Summary
Прямой подход ПЦР, представленные здесь облегчает ПЦР-амплификации непосредственно из небольшого количества неочищенных растительных и животных тканях.
Abstract
Прямой подход облегчает ПЦР ПЦР-амплификации непосредственно из небольшого количества неочищенных образцов, и демонстрирует здесь в течение нескольких растительных и животных тканях (рис. 1). Прямая ПЦР основан на специально оборудованных Thermo Scientific Phusion и полимераз Phire ДНК, которые включают в себя двухцепочечной ДНК-связывающий домен, который дает им уникальные свойства, такие как высокая устойчивость ингибиторов.
ПЦР-ДНК-мишени обнаружения имеет многочисленные приложения в растительных исследования, включая анализ генотипа растения и проверки трансгенов. ПЦР из тканей растений, традиционно включает в себя начальный этап выделения ДНК, что может потребовать дорогих или токсичных реагентов. Этот процесс занимает много времени и увеличивает риск перекрестного загрязнения 1, 2. Напротив, при использовании Thermo Scientific Phire завод Прямая PCR Kit целевой ДНК могут быть легко обнаружены, без предварительного выделения ДНК. В модели показано здесь,Например производных дрова амплификации полиморфной анализ последовательности (dCAPS) 3,4 производится непосредственно из Arabidopsis листья растений. dCAPS генотипирования анализы могут быть использованы для идентификации одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) по SNP аллель-специфической эндонуклеазы рестрикции пищеварения 3.
Некоторые образцы растений, как правило, более сложной при использовании прямого метода ПЦР, так как они содержат компоненты, которые мешают ПЦР, таких как фенольные соединения. В этих случаях дополнительные шаги для удаления соединений традиционно требуется 2,5. Здесь эта проблема преодолевается с помощью быстрого и легкого разведения протокола следует Прямая ПЦР-амплификации (рис. 1). Пятнадцать лет дубовых листьев используется в качестве модели для сложных растений, как образец содержит большое количество фенольных соединений, в том числе дубильные вещества.
Перенос генов в организм мышей широко используется для изучения роли генов в развитвремя транспортировки, физиологии и болезни человека. Использование этих животных требует обследования на наличие трансгенов, как правило, с ПЦР. Традиционно, это связано с трудоемким шагом выделения ДНК, в которой ДНК для анализа ПЦР очищали от уха, хвост или ноги тканей 6,7. Однако, с Thermo Scientific Phire тканей животных Прямые PCR Kit трансгенных мышей может быть генотипировали без предварительной очистки ДНК. В этом протоколе трансгенных мышей генотипа осуществляется непосредственно из тканей уха мыши, как показано здесь сложный пример, где только один набор праймеров используются для усиления двух фрагментов различной значительно в размерах.
Protocol
1. Генотипирование Arabidopsis лица завода с Direct Protocol
- Чтобы начать анализ dCAPS генотипирования непосредственно на лист растения Arabidopsis, сначала сформулируем 20 или 50 мкл реакции ПЦР с использованием завод Phire Прямая PCR Kit, как описано в таблице 1.
- Затем вырезать 0,50 мм удар от листьев растения Arabidopsis помощью Харриса Uni-Core и Харрис резки Мат. Проведение нокаутер твердо, нажмите на передний край в ткани и поверните нокаутер вперед и назад.
- Нажмите на поршень, чтобы извлечь диск ударом в смесь ПЦР-реакции. Убедитесь, что образец опускается в раствор ПЦР и не прилипает к стенкам трубки.
- Очистите передний край в нокаутер между каждым образцом для предотвращения перекрестного загрязнения путем погружения его в 2% раствор NaClO. Нажмите на поршень вверх и вниз несколько раз и протрите передний край с чистым бумажным полотенцем. Резка мат также должны бытьпромывать между образцами.
- Далее, используется Thermo Scientific Piko 24-а Термоциклер и Thermo Scientific Piko ПЦР планшета для выполнения ПЦР-реакции с использованием велосипедного условиях, описанных в таблице 2. ПЦР также может быть выполнена в обычной амплификатор.
