncologist. 1, 399-401 (1996).
  13. Liegler, T. J., Hyun, W., Yen, T. S., Stites, D. P. Detection and quantification of live, apoptotic, and necrotic human peripheral lymphocytes by single-laser flow cytometry. Clin. Diagn. Lab Immunol. 2, 369-376 (1995).
  14. Sheridan, J. W., Bishop, C. J., Simmons, R. J. Biophysical and morphological correlates of kinetic change and death in a starved human melanoma cell line. J. Cell. Sci. 49, 119-137 (1981).
  15. Dittami, G. M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. ORFLO Moxi Z: Revolutionizing electronic cell count accuracy and cell viability estimates through curve fitting. Life Science Magazine, VWR International. , Forthcoming (2011).

Tags

Hücresel Biyoloji Sayı 64 Moleküler Biyoloji hücre sayımı coulter sayımı hücre kültürü sağlık değerlendirmesi partikül boyutlandırma memeli hücrelerinin Moxi Z
Moxi Z Mini Otomatik Hücre Sayacı Kullanımı Memeli Hücre Sayımı, Hücre Boyutu ve Hücre Sağlık Belirlenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dittami, G. M., Sethi, M., Rabbitt,… More

Dittami, G. M., Sethi, M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter. J. Vis. Exp. (64), e3842, doi:10.3791/3842 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter