Summary
Direct PCR metod som presenteras här underlättar PCR-amplifiering direkt från små mängder orenat växter och djur vävnad.
Abstract
Direct PCR-tillvägagångssätt underlättar PCR-amplifiering direkt från små mängder av orenade prover, och visas här för flera växt-och djur-vävnader (figur 1). Direkt PCR är baserad på speciellt framtagna Thermo Scientific Phusion och Phire DNA-polymeraser, som inkluderar ett dubbelsträngat DNA-bindande domän som ger dem unika egenskaper såsom hög tolerans av inhibitorer.
PCR-baserad mål-DNA upptäckt har många tillämpningar inom växtforskning, däribland anläggningar genotyp analys och verifiering av transgener. PCR från växtvävnader innebär traditionellt ett första steg DNA-isolering, vilket kan kräva dyra eller giftiga reagenser. Processen är tidsödande och ökar risken för korskontaminering 1, 2. Omvänt, genom att använda Thermo Scientific Phire Plantera direkt PCR Kit mål-DNA kan lätt upptäckas utan föregående DNA-extraktion. I modellen visas här, ettexempel på härledda förstärkt klyvd polymorf sekvensanalys (dCAPS) 3,4 sker direkt från Arabidopsis växtblad. dCAPS genotypningsförfaranden analyser kan användas för att identifiera enskilda nukleotidpolymorfismer (SNP) efter SNP allelspecifik restriktionsendonukleasdigestion 3.
Vissa växtprover tenderar att vara mer utmanande när du använder direkt PCR metoder eftersom de innehåller komponenter som stör PCR, såsom fenolföreningar. I dessa fall är ett ytterligare steg för att ta bort de föreningar som traditionellt krävs 2,5. Här, är detta problem övervinnas genom användning av en snabb och enkel utspädning protokollet följt av direkt PCR-amplifiering (figur 1). Femton år gamla eklöv används som modell för utmanande växter provet innehåller höga halter av fenolföreningar inklusive tanniner.
Genöverföring till möss i stort sett används för att studera rollerna gener i utveckngen, fysiologi och sjukdomar hos människor. Användningen av dessa djur kräver screening av förekomsten av transgenen, vanligtvis med PCR. Traditionellt innebär detta ett tidsödande steg DNA-isolering, under vilken DNA för PCR-analys renas från öra, svans eller tå vävnader 6,7. Däremot kan de Thermo Scientific Phire djurvävnad direkt PCR Kit transgena möss genotypas utan föregående DNA-rening. I detta protokoll transgen mus genotypning uppnås direkt från vävnader musöra, såsom visas här för en utmanande exempel där endast en primeruppsättning användes för amplifiering av två fragment skiljer mycket i storlek.
Protocol
1. Genotypning av Arabidopsis växter Individer med Direct protokoll
- Att påbörja dCAPS genotypning analysen direkt på Arabidopsis växt blad först formulera 20 eller 50 | il PCR-reaktioner med användning av Phire växt direkt PCR Kit som beskrivs i tabell 1.
- Därefter skär en 0,50 mm stans från en Arabidopsis växters blad med Harris Uni-Core och Harris skärmatta. Håll hålslag ordentligt, tryck framkant i vävnaden och rotera hålslag och tillbaka.
- Tryck kolven att mata ut stansen skivan i en PCR-reaktionsblandning. Säkerställa att provet faller in i PCR-lösningen och inte fastnar på rörväggarna.
- Rengör i framkanten av den hålslag mellan varje prov för att förhindra korskontaminering genom att doppa det i 2% NaClO lösning. Tryck på kolven upp och ner några gånger och torka i framkant med en ren pappershandduk. Den skärande Mattan bör också varasköljdes mellan prover.
- Därefter anställa en Thermo Scientific Piko 24-väl termocyklern och Thermo Scientific Piko PCR tavla att utföra PCR-reaktioner med hjälp av cykling villkor som beskrivs i tabell 2. PCR-reaktionerna kan även utföras i konventionella PCR termocykliska.
