Summary
这里提出的直接PCR方法便于直接从少量的未精制的植物和动物组织的PCR扩增。
Abstract
的直接PCR方法有利于PCR扩增直接从少量未纯化的样品，这里用于表明几种植物和动物组织（ 图1）。直接PCR的基础上特别设计的赛默飞世尔科技Phusion Phire DNA聚合酶，其中包括双链DNA结合结构域，使他们独特的性能，如高耐受性抑制剂。
PCR为基础的目标DNA检测在植物研究中有许多应用，包括转基因植株基因型分析和验证。传统的PCR方法从植物组织中涉及的初始DNA分离步骤，这可能需要昂贵的或有毒的试剂。该过程是耗时的，并增加1，2的交叉污染的风险。相反，通过使用Thermo Scientific的Phire植物直接PCR试剂盒目标DNA可以被容易地检测到，没有现有的DNA提取。在该模型中表现出在这里，例如来自裂解的扩增多态性序列分析（dCAPS特异性）3,4进行直接从拟南芥的植物的叶子。可以使用dCAPS特异性基因分型分析，以确定由SNP等位基因特异的限制性核酸内切酶消化3的单核苷酸多态性（SNP）。
某些植物样品往往是更具挑战性的，当使用直接PCR方法，因为它们含有干扰PCR的组件，如酚类化合物。在这些情况下，需要一个额外的步骤，以除去该化合物是传统2,5。在这里，此问题被克服，通过使用一个快速和容易的稀释随后通过直接PCR扩增（ 图1）的协议。作为一个具有挑战性的植物模型的样本含有大量的酚类物质，包括单宁酸，十五年的老橡树叶。
进行基因转移到小鼠中被广泛用于在开发与研究的作用的基因pment，生理与人类疾病。这些动物的使用需要筛选的转基因的存在，通常用PCR。传统上，这涉及一个耗时的DNA分离步骤中，在此期间，用于PCR分析的DNA纯化从耳，尾或脚趾组织6,7。然而，赛默飞世尔科技Phire动物组织直接PCR试剂盒的转基因小鼠进行基因分型，恕不另行DNA纯化。实现此协议中的转基因小鼠的基因分型的直接从小鼠耳组织，如这里用于显示其中只有一个引物组，用于扩增两个片段的大小差别很大的一个挑战性例子。
Protocol
1。 拟南芥植物个体基因分型与直接议定书
- 要开始dCAPS特异性的基因分型检测，直接在拟南芥的植物叶，首先制订20或50μl的PCR反应使用的Phire的植物直接PCR试 剂盒如表1中描述的。
- 其次，从拟南芥叶以Harris Uni-CORE核心和哈里斯切割垫削减了0.50毫米打孔。牢牢握住冲床，按切削刃的组织和穿孔机来回旋转。
- 按柱塞喷射冲头的PCR反应混合物的光盘插入。确保样本落入PCR溶液，不会粘到管壁。
- 清洁的前沿之间的冲床，每个样品到2％次氯酸钠溶液浸渍，以防止交叉污染。按柱塞上下几次，用干净的纸巾擦拭的最前沿。切割垫也应该样品之间的冲洗。
- 其次，采用了Thermo Scientific的PIKO的24孔热循环仪和赛默飞世尔科技PIKO PCR板进行PCR反应，使用表2中描述的循环条件。也可以在传统的PCR热循环仪进行PCR反应。
- PCR后，自旋向下的植物材料。 5微升上层清液转移到新的微量离心管中。加入4μl的水和1微升限制性内切酶，引入SspI。轻轻混匀后短暂离心管的底部收集内容。孵育一小时将反应混合物在37℃下的限制性内切酶失活，在65℃下孵育20分钟。
- 当扩增的DNA直接从植物组织中，将PCR产物包括厂房及PCR衍生的组成部分，可能会干扰用限制性消化酶。因此，它可能是必要的，以稀释（ 例如，在水中的1:2或1:3），或纯化的PCR产物之前吨他随后的消化，例如，通过使用一个合适的商业化试剂盒如Thermo Scientific GeneJET PCR Purification Kit纯化。
- 限制性内切酶消化后，得到的片段在琼脂糖凝胶上进行分析。 2.5微升5×加样缓冲液加入到反应，并进行琼脂糖凝胶电泳所得到的混合物与10μl。
2。从15岁的老橡树叶扩增特定DNA片段用稀释协议
- 开始的橡树叶，切成2毫米的打孔。
- 将样品的的Phire电厂直接PCR试剂盒提供的稀释液为20μL。清洁尖端的冲床和切割垫和以前一样。
- 叶样品粉碎，用100微升移液器吸头按它简单地对管壁。根据不同的植物材料，稀释协议有时效果更好而不破碎的样本。
- 短暂地旋转样品中微量直到t他的反应是在管的底部。
- 将上清液可以直接使用，在PCR中，或者它可以稀释在无菌水中1:10或1:100取决于关于样品类型。使用0.5μl到1微升上清液或稀释作为一个20微升的PCR反应的模板。准备如表1中所述的反应。