- После ПЦР спином вниз растительного материала. Передача 5 мкл супернатанта в новую пробирку микроцентрифуге. Добавить 4 мкл воды и 1 мкл рестриктазы, SspI. Аккуратно перемешайте и спином вниз кратко для сбора содержимого в нижнюю часть трубки. Инкубируйте реакционной смеси в течение одного часа при 37 ° C. Инактивации ферментов рестрикции путем инкубации при температуре 65 ° С в течение 20 мин.
- При усилении ДНК непосредственно из растительных тканей, ПЦР-продукты включают в себя завод и ПЦР-производные компоненты, которые могут помешать ферментативного расщепления ограничения. Таким образом, это может быть необходимо либо разбавленным (например, 1:2 или 1:3 в воде) или очистки продуктов ПЦР до тОн последующее пищеварение, например, с помощью подходящего коммерческого набора таких как Thermo Scientific GeneJET набора для очистки ПЦР.
- После ограничения пищеварения фермента, анализировать полученные фрагменты в агарозном геле. Добавить 2,5 мкл 5х буфера загрузки реакции и выполнения электрофореза в агарозном геле с 10 мкл полученной смеси.
2. Развивая специфические фрагменты ДНК с 15-летней Дубовые листья помощью разбавления протокола
- Для начала, нарезать 2 мм удар листьев дуба.
- Поместите образец в 20 мкл буфера поставляются с завода Phire Kit Прямая ПЦР. Очистите передний край в панчер и резка мат, как раньше.
- Раздавить лист образца с 100 мкл кончика пипетки, нажав на нее кратко от стенки трубы. В зависимости от растительного материала, разбавление протокол иногда работает лучше, без дробления образца.
- Побочные образцов на микроцентрифуге до тОн реакций в нижней части трубы.
- Супернатант может быть использован непосредственно в ПЦР, или он может быть разбавлен 1:10 или 1:100 в стерильной воде в зависимости от типа образца. Используйте 0,5 мкл в 1 мкл супернатанта или разбавления в качестве шаблона для 20 мкл ПЦР-реакции. Подготовка реакцию, как описано в таблице 1.
- После реакции готовят, используют Thermo Scientific Piko 24-а Термоциклер и Thermo Scientific Piko ПЦР планшета для выполнения ПЦР-реакции с использованием велосипедного условиях, описанных в таблице 2. ПЦР также может быть выполнена в обычной амплификатор.
- После ПЦР, добавить 5 мкл 5х буфера загрузки реакции и выполнения электрофореза в агарозном геле с 15 мкл полученной смеси.
3. Генотипирование трансгенных мышей с использованием протокола разбавления
- Начало разведения протокол о трансгенных мышей путем размещения 2 мм ударом мУз уха в 20 мкл буфера, содержащего 0,5 мкл DNARelease Аддитивные поставляется с Phire тканей животных Прямые Kit ПЦР.
- Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 2 мин, затем 2 мин инкубации при 98 ° C.
- Побочные образцов на микроцентрифуге до реакции в нижней части трубы.
- Используйте 1 мкл супернатанта в качестве шаблона для 20 мкл ПЦР, полученный, как описано в таблице 3. Любой супернатант, который не будет использоваться сразу же может быть передана в новую пробирку и хранить при температуре -20 ° C.
- Далее, используется Thermo Scientific Piko 24-а Термоциклер и Thermo Scientific Piko ПЦР планшета для выполнения ПЦР-реакции с использованием велосипедного условиях, описанных в таблице 4. Опять же, ПЦР также может быть выполнена в обычных велосипедистов ПЦР.
- После ПЦР, добавить 5 мкл 5х буфера загрузки реакции и выполнения электрофореза в агарозном геле Wго по 15 мкл полученной смеси.
