Summary
النهج PCR المباشرة المقدمة هنا يسهل PCR التضخيم مباشرة من المصنع كميات صغيرة من أنسجة الحيوانات وغير منقى.
Abstract
النهج PCR التضخيم PCR المباشرة يسهل مباشرة من كميات صغيرة من عينات غير منقى، ويتجلى هنا لمحطة عدة والأنسجة الحيوانية (الشكل 1). ويستند مباشرة PCR على تصميم هندسي خاص Phusion العلمية الحرارية وبلمرة DNA Phire، والتي تشمل مجال الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل الملزمة التي يعطيها خصائص فريدة مثل التسامح عالية من مثبطات.
PCR المستندة إلى الكشف عن الحمض النووي لديها العديد من التطبيقات المستهدفة في مجال البحوث النباتية، بما في ذلك تحليل الوراثي النباتي والتحقق من جينات منقولة. PCR من الأنسجة النباتية ينطوي عادة على عزل الحمض النووي الأولية الخطوة، والتي قد تتطلب الكواشف باهظة الثمن أو السامة. هذه العملية تستغرق وقتا طويلا ويزيد من مخاطر التلوث عبر 1، 2. وعلى العكس، يمكن باستخدام الحرارية العلمية Phire النبات مباشرة PCR كيت يكون الهدف الكشف عن DNA بسهولة، دون استخراج الحمض النووي قبل. في نموذج أثبت هنا، وهويتم تنفيذ مثال المستمدة المشقوق تضخيم تحليل تسلسل متعدد الأشكال (dCAPS) 3،4 مباشرة من أوراق نبتة Arabidopsis. ويمكن استخدام المقايسات dCAPS التنميط الجيني لتحديد الأشكال المتعددة للتركيبات النووية المنفردة (النيوكلوتايد) من أليل محددة SNP تقييد نوكلياز داخلية الهضم 3.
بعض العينات النباتية تميل إلى أن تكون أكثر تحديا عند استخدام أساليب المباشر PCR لأنها تحتوي على المكونات التي تتداخل مع PCR، مثل المركبات الفينولية. في هذه الحالات، يلزم عادة خطوة إضافية لإزالة مركبات 2،5. هنا، يتم التغلب على هذه المشكلة باستخدام بروتوكول التخفيف السريع والسهل PCR التضخيم تليها مباشرة (الشكل 1). وتستخدم خمسة عشر أوراق البلوط عاما نموذجا للتحدي والنباتات العينة تحتوي على كميات عالية من المركبات الفينولية بما في ذلك العفص.
ويستخدم على نطاق واسع نقل الجينات في الفئران لدراسة دور الجينات في development، علم وظائف الأعضاء والأمراض التي تصيب البشر. استخدام هذه الحيوانات يتطلب الكشف عن وجود التحوير، وعادة مع PCR. تقليديا، وهذا ينطوي على الوقت العزلة طويلا DNA خطوة خلالها DNA لتحليل PCR يتم تنقيته من أنسجة الأذن والذيل أو أخمص القدمين 6،7. ومع ذلك، يمكن مع العلم الحرارية الأنسجة الحيوانية Phire المباشر الفئران المعدلة وراثيا PCR كيت أن التنميط الجيني DNA دون تنقية السابقة. في هذا التنميط الجيني بروتوكول الماوس المعدلة وراثيا ويتحقق مباشرة من أنسجة الأذن الماوس، كما يتضح هنا للحصول على سبيل المثال صعبة حيث يتم استخدام مجموعة واحدة فقط التمهيدي لتضخيم اثنين من شظايا مختلفة اختلافا كبيرا في الحجم.
Protocol
1. التنميط الجيني للأفراد نبتة Arabidopsis مع بروتوكول المباشرة
- لبدء الفحص التنميط الجيني dCAPS مباشرة على أوراق النبات arabidopsis، ووضع أول 20 أو 50 ميكرولتر ردود الفعل PCR باستخدام النباتات Phire المباشر PCR كيت كما هو موضح في الجدول 1.
- المقبل، وقطع لكمة مم 0،50 من أوراق نبتة Arabidopsis باستخدام هاريس أحادي النواة وهاريس بساط القطع. عقد الناخس بحزم، اضغط على حافة القطع في الأنسجة وتدوير الناخس ذهابا وإيابا.