- 一旦反应的准备，采用了Thermo Scientific的PIKO的24孔热循环仪和赛默飞世尔科技PIKO PCR板进行PCR反应，使用表2中描述的循环条件。也可以在传统的PCR热循环仪进行PCR反应。
- 在PCR后，对反应中添加5μl的5×加样缓冲液，并用15μl的所得到的混合物进行琼脂糖凝胶电泳。
3。使用稀释协议的转基因小鼠的基因分型
- 转基因小鼠放置一个2毫米的打孔的M开始稀释的协议乌斯含0.5μL的DNARelease添加剂提供，与Phire动物组织直接PCR试剂盒的稀释液在20μl的耳朵。
- 样品在室温下孵育2分钟，然后在98℃下孵育2分钟
- 在微量短暂旋转样品，直到反应是在管的底部。
- 使用1μl的上清液为20微升的PCR反应中，作为模板，如表3中所述的方法制备。任何上清液是不被马上使用，可以被转移到新的试管中，并储存于-20℃下
- 其次，采用了Thermo Scientific的PIKO的24孔热循环仪和赛默飞世尔科技PIKO PCR板进行PCR反应，使用表4中所述的循环条件。同样，也可以进行PCR反应，在传统的PCR循环仪。
- 进行PCR，对反应中添加5μl的5×加样缓冲液，并进行琼脂糖凝胶电泳瓦特第i个15微升所得的混合物。
4。代表性的成果
在dCAPS特异性技术的限制性位点内的SNP的利益要么是使用与一个或多个错配的靶DNA的PCR引物引入或销毁。直接从叶拳dCAPS特异性技术的拟南芥植物个体进行基因分型。的扩增产物进行消化，并揭示每个个体的基因型产生的碎片，用凝胶电泳分析（ 图2）。
的160 bp的PCR产物在拟南芥基因组中含有景点的SNP位点（G或A等位基因）在这个例子中，从植物叶冲头与Phire电厂直接PCR试 剂盒进行扩增。的正向引物在3'端包含一个不匹配，创建一个SspI特定的限制位点中的目标DNA，其中包括的利益的SNP（A等位基因），但不在其他等位基因的SNP（ 图2B）。
稀释协议是必要的具有挑战性的植物材料，如橡树叶，由于其高浓度的酚类化合物。用这里描述的稀释协议，297 bp的叶绿体的DNA片段的扩增使用3步骤的协议。橡树叶标本与不同稀释度的图3中所示，除了对阳性和阴性对照。
Phire动物组织直接PCR试剂盒采用一个具有挑战性的协议，其中只有一个引物组扩增两个片段被用于具有大尺寸的差异，导致在丰富的产量为1,500 bp的转基因小鼠和200 bp的正确尺寸的产品野生型小鼠（ 图4）。杂合子小鼠较弱的上部带是由于这两个模板（等位基因）的相同的引物对的竞争，但是，genotypING的结果是明确的。
使用稀释协议制备的样品的稳定性进行了测试。结果表明，稀释样品，可以存储在-20℃下为至少一年。此外，反复冷冻/解冻循环没有显着影响的反应（ 图5）。还示出的是稳健的扩增使用Phire DNA聚合酶和热启动 Taq聚合酶和纯化的DNA（ 图6）相比的直接PCR法从小鼠耳组织样本。
| 组件 | 20μl反应 | 50μl反应体系 | 终浓度。 |
| H 2 O | 加至20微升 | 添加到50微升 | |
| 2个Phire植物PCR缓冲液 | 10微升 | 25微升 | 1个 |
| 引物A | 所述微升 | 所述微升 | 0.5μM |
| 引物B | 所述微升 | 所述微升 | 0.5μM |
| Phire热启动II DNA聚合酶 | 0.4μL | 1微升 | |
| 采样/直接协议 | 0.50 mm打孔 | ||
| 采样/稀释协议 | 0.5-1微升 |
表1中。在本协议中使用的植物PCR反应条件。
| 循环步骤 | 温度。 | 时间 | 循环 |
| 初始变性 | 98°C | 5分钟 | 1 |
| 变性 退火* 延期 | 98°C X°C 72°C | 5秒 5秒 20秒 | 40 |
| 最后延伸 | 72°C 4°C | 1分钟 持有 | 1 |
表2。植物PCR循环条件中使用此协议。
* TM计算器oscientific.com机构/ pcrwebtools“目标=”_blank“> www.thermoscientific.com / pcrwebtools的建议当确定要使用Phire热启动II DNA聚合酶的引物的Tm。推荐的引物的退火温度≤20 nt是等于较低的Tm给出由webtool。对于引物> 20 nt的，使用的退火温度3℃高于较低的Tm由webtool给出。
| 组件 | 20μl反应 | 终浓度。 |
| H 2 O | 加至20微升 | |
| 2个Phire动物组织PCR缓冲液 | 10微升 | 1个 |
| 引物A | 所述微升 | 0.5μM |