4. Представитель Результаты
В технике dCAPS сайт рестрикции в SNP интерес либо введены или уничтожены использованием ПЦР-праймеров с одно или несколько несоответствий на ДНК-мишени. Генотипирование Arabidopsis лиц заводе был проведен с dCAPS технику непосредственно из листьев ударов. Усиленный продукты перевариваются и полученные фрагменты выявления генотипа каждого были проанализированы помощью гель-электрофореза (рис. 2).
В данном примере на 160 б.п. ПЦР продуктов, содержащих сайте SNP интерес (G или аллеля) в геноме Arabidopsis были усилены от ударов листьев растений с завода Phire Kit Прямая ПЦР. Прямой праймер содержал один несоответствия в конце 3 ', создавая SspI конкретные ограничения сайта в ДНК-мишени, в которую вошли SNP интерес (аллели), но неВ других аллелей SNP (рис. 2В).
Разведение протоколы необходимы для сложных растительных материалов, таких как листья дуба, благодаря высокой концентрации фенольных соединений. С помощью разбавления протокол, описанный здесь, 297 б.п. фрагмент хлорпластического ДНК амплифицировали с использованием 3-х ступенчатый протокол. Дубовый лист образцов с различной разведения показано на рисунке 3, в дополнение к положительным и отрицательным контролем.
Ткань Phire животных Прямые PCR Kit работал со сложной протокол, в котором только один набор праймеров были использованы для усиления двух фрагментов с большой разницей размеров, в результате обильного выхода, как правильно подобранной продукции в 1500 б.п. для трансгенных мышей и 200 б.п. для мышей дикого типа (рис. 4). Чем слабее верхней полосы с гетерозиготных мышей связано с конкуренцией как шаблоны (аллелей) по той же пары праймеров, однако genotypING результаты однозначны.
Стабильность образцов подготовлен с использованием протокола разбавления была также проверена. Результаты показывают, что разведение образцы могут храниться при температуре -20 ° С в течение не менее одного года. Кроме того, повторяется циклов замораживания / оттаивания существенно не влияет на реакцию (рис. 5). Также показана надежная усиления от уха мыши образцы тканей Phire использованием ДНК-полимеразы и прямым методом ПЦР по сравнению с горячего старта Taq полимеразы и очищенную ДНК (рис. 6).
| Компоненты | 20 мкл реакции | 50 мкл реакции | Final Конц. |
| H 2 O | добавить в 20 мкл | добавить до 50 мкл | |
| 2x Phire завод ПЦР-буфера | 10 мкл | 25 мкл | 1x |
| Грунтовка | X мкл | X мкл | 0,5 мкМ |
| Грунтовка B | X мкл | X мкл | 0,5 мкМ |
| Phire Hot Start ДНК-полимеразы II | 0,4 мкл | 1 мкл | |
| Образец / прямая протокола | 0,50 мм удара | ||
| Образец / разбавления протокола | 0.5-1 мкл |
Таблица 1. Условия реакции ПЦР растений, используемые в настоящем протоколе.
| Цикл шага | Температура | Время | Циклы |
| Начальная денатурация | 98 ° C | 5 мин | 1 |
| Денатурирование Отжиг * Расширение | 98 ° C X ° C 72 ° C | 5 сек 5 сек 20 сек | 40 |
| Окончательное расширение | 72 ° C 4 ° C | 1 мин держать | 1 |
Таблица 2. Велоспорт условия для растений PCR, используемые в настоящем протоколе.
