Summary
Den direkte PCR strategi, der fremlægges her, letter PCR-amplifikation direkte fra små mængder af urenset plante-og animalsk væv.
Abstract
Direct PCR strategi letter PCR-amplifikation direkte fra små mængder urensede prøver, og påvises her i flere vegetabilske og animalske væv (figur 1). Direkte PCR er baseret på specielt udviklet Thermo Scientific Phusion og Phire DNA-polymeraser, som omfatter en dobbeltstrenget DNA-bindende domæne, der giver dem unikke egenskaber såsom høj tolerance over for inhibitorer.
PCR-baseret mål-DNA påvisning har talrige anvendelser i anlæg forskning, herunder plante genotype analyse og efterprøvning af transgener. PCR fra plantevæv traditionelt omfatter et første DNA-isolering trin, der kan kræve kostbare eller toksiske reagenser. Fremgangsmåden er tidskrævende og forøger risikoen for krydskontaminering 1, 2. Omvendt, ved anvendelse af Thermo Scientific Phire Plant Direkte PCR Kit mål-DNA'et let kan detekteres, uden forudgående DNA-ekstraktion. I modellen vist her, eneksempel på afledt spaltet amplificeret polymorft sekvensanalyse (dCAPS) 3,4 udføres direkte fra Arabidopsis planteblade. dCAPS genotypebestemmelse assays kan anvendes til at identificere single nucleotide polymorphisms (SNP) efter SNP allelspecifik restriktionsendonucleasefordøjelse 3.
Nogle plante prøver tendens til at være mere udfordrende, når du bruger Direct PCR-metoder, da de indeholder komponenter, der interfererer med PCR, såsom phenolforbindelser. I disse tilfælde er et yderligere trin til fjernelse af forbindelserne traditionelt krævet 2,5. Her er dette problem overvindes ved at anvende en hurtig og let fortynding protokol efterfulgt af direkte PCR-amplifikation (figur 1). Femten år gamle egeblade bruges som model for udfordrende planter som prøven indeholder store mængder phenolforbindelser, herunder tanniner.
Genoverførsel til mus er bredt anvendt til at undersøge geners rolle i udvikpment, fysiologi og human sygdom. Anvendelsen af disse dyr kræver screening for tilstedeværelsen af transgenet, sædvanligvis med PCR. Traditionelt er dette involverer en tidskrævende DNA-isolering trin, hvor DNA for PCR-analyse oprenses fra øret, hale eller tå væv 6,7. Imidlertid kan med Thermo Scientific Phire dyrevæv direkte PCR Kit transgene mus skal genotypebestemmes uden forudgående DNA-oprensning. I denne protokol transgen mus genotypebestemmelse opnås direkte fra muse øres væv, som vist her for en udfordrende eksempel, hvor kun en primersæt anvendes til amplifikation af to fragmenter afviger meget i størrelse.
Protocol
1. Genotypebestemmelse af Arabidopsis Plant Personer med Direct protokol
- At starte dCAPS genotypebestemmelse assayet direkte på Arabidopsis plante blad først formulerer 20 eller 50 pi PCR-reaktioner under anvendelse af Phire Plant Direkte PCR Kit, som beskrevet i tabel 1..
- Dernæst skar en 0,50 mm punch fra en Arabidopsis planter blad ved hjælp af Harris Uni-Core og Harris Cutting Mat. Hold puncher fast, tryk på forkant i vævet og drej puncher frem og tilbage.
- Tryk på stemplet for at skubbe stemplet disk i en PCR-reaktionsblanding. Sikre, at prøven falder ind i PCR-opløsningen, og klæber ikke til rørvæggene.
- Rengør forkant med puncher mellem hver prøve for at undgå krydskontaminering ved at dyppe den i 2% NaCIO opløsning. Tryk stemplet op og ned et par gange, og tør forkant med en ren papirserviet. Den skæremåtte bør også væreskylles mellem prøverne.