- اضغط على المكبس إلى إخراج القرص لكمة إلى خليط التفاعل PCR. تأكد من أن عينة انخفاض في حل PCR ولا التمسك جدران الأنبوب.
- تنظيف حافة القطع من الناخس بين كل عينة لمنع انتقال التلوث عن طريق غمس هو داخل حل NaClO 2٪. اضغط على المكبس صعودا وهبوطا عدة مرات ومسح حافة القطع مع منشفة ورقية نظيفة. ينبغي أن يكون أيضا قطع حصيرةتشطف بين العينات.
- المقبل، توظيف العلم الحرارية Piko 24 Cycler جيدا الحرارية والحرارية العلمية لوحة PCR Piko لأداء تفاعلات PCR باستخدام الدراجات الشروط المبينة في الجدول رقم 2. ويمكن أيضا ردود الفعل PCR أن يؤديها في cyclers التقليدية الحرارية PCR.
- بعد PCR، وتدور باستمرار على المواد النباتية. نقل 5 ميكرولتر من طاف لأنبوب microcentrifuge جديد. إضافة 4 ميكرولتر من الماء و 1 ميكرولتر من تقييد انزيم، SSPI. المزيج بلطف وتدور لفترة وجيزة لأسفل لجمع محتويات في الجزء السفلي من الأنبوب. احتضان خليط التفاعل لمدة ساعة في 37 ° C. تعطيل انزيم التقييد في احتضان C ° 65 لل20 دقيقة.
- عندما تضخيم الحمض النووي مباشرة من الأنسجة النباتية، والمنتجات النباتية وتشمل PCR PCR-مشتقة المكونات التي قد تتداخل مع تقييد انزيم الهضم. لذلك، قد يكون من الضروري لتخفيف إما (مثل 1:2 أو 1:3 في الماء) أو تنقية المنتج PCR قبل رانه الهضم لاحقة، على سبيل المثال عن طريق استخدام مجموعة مناسبة التجارية مثل كيت الحرارية GeneJET العلمية تنقية PCR.
- بعد الهضم انزيم التقييد، وتحليل الشظايا الناجمة على هلام الاغاروز. إضافة 2.5 ميكرولتر من العازلة تحميل 5X إلى رد فعل وأداء الاغاروز الكهربائي للهلام مع 10 ميكرولتر من خليط الناتجة عن ذلك.
2. تضخيم أجزاء محددة من الحمض النووي اوك 15-عاما يغادر باستخدام بروتوكول التخفيف
- لبدء، وقطع لكمة 2 مم ورقة البلوط.
- وضع العينة في 20 ميكرولتر من العازلة التخفيف المرفق مع عدة النبات Phire PCR المباشر. تنظيف حافة القطع من الناخس وقطع حصيرة كما كان من قبل.
- سحق أوراق العينة مع طرف ماصة ميكرولتر 100 عن طريق الضغط عليه لفترة وجيزة ضد الجدار أنبوب. اعتمادا على المواد النباتية، وبروتوكول التخفيف يعمل في بعض الأحيان أفضل ألا يؤثر ذلك على العينة.
- تدور العينات لفترة وجيزة في ميكروسنتريفوج حتى رانه ردود الفعل في الجزء السفلي من الأنابيب.
- ويمكن استخدام طاف مباشرة في PCR، أو يمكن تخفيفه أو 1:100 1:10 في الماء المعقم وفقا لنوع العينة. استخدام 0،5 ميكرولتر إلى 1 ميكرولتر من طاف أو التخفيف كنموذج لتفاعل PCR ميكرولتر 20. إعداد رد الفعل كما هو موضح في الجدول 1.
- مرة واحدة يتم إعداد ردود الفعل، توظيف العلمية الحرارية Piko 24 Cycler جيدا الحرارية والحرارية العلمية لوحة PCR Piko لأداء تفاعلات PCR باستخدام الدراجات الشروط المبينة في الجدول رقم 2. ويمكن أيضا ردود الفعل PCR أن يؤديها في cyclers التقليدية الحرارية PCR.
- بعد PCR، إضافة 5 ميكرولتر من العازلة تحميل 5X إلى رد فعل وأداء الاغاروز الكهربائي للهلام مع 15 ميكرولتر من خليط الناتجة عن ذلك.