- Efter PCR, spinn ner växtmaterialet. Överför 5 pl av supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör. Tillsätt 4 | il vatten och 1 pl restriktionsenzym, Sspl. Blanda försiktigt och centrifugera ned kortvarigt för att samla innehållet i botten av röret. Inkubera reaktionsblandningen under en timme vid 37 ° C. Inaktivera restriktionsenzymet genom inkubering vid 65 ° C under 20 minuter.
- När amplifiering DNA direkt från växtvävnader, PCR-produkterna innefattar växt och PCR-härledda komponenter som kan störa restriktionsdigestion enzymet. Därför kan det vara nödvändigt att antingen späda (t.ex. 01:02 eller 1:03 i vatten) eller rena PCR-produkten före than efterföljande digerering, till exempel genom användning av en lämplig kommersiellt kit såsom Thermo Scientific GeneJET PCR Purification Kit.
- Efter restriktionsenzymdigerering, analysera de resulterande fragmenten på en agarosgel. Tillsätt 2,5 pl 5x laddningsbuffert till reaktionen och utföra agarosgelelektrofores med 10 pl av den resulterande blandningen.
2. Förstärka specifika DNA-fragment från 15-åriga eklöv använder Utspädning protokollet
- Till att börja skära en 2 mm stans i eklöv.
- Placera provet i 20 pl spädningsbuffert medföljer Phire växt direkt PCR Kit. Rengör skäregg tillika skärmatta som tidigare.
- Krossa blad provet med en 100 ul pipettspets genom att trycka kort mot rörväggen. Beroende på växtmaterial arbetar utspädning protokollet ibland bättre utan att krossa provet.
- Snurra proverna kort i en mikrocentrifug till than reaktionerna är i botten av rören.
- Supernatanten kan användas direkt i PCR, eller det kan spädas 1:10 eller 1:100 i sterilt vatten beroende på provtyp. Använd 0,5 pl till 1 pl av supernatanten eller utspädning som en mall för en 20 pl PCR-reaktion. Bered reaktionen som beskrivs i tabell 1.
- När reaktionerna framställes, använda en Thermo Scientific Piko 24-brunnars Thermal Cycler och Thermo Scientific Piko PCR-platta för att utföra PCR-reaktioner med användning av de cykling som beskrivits i tabell 2. PCR-reaktionerna kan även utföras i konventionella PCR termocykliska.
- Efter PCR, tillsätt 5 il 5x laddningsbuffert till reaktionen och utföra agarosgelelektrofores med 15 ul av den resulterande blandningen.
3. Genotypning av transgena möss med hjälp av Utspädning protokollet
- Börja utspädning protokollet om transgena möss genom att placera en 2 mm stans av mOuse öra 20 ul utspädningsbuffert innehållande 0,5 pl DNARelease Tillsats medföljer Phire djurvävnad Direkt PCR-kit.
- Inkubera proverna vid rumstemperatur under 2 min, följt av 2 min inkubation vid 98 ° C.
- Snurra proverna kort i en mikrocentrifug tills reaktionerna är i botten av rören.
- Använd 1 il supernatant som mall för en 20 pl PCR-reaktion, framställd såsom beskrivits i tabell 3. Varje överstående som inte skall användas direkt kan överföras till ett nytt rör och lagrades vid -20 ° C.
- Därefter anställa en Thermo Scientific Piko 24-väl termocyklern och Thermo Scientific Piko PCR tavla att utföra PCR-reaktioner med hjälp av cykling villkor som beskrivs i tabell 4. Återigen kan PCR-reaktionerna även genomföras i konventionella PCR cyclers.
- Efter PCR, tillsätt 5 il 5x laddningsbuffert till reaktionen och utföra agarosgelelektrofores wte 15 | il av den resulterande blandningen.