* Калькулятор Tm вoscientific.com / pcrwebtools "целевых =" _blank "> www.thermoscientific.com / pcrwebtools рекомендуется при определении Tm для праймеров для использования с Phire Hot Start ДНК-полимеразы II. рекомендуется температуры отжига праймеров ≤ 20 NT равно нижняя Tm дается WebTool. Для грунтовки> 20 NT, использовать температуры отжига на 3 ° C выше, чем нижний Tm дается WebTool.
| Компоненты | 20 мкл реакции | Final Конц. |
| H 2 O | добавить в 20 мкл | |
| 2x Phire тканей животных ПЦР-буфера | 10 мкл | 1x |
| Грунтовка | X мкл | 0,5 мкМ |
| Грунтовка B | X мкл | 0,5 мкМ |
| Phгнев Hot Start ДНК-полимеразы II | 0,4 мкл | |
| Образец / разбавления протокола | 1 мкл |
Таблица 3. Реакция условия для тканей животных ПЦР, используемые в настоящем протоколе.
| Цикл шага | Температура | Время | Циклы |
| Начальная денатурация | 98 ° C | 5 мин | 1 |
| Денатурирование Отжиг * Расширение | 98 ° C X ° C 72 ° C | 5 сек 5 сек 20 сек ≤ 1 кб 20 сек / KB> 1 кб | 40 |
| Окончательное расширение | 72 ° C 4 ° C | 1 мин Держать | 1 |
Таблица 4. Велоспорт условия для тканей животных ПЦР, используемые в настоящем протоколе.
* Калькулятор Tm на www.thermoscientific.com / pcrwebtools рекомендуется при определении Tm для праймеров для использования с Phire Hot Start ДНК-полимеразы II. Рекомендуемая температура отжига праймеров для ≤ 20 NT равно ниже Tm дается WebTool. Для грунтовки> 20 NT, использовать температуры отжига на 3 ° C выше, чем ниже Tm дается WebTool.
Рисунок 1. Прямая ПЦР рабочий процесс. Прямая ПЦР может быть выполнено с использованием двух альтернативных протоколов. В прямом протокол небольшое количество образца добавляют непосредственно к ПКR реакции. Разбавления протокол использует краткую предварительной инкубации шаг, прежде чем ПЦР, чтобы освободить ДНК из образца материала.
Рисунок 2. Генотипирование Arabidopsis лиц растение с техникой dCAPS непосредственно из листьев ударов. A) Рисунок 2А показывает принцип анализа dCAPS выполнены. Ограничение сайте в течение SNP интерес либо введены или удалены методом ПЦР с использованием праймеров с одно или несколько несоответствий на ДНК-мишени. ПЦР-продукты перевариваются и полученные фрагменты выявить генотип каждого человека, когда анализировали с помощью электрофореза. B) 0,50 мм удары из листьев растений были помещены непосредственно в 50 мкл реакции ПЦР. 160 н ПЦР продуктов, содержащих сайте SNP (G или аллель) были усилены с помощью праймеров введения уникальный сайт SspI на А-аллель. Неочищенных продуктов ПЦР были пищеваренияТед с ферментом рестрикции SspI. Полученные фрагменты были проанализированы на 3% агарозном геле. Lane M является размер маркера; полосы и G соответствуют SNP аллелей каждого образца. Полученные результаты были подтверждены при обычном анализе ДНК экстракции с последующей ПЦР и ограничения пищеварения (данные не представлены). Негативной реакции контроль без ДНК-матрицы были включены в тест установить и запустить на отдельной агарозном геле параллельно с фактическим ПЦР перед выполнением пищеварения (данные не показаны).
Рисунок 3. Разведение протокол, используя образцы листьев дуба. Разведения протокол был использован для усиления 297 б.п. фрагмент хлорпластического ДНК в дубовых листьев образцов (3-шаг протокола, отжиг при 62 ° C) при различных разведениях (1:100, 1:10, 1 : 1 и 2:1) и положительные и отрицательные конTrols [C +: положительный контроль с очищенной ДНК (Arabidopsis), C-: отрицательный контроль без ДНК-матрицы]. Образец номенклатуры представляет сайте пробы (городов в Финляндии) и образец нумерации.
Рисунок 4. Генотипирование трансгенных мышей с одной парой праймеров помощью разбавления протокол. Ear тканей из девяти отдельных мышей (полосы 1-9) помещали в 20 мкл буфера для разведения в том числе DNARelease добавки. После инкубации при комнатной температуре и 98 ° C, 1 мкл супернатанта использовали в качестве матрицы в 20 мкл ПЦР-реакции. Фрагмент размерах: 1.500 BP (трансгенных) и 200 б.п. (дикого типа).