3. التنميط الجيني من الفئران المعدلة وراثيا باستخدام بروتوكول التخفيف
- بدء بروتوكول التخفيف على الفئران المعدلة وراثيا عن طريق وضع لكمة 2 مم من م[أوس] الأذن في 20 ميكرولتر من العازلة التخفيف المحتوي على 0.5 ميكرولتر من DNARelease المضافة المتوفرة مع الأنسجة الحيوانية Phire كيت PCR المباشر.
- احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة، تليها الحضانة عند 98 دقيقة 2 ° C.
- تدور العينات لفترة وجيزة في ميكروسنتريفوج حتى ردود الفعل في الجزء السفلي من الأنابيب.
- استخدم 1 ميكرولتر من طاف كقالب للتفاعل PCR ميكرولتر 20، أعدت كما هو موضح في الجدول رقم 3. يمكن نقل أي طاف لا لاستخدامها على الفور لأنبوب جديد وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- المقبل، توظيف العلم الحرارية Piko 24 Cycler جيدا الحرارية والحرارية العلمية لوحة PCR Piko لأداء تفاعلات PCR باستخدام الدراجات الشروط المبينة في الجدول رقم 4. مرة أخرى، يمكن أيضا أن ردود الفعل PCR أن يؤديها في cyclers PCR التقليدية.
- بعد PCR، إضافة 5 ميكرولتر من العازلة تحميل 5X إلى رد فعل وأداء الاغاروز هلام الكهربائي ثإيث 15 ميكرولتر من خليط الناتجة عن ذلك.
4. ممثل النتائج
في هذه التقنية هو عرض dCAPS إما تقييد موقع داخل SNP في المصالح أو دمرت باستخدام PCR التمهيدي مع واحد أو أكثر إلى عدم التطابق DNA الهدف. تم إجراء التنميط الجيني للأفراد نبتة Arabidopsis مع تقنية dCAPS مباشرة من اللكمات ورقة. تم هضمها المنتجات تضخيمها وتم تحليل الشظايا الناجمة الكشف عن التركيب الوراثي لكل فرد من هلام الكهربائي (الشكل 2).
في هذا المثال، تم تضخيم ال 160 BP المنتجات PCR يحتوي على موقع SNP من الفائدة (G أو أليل A) في الجينوم ل arabidopsis من اللكمات أوراق النبات مع مجموعة النباتات Phire PCR المباشر. الواردة التمهيدي واحدة إلى الأمام عدم تطابق في نهاية 3 '، إنشاء موقع تقييد SSPI محددة في DNA الهدف، والتي تضمنت تهم SNP (A أليل) ولكن ليسفي أليل أخرى من SNP (الشكل 2B).
البروتوكولات اللازمة لتخفيف المواد النباتية صعبة، مثل ورقة البلوط، وذلك بسبب تركيز عال من المركبات الفينولية. وباستخدام بروتوكول التخفيف الموصوفة هنا، تضخيم جزء BP 297 من البلاستيدات الخضراء DNA باستخدام بروتوكول 3-الخطوة. وتظهر عينات نبات البلوط مع التخفيفات مختلفة في الشكل 3، بالإضافة إلى الضوابط الإيجابية والسلبية.
كان يعمل في الأنسجة الحيوانية Phire المباشر PCR كيت مع بروتوكول صعبة حيث تم استخدام مجموعة واحدة فقط التمهيدي لتضخيم اثنين من شظايا مع اختلاف الحجم الكبير، مما أدى إلى غلة وفيرة من كل من المنتجات الحجم بشكل صحيح من 1،500 شركة بريتيش بتروليوم للالفئران المعدلة وراثيا وBP 200 ل الفئران البرية نوع (الشكل 4). الأضعف الشريط العلوي مع الفئران متغايرة ويرجع ذلك إلى المنافسة من كل من القوالب (الأليلات) للزوج نفسه التمهيدي، إلا أن genotypالنتائج جي هي لا لبس فيها.