4. Representativa resultat
I dCAPS tekniken restriktionsstället inom SNP av intresse antingen introduceras eller förstörs med en PCR-primer med en eller flera felmatchningar till mål-DNA. Genotypning av Arabidopsis växter individer utfördes med dCAPS tekniken direkt från blad slag. De amplifierade produkterna digererades och de resulterande fragmenten avslöjar genotypen för varje individ analyserades genom gelelektrofores (figur 2).
I detta exempel, har de 160 bp PCR-produkter innehållande SNP stället av intresse (G eller A allel) i Arabidopsis-genomet amplifieras från stansar växters blad med Phire växt Direkt PCR-kit. Den framåtriktade primern innehöll en felpaming vid 3-änden, skapar en Sspl-specifikt restriktionsställe i mål-DNA, vilket inkluderade SNP av intresse (A-allelen) men intei den andra allelen av SNP (figur 2B).
Utspädning protokoll är nödvändiga för utmanande växtmaterial, såsom ek blad, på grund av dess höga koncentration av fenolföreningar. Använda utspädning protokollet beskrivs här var 297 bp-fragmentet av kloroplast-DNA förstärks med 3-stegs protokoll. Oakleafen prover med olika utspädningar visas i fig. 3, förutom positiva och negativa kontroller.
Den Phire djurvävnad Direkt PCR-kit användes med en utmanande protokoll där endast en primeruppsättning användes för amplifiering av två fragment med en stor storleksskillnad, vilket resulterar i rikliga utbyten av båda korrekt storlek produkter av 1.500 bp för transgena möss och 200 bp för möss av vildtyp (figur 4). Den svagare övre bandet med heterozygota möss beror på konkurrensen från de båda mallar (alleler) för samma primerpar, men det genotypning resultaten är entydiga.
Stabiliteten hos proverna som framställts med användning av utspädning protokollet testades också. Resultaten visar att utspädningen proven kan förvaras vid -20 ° C under minst ett år. Dessutom har upprepad frysning / upptiningscykler inte signifikant påverkar reaktionen (Figur 5). Vidare visas den robusta amplifieringen från vävnad musöra prover med Phire DNA-polymeras och den Direkt PCR-metoden jämfört med varmstart Taq-polymeras och renat DNA (figur 6).
| Komponenter | 20 il reaktion | 50 pl reaktion | Slutlig konc. |
| H 2 O | lägg till 20 pl | lägg till 50 ul | |
| 2x Phire växt PCR-buffert | 10 il | 25 il | 1x |
| primer A | X ul | X ul | 0,5 pM |
| primer B | X ul | X ul | 0,5 pM |
| Phire Hot Start II DNA-polymeras | 0,4 pl | 1 il | |
| Prov / direkt protokoll | 0,50 mm stans | ||
| Prov / utspädning protokoll | 0,5-1 ul |
Tabell 1. Reaktionsbetingelser för växt-PCR används i detta protokoll.
| Cykel Steg | Temp. | Tid | Cykler |
| Initial denaturering | 98 ° C | 5 minuter | 1 |
| Denaturering Glödgning * Förlängning | 98 ° C X ° C 72 ° C | 5 sek 5 sek 20 sek | 40 |
| Slutlig förlängning | 72 ° C 4 ° C | 1 minut håll | 1 |
Tabell 2. Cykling villkor för växt-PCR används i detta protokoll.