| 引物B | 所述微升 | 0.5μM |
| pH值愤怒热启动II DNA聚合酶 | 0.4μL | |
| 采样/稀释协议 | 1微升 |
表3。在本协议中使用的动物组织的PCR反应条件。
| 循环步骤 | 温度。 | 时间 | 循环 |
| 初始变性 | 98°C | 5分钟 | 1 |
| 变性 退火* 延期 | 98°C X°C 72°C | 5秒 5秒 20秒≤1 KB 20秒/ KB 1 KB | 40 |
| 最后延伸 | 72°C 4°C | 1分钟 持有 | 1 |
表4。在本协议中使用的动物组织PCR循环条件。
*的Tm计算器时，建议在www.thermoscientific.com / pcrwebtools的决定使用Phire热启动II DNA聚合酶的引物的Tm。推荐的≤20核苷酸的引物的退火温度是等于较低的Tm由webtool给出。对于引物> 20 nt的，使用的退火温度3℃，高于给定的较低的Tm由webtool。
图1。直接PCR的工作流程。，直接PCR可以进行使用两个替代协议。在直接协议中一个微小的量的样品直接添加到PCŕ反应。稀释协议采用简短的预孵育PCR步骤之前从样品材料释放DNA。
图2。 拟南芥植物个体的基因分型与dCAPS特异性技术直接从叶冲头。 A）图2A示出的原则进行的dCAPS特异性检测。内SNP的利益被引入的限制性位点，通过PCR使用的引物与一个或多个的目标DNA的错配或移除。对PCR产物进行消化，所得片段揭示每个个体的基因型时，通过电泳分析。B）从植物叶片0.50毫米冲头被直接放置在50μl的PCR反应。引入一个独特的SspI位点的A等位基因的引物进行扩增的160 bp的PCR产物含有的SNP位点（G或A等位基因）。未纯化的PCR产物酶切特德用SspI，限制性内切酶。所得片段用3％的琼脂糖凝胶电泳分析。泳道M是大小标记物，泳道A和G对应于每个样品的SNP等位基因。提取DNA，然后通过PCR和酶切（数据未示出）通过常规的分析，将所得的结果证实。无模板DNA的阴性对照反应，包括在测试设置，并运行一个单独的琼脂糖凝胶上进行消化（数据未示出）之前，与实际的PCR反应平行。
图3。用橡树叶样品稀释协议。稀释协议被用来扩增的297 bp的DNA片段，叶绿体DNA在橡树叶样品（3步协议，退火温度为62°C），不同的稀释液（1:100，1:10， ：1和2:1），阳性和阴性对照操纵，[C +：阳性对照纯化的DNA（ 拟南芥 ），C-：没有模板DNA的阴性对照。代表样品的采集样品命名网站在芬兰（镇）和样品编号。
图4。基因分型的转基因小鼠的一个引物对使用的稀释协议。九个个别小鼠耳组织中（泳道1-9）被放置入20μl的稀释缓冲液包括DNARelease添加剂。经过温育在室温下和98℃，1微升上清液用作20微升的PCR反应中的模板。片段的大小：1,500基点（转基因）和200bp（野生型）。
图5。制备的样品的稀释协议是稳定的，长期贮存。小鼠耳组织样品公司在20μl的稀释缓冲液包括DNARelease添加剂ubated进行反复冷冻/解冻（泳道1），在-20℃下存储一年（泳道2），或立即用于PCR（泳道3）。扩增片段大小为900 bp的，1500 bp和3200 bp的。
图6。 Phire动物组织直接PCR试 剂盒优于热启动Taq DNA聚合酶结合的商业DNA纯化系统。小鼠耳组织，用稀释协议Phire动物组织直接PCR试 剂盒扩增，扩增子（0.5-1.5）。为了进行比较，DNA首先被使用的是商业的DNA提取试剂盒纯化和相同的片段，根据制造商的建议使用一个热启动Taq DNA聚合酶扩增。只有，与Phire动物组织直接PCR试剂盒均全部扩增子成功地扩增。
图7。通用的工作流程比较估计次/消耗的试剂。Thermo Scientific的直接PCR方法相比，DNA的提取方法，提取缓冲液的方法，PCR缓冲方法。每种方法之前，PCR步骤中列出的红色文字的估计时间。 Thermo Scientific能够直接PCR方法之前PCR样品制备只需要0-4分钟。下面的每一种方法中，所消耗的试剂被列出。 Thermo Scientific能够直接PCR方法中的其它方法相比，使用最少的试剂。 点击此处查看大图 。
Discussion
这里展示的直接PCR方法允许直接从少量未纯化的样品进行PCR扩增，减少所需要的时间，并简化为植物和动物的基因分型（ 图7）的工作流程。此处也表现出与直接PCR的方法（ 图3）是使用的稀释组合协议。困难的样品（ 如老化植物的叶子，植物，含有干扰物质）或长（或富含GC），扩增产物稀释协议。时，开始一个新的直接PCR实验中，允许反应优化的，该协议是特别有用的。该协议可以作为一种工具来解决偶尔的困难，例如低的产品产率，由于在组织材料和/或使用的引物的差异。此外，运行多个反应时，从相同的样品，使用的稀释协议确保将整个样品在一个没有被消耗反应。