كما تم اختبار استقرار عينات أعدت باستخدام بروتوكول التخفيف. وأظهرت النتائج التي يمكن تخزينها على عينات التخفيف في -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن سنة. وعلاوة على ذلك، لم تتكرر تجميد / الذوبان دورات لا تؤثر تأثيرا كبيرا على رد الفعل (الشكل 5). أظهرت أيضا هو التضخيم قوية من عينات الأنسجة الماوس الأذن باستخدام البلمرة DNA Phire وطريقة PCR المباشر مقارنة الساخن بداية طق بوليميريز وتنقية DNA (الشكل 6).
| مكونات | 20 ميكرولتر رد فعل | 50 ميكرولتر رد فعل | اضرب النهائي. |
| H 2 O | إضافة إلى 20 ميكرولتر | إضافة إلى 50 ميكرولتر | |
| 2X Phire النبات PCR العازلة | 10 ميكرولتر | سعة 25 ميكرولتر | 1X |
| A التمهيدي | ميكرولتر X | ميكرولتر X | 0.5 ميكرومتر |
| B التمهيدي | ميكرولتر X | ميكرولتر X | 0.5 ميكرومتر |
| Phire الساخن DNA II البداية البلمرة | 0،4 ميكروليتر | 1 ميكرولتر | |
| عينة / بروتوكول مباشرة | 0.50 ملم لكمة | ||
| عينة / التخفيف بروتوكول | 0،5-1 ميكرولتر |
الجدول 1. تستخدم لظروف التفاعل PCR النباتية في هذا البروتوكول.
| دورة الخطوة | TEMP. | مرة | دورات |
| الأولي تمسخ | 98 ° C | 5 دقائق | 1 |
| يبدل طبيعة * الصلب تمديد | 98 ° C X ° C 72 ° C | 5 ثانية 5 ثانية 20 ثانية | 40 |
| ملحق النهائي | 72 ° C 4 ° C | 1 دقيقة عقد | 1 |
الجدول 2. استخدام الدراجات لظروف PCR النباتية في هذا البروتوكول.
* آلة حاسبة تيم فيoscientific.com / pcrwebtools "الهدف =" _blank "ويوصى> www.thermoscientific.com / pcrwebtools عند تحديد تيم للالاشعال لاستخدامه مع البلمرة DNA Phire بداية ساخنة II. درجة الحرارة الموصى بها للالاشعال الصلب ≤ 20 NT يساوي الدنيا التي قدمها تيم webtool. ل NT الاشعال> 20، استخدم درجة حرارة الصلب 3 ° C أعلى من أقل تيم التي قدمها webtool.
| مكونات | 20 ميكرولتر رد فعل | اضرب النهائي. |
| H 2 O | إضافة إلى 20 ميكرولتر | |
| 2X الأنسجة الحيوانية Phire PCR العازلة | 10 ميكرولتر | 1X |
| A التمهيدي | ميكرولتر X | 0.5 ميكرومتر |
| B التمهيدي | ميكرولتر X | 0.5 ميكرومتر |
| فتاهغضب ساخن DNA II البداية البلمرة | 0،4 ميكروليتر | |
| عينة / التخفيف بروتوكول | 1 ميكرولتر |
الجدول 3. تستخدم لظروف التفاعل الحيوانية الأنسجة PCR في هذا البروتوكول.
| دورة الخطوة | TEMP. | مرة | دورات |
| الأولي تمسخ | 98 ° C | 5 دقائق | 1 |
| يبدل طبيعة * الصلب تمديد | 98 ° C X ° C 72 ° C | 5 ثانية 5 ثانية 20 ثانية ≤ 1 كيلو بايت 20 ثانية / ك> 1 كيلو بايت | 40 |
| ملحق النهائي | 72 ° C 4 ° C | 1 دقيقة عقد | 1 |
الجدول 4. ظروف ركوب الدراجات الحيوانية الأنسجة PCR المستخدمة في هذا البروتوكول.
* آلة حاسبة تيم في www.thermoscientific.com / pcrwebtools ينصح عند تحديد تيم للالاشعال لاستخدامه مع البلمرة DNA Phire بداية ساخنة II. درجة الحرارة الموصى بها للالاشعال الصلب ≤ 20 NT يساوي أقل تيم التي قدمها webtool. لNT الاشعال> 20، استخدم درجة حرارة الصلب 3 ° C أعلى من أقل تيم التي قدمها webtool.