* Tm kalkylator vidoscientific.com / pcrwebtools "target =" _blank "är> www.thermoscientific.com / pcrwebtools rekommenderas vid fastställandet av Tm för primrar för att användas med Phire Hot Start II DNA-polymeras. Rekommenderad härdningstemperaturen för primers ≤ 20 nt är lika med den nedre Tm ges av WebTool. för primrar> 20 nt, använda en glödgningstemperatur 3 ° C högre än den lägre Tm ges av WebTool.
| Komponenter | 20 il reaktion | Slutlig konc. |
| H 2 O | lägg till 20 pl | |
| 2x Phire djurvävnad PCR-buffert | 10 il | 1x |
| primer A | X ul | 0,5 pM |
| primer B | X ul | 0,5 pM |
| Phire Hot Start II DNA-polymeras | 0,4 pl | |
| Prov / utspädning protokoll | 1 il |
Tabell 3. Reaktionsbetingelser för djurvävnad PCR används i detta protokoll.
| Cykel Steg | Temp. | Tid | Cykler |
| Initial denaturering | 98 ° C | 5 minuter | 1 |
| Denaturering Glödgning * Förlängning | 98 ° C X ° C 72 ° C | 5 sek 5 sek 20 sek ≤ 1 kb 20 sek / kb> 1 kb | 40 |
| Slutlig förlängning | 72 ° C 4 ° C | 1 minut Håll | 1 |
Tabell 4. Cykling villkor för djurvävnad PCR används i detta protokoll.
* Den Tm kalkylator på www.thermoscientific.com / pcrwebtools rekommenderas vid fastställandet av Tm för primrar för att användas med Phire Hot Start II DNA-polymeras. Den rekommenderade härdningstemperaturen för primrar ≤ 20 nt är lika med den nedre Tm ges av WebTool. För primers> 20 nt, använd en hybridiseringstemperatur 3 ° C högre än den lägre Tm ges av WebTool.
Figur 1. Direkt PCR-arbetsflöde. Direkt PCR kan utföras med användning av två alternativa protokoll. I den direkta protokollet en liten mängd av provet tillsätts direkt till datornR-reaktion. Utspädningen Protokollet använder en kort förinkubation steget före PCR för att frisätta DNA från provmaterialet.
Figur 2. Genotypning av Arabidopsis växter personer med dCAPS teknik direkt från blad slag. A) Figur 2A visar principen för dCAPS analysen utförs. Restriktionsstället inom SNP av intresse antingen införs eller avlägsnas genom PCR med användning av en primer med en eller flera felmatchningar till mål-DNA. PCR-produkterna digereras och de resulterande fragmenten avslöjar genotypen för varje individ vid analys genom elektrofores. B) 0,50 mm stansar från växtblad placerades direkt i 50 pl PCR-reaktioner. De 160 bp PCR-produkter innehållande SNP platsen (G eller A allel) amplifierades med primrar införa ett unikt Sspl plats till A-allelen. De orenade PCR-produkterna var rötningTed med Sspl restriktionsenzym. Resulterande fragmenten analyserades på en 3% agarosgel. Spår M är storleksmarkör, spår A och G motsvarar SNP alleler av varje prov. De erhållna resultaten bekräftades genom konventionell analys av DNA-extraktion följt av PCR och restriktionsdigestion (data ej visade). Den negativa kontrollen reaktioner utan mall-DNA ingick i test starta och driva på en separat agarosgel parallellt med de faktiska PCR-reaktioner innan du utför digereringar (data visas ej).
Figur 3. Utspädning protokoll med prover eklöv. Utspädnings protokoll användes för att förstärka 297 bp-fragmentet av kloroplast DNA i eklöv prover (3-steg protokoll, glödgning vid 62 ° C) vid olika spädningar (1:100, 1:10, 1 : 1 och 2:1) och positiva och negativa kontroller [C +: positiv kontroll från renat DNA (Arabidopsis), C-: negativ kontroll utan mall-DNA]. Provet nomenklatur representerar platsen provsamling (städer i Finland) och provet numreringen.
Figur 4. Genotypning av transgena möss med en primerpar med utspädning protokollet. Ear vävnader av nio enskilda möss (spår 1-9) placerades i 20 pl spädningsbuffert inklusive DNARelease Tillsats. Efter inkubation vid rumstemperatur och 98 ° C, 1 | il av supernatanten användes som en mall i 20 | il PCR-reaktionen. Fragment storlekar: 1.500 bp (transgena) och 200 bp (vildtyp).