Рисунок 5. Образцы, приготовленные в соответствии с разбавлением протокол стабильны в течение длительного хранения. Образцы тканей уха мыши были вкл ubated в 20 мкл буфера в том числе DNARelease Аддитивные и подвергаются повторному замораживанию / оттаиванию (полоса 1), хранят при температуре -20 ° C в течение одного года (дорожка 2), или использоваться непосредственно для ПЦР (дорожка 3). Усиливается размеры фрагмента около 900 б.п., 1500 б.п. до 3200 б.п..
Рисунок 6. Phire тканей животных Прямые PCR Kit превосходит коммерческие системы очистки ДНК в сочетании с горячим полимеразы Taq ДНК-старт. Четыре ампликонов (0.5-1.5 кб) были усилены из уха мыши тканей с помощью разбавления протокол Phire тканей животных Kit Прямая ПЦР. Для сравнения, ДНК была очищена с использованием коммерческого набора для экстракции ДНК и того же фрагмента амплификации с использованием горячего старта Taq ДНК-полимеразы в соответствии с рекомендациями производителей. Только с животными Phire ткани прямой PCR Kit были все четыре ампликонов успешно усиливаются.
Рисунок 7. Универсальные сравнения процесса с оценкой раза / потребляемых реагентов. Thermo Scientific прямой ПЦР подхода по сравнению с подходом выделения ДНК, подход буфере для экстракции, и подход ПЦР-буфера. Расчетное время для каждого подхода перед этапом ПЦР указано красным цветом. Thermo Scientific прямой ПЦР подход занимает всего 0-4 мин для подготовки образцов до ПЦР. Ниже каждый метод, потребленный реагентов перечислены. Thermo Scientific прямой ПЦР подход использует наименьшее количество реагентов по сравнению с другими методами. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Discussion
Прямой подход ПЦР позволяет продемонстрировали здесь для ПЦР-амплификации непосредственно из небольшого количества неочищенных образцов, сокращения времени, необходимого и упрощения рабочего процесса для растений и животных генотипирования (рис. 7). Также показано здесь является использование протокола разведения в сочетании с прямым подходом ПЦР (рис. 3). Разбавления протокол рекомендуется с трудными образцов (например, возраста листьев растений, виды растений, которые содержат вмешательства соединения) или с длинными (или GC-богатых) ампликонов. Этот протокол является особенно полезной при запуске нового прямого эксперимента ПЦР, позволяющая для оптимизации реакции. Протокол может служить в качестве инструмента для решения случайные трудности, такие как низкий выход продукта из-за различий в материале ткани и / или праймеров. Кроме того, при работе с несколькими реакции со стороны того же образца, использовать для разбавления протокол обеспечивает весь образец не потребляется в одномреакции.
Для очистки ДНК из растений для ПЦР, конвенция призвана выполнять лизиса клеток следуют выделения ДНК с использованием различных компонентов, которые потенциально могут мешать ПЦР-анализа 8. Для особо сложных растений с высоким содержанием фенольных, добавлением поливинилпирролидона традиционно используется для удаления соединений, которые связываются с ДНК после лизиса клеток 2,5. Как видно здесь, это сложное, время интенсивного шага можно избежать за счет использования заводе Phire Прямая PCR Kit для обнаружения ДНК-мишени. Лизис клеток и шаги выделения ДНК могут быть опущены помощью чувствительных методов dCAPS непосредственно из Arabidopsis листьев растений (рис. 2). Как показано здесь, разведение Протокол эффективно управляет наличие проблемных компонентов, которые могут мешать ПЦР (рис. 3).