الشكل 1. لا يمكن أن يؤديها مباشرة PCR سير العمل. مباشرة باستخدام PCR بروتوكولين البديلة. في البروتوكول مباشرة يتم إضافة كمية ضئيلة من العينة مباشرة إلى PCR التفاعل. بروتوكول يستخدم تخفيف وجيزة قبل الحضانة الخطوة قبل PCR للافراج عن الحمض النووي من مادة العينة.
الشكل 2. التنميط الجيني للأفراد نبتة Arabidopsis مع تقنية dCAPS مباشرة من اللكمات ورقة. A) ويبين الشكل 2A مبدأ الفحص dCAPS تنفيذها. هو عرض إما تقييد موقع داخل SNP في المصالح أو إزالتها عن طريق PCR باستخدام التمهيدي مع واحد أو أكثر إلى عدم التطابق DNA الهدف. يتم هضمها المنتجات PCR والشظايا الناجمة الكشف عن التركيب الوراثي لكل فرد عند تحليلها من قبل الكهربائي. B) وضعت اللكمات مم 0،50 من أوراق النبات مباشرة في 50 ميكرولتر ردود الفعل PCR. وتضخمت ال 160 BP المنتجات PCR يحتوي على موقع SNP (G أو أليل A) مع الاشعال إدخال موقع SSPI فريدة من نوعها لأليل-A. كانت المنتجات غير منقى PCR digesتيد مع انزيم تقييد SSPI. وقد تم تحليل الشظايا الناجمة عن مادة هلامية الاغاروز 3٪. حارة M هي علامة الحجم؛ الممرات وG A تتوافق مع الأليلات SNP من كل عينة. تم تأكيد النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق تحليل الحمض النووي لاستخراج التقليدية تليها PCR والهضم تقييد (لا تظهر البيانات). وشملت ردود الفعل السلبية من دون السيطرة DNA القالب في اختبار انشاء وتشغيل على هلام الاغاروز منفصلة بالتوازي مع ردود الفعل PCR الفعلية قبل تنفيذ الهضم (المعطيات غير معروضة).
الشكل 3. بروتوكول التخفيف باستخدام عينات أوراق البلوط. تم استخدام بروتوكول تخفيف لتضخيم جزء BP 297 من البلاستيدات الخضراء في عينات DNA أوراق البلوط (3-الخطوة البروتوكول، في الصلب C ° 62) في التخفيفات مختلفة (1:100، 1:10، 1 : 1 و 2:1) ويخدع الإيجابية والسلبيةمفاتيح التحكم [C +: مراقبة إيجابية من DNA المطهرون (ل arabidopsis)، C-: المراقبة السلبية مع عدم وجود قالب DNA]. التسميات عينة تمثل موقع جمع العينات (المدن في فنلندا) وعينة الترقيم.
الشكل 4. وضعت التنميط الجيني من الفئران المعدلة وراثيا مع الزوج التمهيدي واحد باستخدام بروتوكول التخفيف. الأنسجة الأذن من تسعة الفئران الفردية (الممرات 1-9) في 20 ميكرولتر من العازلة بما في ذلك التخفيف المضافة DNARelease. بعد حضانات في درجة حرارة الغرفة و 98 درجة مئوية، وقد استخدم 1 ميكرولتر من طاف كقالب في رد فعل 20 ميكرولتر PCR. أحجام جزء: 1،500 بي بي (المعدلة وراثيا) و 200 BP (wildtype).
الشكل 5. إعداد العينات وفقا لبروتوكول التخفيف مستقرة للتخزين على المدى الطويل. عينات من أنسجة الأذن الماوس والمؤتمر الوطني العراقي ubated في 20 ميكرولتر من العازلة بما في ذلك التخفيف المضافة DNARelease وتعرض للتجميد المتكررة / ذوبان (حارة 1)، المخزنة في -20 ° C لمدة عام (حارة 2)، أو استخدامها على الفور لPCR (حارة 3). وكانت أحجام جزء تضخيم 900 شركة بريتيش بتروليوم، BP BP 1،500 و 3،200.