Figur 5. Prov framställs enligt utspädning protokollet är stabila under långtidsförvaring. Prover av vävnader mus öra var inc ubated i 20 il spädningsbuffert inklusive DNARelease Tillsats och utsattes för upprepad frysning / upptining (spår 1), lagrades vid -20 ° C under ett år (spår 2), eller användes omedelbart för PCR (spår 3). Det förstärkta fragmentet storlekar var 900 bp, 1500 bp och 3200 bp.
Figur 6. Phire djurvävnad direkt PCR Kit överträffar ett kommersiellt system DNA-rening kombinerat med en varm start Taq DNA-polymeras. Fyra amplikoner (0,5-1,5 kb) amplifierades från vävnader mus öra med hjälp av utspädning protokollet av Phire djurvävnad direkt PCR Kit. För jämförelse, var DNA först renades med användning av ett kommersiellt kit DNA-extraktion och samma fragment amplifierades med användning av en varmstart Taq DNA-polymeras enligt tillverkarens rekommendationer. Endast med Phire djurvävnad direkt PCR Kit var alla fyra amplikoner framgångsrikt förstärkta.
Figur 7. Universal jämförelse av arbetsflödet med uppskattning gånger / konsumeras reagens. Thermo Scientific direkt PCR metod jämfört med DNA-isolering tillvägagångssätt, Extraktionsbuffert strategi och PCR-buffert strategi. Den beräknade tiden för varje metod innan PCR-steget är listad i röd text. Thermo Scientific direkt PCR metod tar bara 0-4 minuter för provberedning före PCR. Under varje metod de konsumeras reagensen listas. Thermo Scientific direkt PCR metod använder den minsta mängden av reagens i jämförelse med andra metoder. Klicka här för att se större bild .
Discussion
Direct PCR metoden visade här tillåter PCR-amplifiering direkt från små mängder orenade prover, vilket minskar den tid som behövs och förenkla arbetsflödet för växter och djur genotypning (Figur 7). Också visat här är användningen av den spädning protokollet i kombination med Direct PCR-metoden (figur 3). Utspädningen protokoll rekommenderas med svåra prov (t.ex. äldre växtblad, växtarter som innehåller störande föreningar) eller med långa (eller GC-rika) amplikoner. Detta protokoll är särskilt användbar när man startar en ny Direkt PCR-experiment, vilket möjliggör optimering av reaktionen. Protokollet kan fungera som ett verktyg för att hantera tillfälliga svårigheter som låga produktutbyten grund av skillnader i vävnadsmaterial och / eller använda primers. Dessutom när du kör flera reaktioner från samma prov, användning av utspädning protokoll säkerställs hela provet inte konsumeras i enreaktion.
För att rena DNA från växter för PCR var konventionen för att utföra cellys följt av DNA-isolering med olika komponenter som skulle kunna störa PCR-analys 8. För särskilt krävande växter med hög fenol innehåll, tillägg av polyvinylpyrrolidon var traditionellt används för att ta bort de föreningar som binder till DNA efter cellys 2,5. Som framgår här kan dessa komplicerade, tidskrävande steg undvikas genom användning av Phire växt direkt PCR Kit för att detektera mål-DNA. Cellys och DNA steg isolering kan utelämnas med användning av känsliga dCAPS tekniker direkt från Arabidopsis växtblad (figur 2). Som visas här, hanterar utspädning protokollet effektivt förekomsten av problematiska komponenter som kan störa PCR (Figur 3).