为了净化从植物中用于PCR的DNA，该公约来进行细胞裂解，然后由DNA分离使用各种部件，有可能会干扰PCR分析8。对于特别具有挑战性的植物与酚含量高，另外聚乙烯吡咯烷酮，传统上被用于删除与DNA结合的化合物，细胞裂解后的2,5。这里可以明显看出，这些复杂的，时间密集的步骤，可避免通过使用的Phire植物直接PCR试剂盒来检测目标DNA。使用的敏感dCAPS特异性技术直接从拟南芥的植物的叶子（ 图2）的细胞裂解和DNA分离步骤可以省略。这里表明，稀释协议有效地管理问题的组件，可以干扰用聚合酶链反应（ 图3）的存在下。
传统上，动物基因分型的先决条件是isolati通过一种有毒的，耗费时间的过程，其特征在于由一个漫长的孵化用蛋白酶K消化皮肤和结缔组织，其次通过有机溶剂提取，乙醇沉淀，并离心步骤6,9,10从动物组织中的基因组DNA上。这里表明，通过使用的Phire动物组织直接PCR试 剂盒来实现这个过程的简化，允许转基因小鼠进行基因分型，恕不另行DNA纯化（ 图4）。在本文中演示的例子是特别具有挑战性，因为采用了大尺寸的差异，只有一个用于两个片段的扩增引物组。尽管协议的先天困难，使用直接PCR议定书简单稀释导致的两个PCR产物（ 图4）的高收率的方法配合使用。
PCR为基础的目标DNA检测，有很多的应用研究，包括基因型分析，以确定发展，生理和疾病基因的角色。由于专门的DNA聚合酶抑制剂的耐受性，该协议可以在最短的时间，恕不另行DNA纯化完成。
Disclosures
生产和免费使用这篇文章是由赛默飞世尔科技公司
Acknowledgments
拟南芥的样品和有关PCR引物，我们感谢的JaakkoKangasjärvi教授和他的研究小组，的植物逆境集团，植物分子生物学，生物科学系，赫尔辛基大学。与传统方法的实验进行了夫人爱里Lamminmäki。
转基因小鼠提供样品，生物医学/生物化学研究所，赫尔辛基大学的博士JAANA Vesterinen。
哈里斯Uni-CORE核心和哈里斯切割垫的Shunderson通信公司的商标，所有其他商标的财产的Thermo Fisher Scientific公司及其附属公司的商标或注册商标。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phire Plant Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-130 | 200 reactions (50 μl each) |
| Phire Animal Tissue Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-140 | 200 reations (50 μl each) |
| Harris Uni-Core 0.35 mm (pink) | Thermo Fisher Scientific | F-180S/L | Qty: 5/25 |
| Harris Uni-Core 0.50 mm (blue) | Thermo Fisher Scientific | F-185S/L | Qty: 5/25 |
| Harris Cutting Mat 6.4 × 7.6 cm | Thermo Fisher Scientific | F-190 | Qty: 5 |
| SspI | Thermo Fisher Scientific | ER0771 | 100 μl (100 reactions) |
| Piko 24-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | TCP0024 | |
| 24-Well Piko PCR Plates | Thermo Fisher Scientific | SLP0241 | |
| GeneJET PCR Purification Kit |
Thermo Fisher Scientific | K0701 K0702 |
50 preps 250 preps |
References
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