الشكل 6. Phire الحيوانية الأنسجة مباشرة PCR كيت يتفوق على تنقية DNA التجارية جنبا إلى جنب مع نظام البلمرة DNA بداية ساخنة طق. وتضخمت أربع amplicons (0،5-1،5 KB) من أنسجة الأذن الماوس باستخدام بروتوكول التخفيف من كيت Phire الأنسجة الحيوانية PCR المباشر. على سبيل المقارنة، كان تنقية DNA 1 باستخدام استخراج DNA التجارية وعدة شظايا وتضخمت نفسه باستخدام ساخنة DNA بوليميراز بداية طق وفقا لتوصيات الصانعين. فقط مع أنسجة الحيوانات Phire كيت PCR المباشرة كانت كلها amplicons 4 تضخيم بنجاح.
الشكل 7. مقارنة العالمي لسير العمل مع تقدير مرات / الكواشف المستهلكة. تتم مقارنة الحرارية العلمية نهج PCR DNA مباشرة إلى نهج العزلة، والنهج العازلة استخراج، والنهج العازلة PCR. يتم سرد الوقت المقدر لكل نهج الخطوة قبل PCR في النص الأحمر. النهج العلمي الحرارية PCR المباشر يستغرق سوى 0-4 دقائق لإعداد العينات قبل PCR. كل أسلوب أدناه، يتم سرد الكواشف المستهلكة. النهج العلمي الحرارية المباشرة PCR يستخدم أقل قدر من الكواشف بالمقارنة مع الطرق الأخرى. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
Discussion
النهج PCR المباشر أثبتت هنا لتضخيم PCR يسمح مباشرة من كميات صغيرة من عينات غير منقى، والحد من الوقت اللازم وتبسيط سير العمل لمحطة والتنميط الجيني الحيوانية (الشكل 7). أظهرت أيضا هنا هو استخدام بروتوكول التخفيف في تركيبة مع النهج PCR المباشر (الشكل 3). ويوصى بروتوكول التخفيف مع عينات من الصعب (على سبيل المثال أوراق عمر النبات، والأنواع النباتية التي تحتوي على مركبات التدخل) أو مع amplicons (GC أو الغنية) لفترة طويلة. هذا البروتوكول هو مفيدة بشكل خاص عند بدء التجربة الجديدة PCR مباشرة، مما يسمح لتعظيم الاستفادة من رد الفعل. يمكن للبروتوكول أن تكون بمثابة أداة لمعالجة الصعوبات في بعض الأحيان مثل إنتاجية منخفضة المنتج بسبب الاختلافات في المواد الأنسجة و / أو الاشعال المستخدمة. وعلاوة على ذلك، عند تشغيل ردود فعل متعددة من نفس العينة، واستخدام بروتوكول يضمن التخفيف لا تستهلك كامل العينة في واحدةرد الفعل.
وكانت الاتفاقية من أجل تنقية DNA من النباتات لPCR، لأداء تحلل الخلايا تليها عزل الحمض النووي باستخدام المكونات المختلفة التي يمكن أن تتداخل مع تحليل PCR يحتمل 8. لمحطات خاصة مع تحدي محتوى الفينول عالية، إضافة polyvinylpyrrolidone كان يستخدم تقليديا لإزالة المركبات التي ربط DNA بعد تحلل الخلايا 2،5. كما هو واضح هنا، يمكن تجنب هذه معقدة وتستغرق وقتا مكثفة الخطوات من خلال استخدام النباتات Phire كيت PCR المباشرة للكشف عن الحمض النووي المستهدف. ويمكن إهماله تحلل الخلايا والخطوات عزل الحمض النووي باستخدام تقنيات dCAPS الحساسة مباشرة من أوراق نبتة Arabidopsis (الشكل 2). كما هو موضح هنا، وبروتوكول التخفيف تدير بشكل فعال وجود عناصر إشكالية التي يمكن أن تتداخل مع PCR (الشكل 3).