Традиционно, необходимым условием для животных генотипирования было isolatiна геномной ДНК из тканей животных посредством токсичных, отнимающий много времени процесс характеризуется длительной инкубации с протеиназы К переварить кожи и соединительной ткани, после экстракции органическим растворителем, алкоголь осадков, и центрифугирования шаги 6,9,10. Как показано здесь, упрощения этого процесса достигается за счет использования животного Phire ткани прямой PCR Kit, позволяющий трансгенных мышей для генотипировали без предварительной очистки ДНК (рис. 4). Например продемонстрировал в этой статье, особенно трудно, так как только один набор праймеров были использованы для усиления двух фрагментов с большой разницей размеров. Несмотря на врожденную сложность протокола, использование прямого подхода ПЦР в сочетании с простой протокол разведения в результате высоких урожаев двух продуктов ПЦР (рис. 4).
ПЦР-ДНК-мишени обнаружения имеет множество применений в исследованиях, включая генотип анализ для выявленияРоль генов в развитии, физиологии и болезней. В связи с ингибитором толерантности специализированных ДНК-полимеразы, протоколы могут быть завершены в минимальные сроки без предварительной очистки ДНК.
Disclosures
Производство и свободный доступ к этой статье проводится при финансовой поддержке Thermo Fisher Scientific, Inc
Acknowledgments
Для Arabidopsis образцов и соответствующих ПЦР-праймеров, мы благодарим профессора Яакко Kangasjärvi и его группы, группы растений стресс, биологии растений, Департамент биологических наук, Университет Хельсинки. Эксперименты с традиционным методом были проведены миссис Airi Lamminmäki.
Трансгенные мыши образцы были предоставлены д-р Яана Vesterinen, Институт биомедицины / биохимии, Университет Хельсинки.
Харриса Uni-Core и Харрис резки Мат являются товарными знаками Shunderson связи Все прочие товарные знаки являются собственностью компании Thermo Electron Corporation и ее дочерних компаний.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phire Plant Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-130 | 200 reactions (50 μl each) |
| Phire Animal Tissue Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-140 | 200 reations (50 μl each) |
| Harris Uni-Core 0.35 mm (pink) | Thermo Fisher Scientific | F-180S/L | Qty: 5/25 |
| Harris Uni-Core 0.50 mm (blue) | Thermo Fisher Scientific | F-185S/L | Qty: 5/25 |
| Harris Cutting Mat 6.4 × 7.6 cm | Thermo Fisher Scientific | F-190 | Qty: 5 |
| SspI | Thermo Fisher Scientific | ER0771 | 100 μl (100 reactions) |
| Piko 24-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | TCP0024 | |
| 24-Well Piko PCR Plates | Thermo Fisher Scientific | SLP0241 | |
| GeneJET PCR Purification Kit |
Thermo Fisher Scientific | K0701 K0702 |
50 preps 250 preps |
References
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin. 19, 11-15 (1987).
- Kim, C. S., Lee, C. H., Shin, J. S., Chung, Y. S., Hyung, N. I. A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP. Nucleic Acids Research. 25, 1085-1086 (1997).
- Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. The Plant Journal. 14, 387-392 (1998).
- Michaels, S. D., Amasino, R. M. A robust method for detecting single-nucleotide changes as polymorphic markers by PCR. The Plant Journal. 14, 381-385 (1998).
- John, M. E. An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics. Nucleic Acids Research. 20, 2381-23 (1992).
- Wang, Z., Storm, D. R. Extraction of DNA from mouse tails. BioTechniques. 41, 410-412 (2006).
- Malumbres, M., Mangues, R., Ferrer, N., Lu, S., Pellicer, A. Isolation of High Molecular Weight DNA for Reliable Genotyping of Mice. BioTechniques. 22, 1114-1119 (1997).
- Yang, Y., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis Leaves Using AnyDirect system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40, 444-447 (2007).
- Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory. , 2nd ed, CSH Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Meldgaard, M., Bollen, P. J. A., Finsen, B. Non-invasive method for sampling and extraction of mouse DNA for PCR. Laboratory Animals. 3, 413-441 (2004).