Traditionellt var en förutsättning för djur genotypning isolatipå av genomiskt DNA från djurvävnad genom en giftig, tidskrävande process som kännetecknas av en lång inkubation med proteinas K för att smälta hud och bindväv, följt av organiskt lösningsmedelsextraktion, alkoholutfällning, och steg centrifugeringssteg 6,9,10. Såsom visas här, är förenkling av denna process uppnås genom användning av Phire djurvävnaden Direkt PCR-kit, vilket transgena möss skall genotypas utan föregående DNA-rening (figur 4). Exemplet visat i denna artikel är speciellt utmanande då endast en primeruppsättning användes för amplifiering av två fragment med en stor storleksskillnad. Trots att protokollet medfödda svårigheter, användning av direkt PCR metoden i samband med enkla utspädning protokollet resulterade i höga utbyten av de två PCR-produkterna (Figur 4).
PCR-baserad mål-DNA upptäckt har många tillämpningar inom forskning, inklusive genotyp analys för att identifieraroller gener i utveckling, fysiologi och sjukdomar. På grund av inhibitorn tolerans av specialiserade DNA-polymeraser, kan protokollen fyllas i minimal tid utan föregående DNA-rening.
Disclosures
Produktion och fri tillgång till denna artikel är sponsrad av Thermo Fisher Scientific, Inc.
Acknowledgments
För Arabidopsis prover och de berörda PCR primers vi tackar professor Jaakko Kangasjärvi och hans grupp, The Plant Stress Group Växtbiologi, Institutionen för biovetenskaper vid Helsingfors universitet. Experimenten med den traditionella metoden utfördes av Mrs Airi Lamminmäki.
Transgen mus prover från Dr Jaana Vesterinen, institutionen för biomedicin / biokemi vid Helsingfors universitet.
Harris Uni-Core och Harris skärmatta är varumärken som tillhör Shunderson Communications Inc. Alla andra varumärken tillhör i Thermo Fisher Scientific Inc. och dess dotterbolag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phire Plant Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-130 | 200 reactions (50 μl each) |
| Phire Animal Tissue Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-140 | 200 reations (50 μl each) |
| Harris Uni-Core 0.35 mm (pink) | Thermo Fisher Scientific | F-180S/L | Qty: 5/25 |
| Harris Uni-Core 0.50 mm (blue) | Thermo Fisher Scientific | F-185S/L | Qty: 5/25 |
| Harris Cutting Mat 6.4 × 7.6 cm | Thermo Fisher Scientific | F-190 | Qty: 5 |
| SspI | Thermo Fisher Scientific | ER0771 | 100 μl (100 reactions) |
| Piko 24-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | TCP0024 | |
| 24-Well Piko PCR Plates | Thermo Fisher Scientific | SLP0241 | |
| GeneJET PCR Purification Kit |
Thermo Fisher Scientific | K0701 K0702 |
50 preps 250 preps |
References
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin. 19, 11-15 (1987).
- Kim, C. S., Lee, C. H., Shin, J. S., Chung, Y. S., Hyung, N. I. A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP. Nucleic Acids Research. 25, 1085-1086 (1997).
- Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. The Plant Journal. 14, 387-392 (1998).
- Michaels, S. D., Amasino, R. M. A robust method for detecting single-nucleotide changes as polymorphic markers by PCR. The Plant Journal. 14, 381-385 (1998).
- John, M. E. An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics. Nucleic Acids Research. 20, 2381-23 (1992).
- Wang, Z., Storm, D. R. Extraction of DNA from mouse tails. BioTechniques. 41, 410-412 (2006).
- Malumbres, M., Mangues, R., Ferrer, N., Lu, S., Pellicer, A. Isolation of High Molecular Weight DNA for Reliable Genotyping of Mice. BioTechniques. 22, 1114-1119 (1997).
- Yang, Y., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis Leaves Using AnyDirect system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40, 444-447 (2007).
- Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory. , 2nd ed, CSH Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Meldgaard, M., Bollen, P. J. A., Finsen, B. Non-invasive method for sampling and extraction of mouse DNA for PCR. Laboratory Animals. 3, 413-441 (2004).