تقليديا، كان شرطا أساسيا لالتنميط الجيني الحيواني isolatiعلى من الحمض النووي الجيني من أنسجة الحيوانات السامة من خلال عملية تستغرق وقتا طويلا، تتميز الحضانة مطولة مع K بروتين الجلد لهضم والنسيج الضام، تليها الاستخلاص بالمذيبات العضوية، وهطول الأمطار الكحول، والخطوات الطرد المركزي 6،9،10. كما أظهر هنا، ويتحقق تبسيط هذه العملية من خلال استخدام الأنسجة الحيوانية Phire كيت PCR مباشرة، مما يسمح التنميط الجيني الفئران المعدلة وراثيا دون تنقية DNA السابقة (الشكل 4). المثال موضح في هذه المقالة يمثل تحديا لا سيما فيما كان يستخدم مجموعة واحدة فقط التمهيدي لتضخيم اثنين من شظايا مع اختلاف الحجم الكبير. على الرغم من صعوبة البروتوكول الفطرية، واستخدام نهج PCR المباشر بالتزامن مع بروتوكول تخفيف بسيط أدى إلى عوائد عالية من المنتجات PCR اثنين (الشكل 4).
PCR المستندة إلى الكشف عن الحمض النووي المستهدف العديد من التطبيقات في مجال البحوث، بما في ذلك تحليل لتحديد النمط الجينيأدوار الجينات في علم وظائف الأعضاء، وتطوير والمرض. بسبب التسامح المانع للبلمرة DNA المتخصصة، يمكن الانتهاء من البروتوكولات في أقصر وقت ممكن دون تنقية DNA السابقة.
Disclosures
ويرعى الإنتاج وحرية الوصول إلى هذه المقالة عن طريق شركة فيشر الحرارية والعلم
Acknowledgments
لعينات ل arabidopsis والمعنية الاشعال PCR نشكر الأستاذ جاكو Kangasjärvi وجماعته، والإجهاد مجموعة نباتية، بيولوجيا النبات، قسم العلوم البيولوجية، جامعة هلسنكي. التجارب كانت تجرى مع الطريقة التقليدية السيدة Airi Lamminmäki.
وقدمت عينات الماوس المعدلة وراثيا من قبل الدكتورة جانا Vesterinen، معهد الطب الحيوي / الكيمياء الحيوية، جامعة هلسنكي.
هاريس أحادي النواة وقطع بساط هاريس هي علامات تجارية لشركة الاتصالات Shunderson جميع العلامات التجارية الأخرى هي ملك لشركة فيشر العلمية الحرارية والشركات التابعة لها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phire Plant Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-130 | 200 reactions (50 μl each) |
| Phire Animal Tissue Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-140 | 200 reations (50 μl each) |
| Harris Uni-Core 0.35 mm (pink) | Thermo Fisher Scientific | F-180S/L | Qty: 5/25 |
| Harris Uni-Core 0.50 mm (blue) | Thermo Fisher Scientific | F-185S/L | Qty: 5/25 |
| Harris Cutting Mat 6.4 × 7.6 cm | Thermo Fisher Scientific | F-190 | Qty: 5 |
| SspI | Thermo Fisher Scientific | ER0771 | 100 μl (100 reactions) |
| Piko 24-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | TCP0024 | |
| 24-Well Piko PCR Plates | Thermo Fisher Scientific | SLP0241 | |
| GeneJET PCR Purification Kit |
Thermo Fisher Scientific | K0701 K0702 |
50 preps 250 preps |
References
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin. 19, 11-15 (1987).
- Kim, C. S., Lee, C. H., Shin, J. S., Chung, Y. S., Hyung, N. I. A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP. Nucleic Acids Research. 25, 1085-1086 (1997).
- Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. The Plant Journal. 14, 387-392 (1998).
- Michaels, S. D., Amasino, R. M. A robust method for detecting single-nucleotide changes as polymorphic markers by PCR. The Plant Journal. 14, 381-385 (1998).
- John, M. E. An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics. Nucleic Acids Research. 20, 2381-23 (1992).
- Wang, Z., Storm, D. R. Extraction of DNA from mouse tails. BioTechniques. 41, 410-412 (2006).
- Malumbres, M., Mangues, R., Ferrer, N., Lu, S., Pellicer, A. Isolation of High Molecular Weight DNA for Reliable Genotyping of Mice. BioTechniques. 22, 1114-1119 (1997).
- Yang, Y., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis Leaves Using AnyDirect system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40, 444-447 (2007).
- Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory. , 2nd ed, CSH Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Meldgaard, M., Bollen, P. J. A., Finsen, B. Non-invasive method for sampling and extraction of mouse DNA for PCR. Laboratory Animals. 3, 413-441 (2004).