- Derefter anvender en Thermo Scientific Piko 24 brønde Thermal Cycler og Thermo Scientific Piko PCR Plate at udføre PCR-reaktioner under anvendelse af cyklusbetingelser beskrevet i tabel 2. PCR-reaktionerne kan også udføres i konventionelle PCR-termiske cykliseringsapparater.
- Efter PCR, stop, plantematerialet. Overfør 5 pi af supernatanten til et nyt mikrocentrifugerør. Tilsættes 4 pi vand og 1 pi af restriktionsenzym, Sspl. Bland forsigtigt og centrifuger kortvarigt at samle indholdet i bunden af røret. Inkubere reaktionsblandingen i en time ved 37 ° C. Inaktivere restriktionsenzymet ved inkubering ved 65 ° C i 20 minutter.
- Når amplificere DNA direkte fra plantevæv, PCR-produkterne indbefatter plante-og PCR-afledte komponenter, der kan interferere med restriktionsfordøjelse enzym. Derfor kan det være nødvendigt at enten fortyndes (f.eks 1:2 eller 1:03 i vand) eller oprense PCR-produktet før than efterfølgende spaltning, for eksempel ved anvendelse af en egnet kommercielt kit såsom Thermo Scientific GeneJET PCR Purification Kit.
- Efter restriktionsenzymfordøjelse, de resulterende fragmenter på en agarosegel analyse. Tilsæt 2,5 pi 5x loadingbuffer til reaktionsblandingen og udføre agarosegelelektroforese med 10 ul af den resulterende blanding.
2. Amplifikation af specifikke DNA-fragmenter fra 15-årige Oak Leaves bruger Fortyndingsprotokol
- Til at begynde, klippe en 2 mm punch af eg blad.
- Anbring prøven i 20 pi fortyndingsbuffer leveres med Phire Plant Direkte PCR Kit. Rens den skærende kant af puncher og opskæring mat som før.
- Knuse blad prøven med en 100 gl pipettespids ved at trykke det kort mod rørvæggen. Afhængig af plantematerialet, fortyndingen protokol til tider virker bedre uden at knuse prøven.
- Spin prøverne kortvarigt i en mikrocentrifuge indtil than reaktioner er i bunden af rørene.
- Supernatanten kan anvendes direkte i PCR, eller den kan være fortyndet 1:10 eller 1:100 i sterilt vand afhængigt af prøvetype. Anvende 0,5 pi til 1 ml af supernatanten eller fortynding som en template for en 20 ul PCR-reaktion. Forbered reaktion som beskrevet i tabel 1..
- Når reaktionerne fremstilles, anvender en Thermo Scientific Piko 24 brønde Thermal Cycler og Thermo Scientific Piko PCR Plate at udføre PCR-reaktioner under anvendelse af cyklusbetingelser beskrevet i tabel 2. PCR-reaktionerne kan også udføres i konventionelle PCR-termiske cykliseringsapparater.
- Efter PCR, tilsættes 5 pi 5x loadingbuffer til reaktionsblandingen og udføre agarosegelelektroforese med 15 ul af den resulterende blanding.
3. Genotypebestemmelse af transgene mus ved hjælp af Fortyndingsprotokol
- Begynd fortynding protokol om transgene mus ved at placere en 2 mm dorn for mOuse øre i 20 pi fortyndingsbuffer indeholdende 0,5 pi DNARelease Tilsætningsstof følger med Phire Animal Tissue Direkte PCR Kit.
- Inkuber prøverne ved stuetemperatur i 2 minutter, efterfulgt af 2 minutters inkubation ved 98 ° C.
- Spin prøverne kortvarigt i en mikrocentrifuge, indtil reaktionerne er i bunden af rørene.
- Anvende 1 ml af supernatant som template for en 20 ul PCR-reaktion, fremstillet som beskrevet i tabel 3. Enhver supernatant, som ikke skal anvendes med det samme, kan overføres til et nyt rør og opbevaret ved -20 ° C.
- Derefter anvender en Thermo Scientific Piko 24 brønde Thermal Cycler og Thermo Scientific Piko PCR Plate at udføre PCR-reaktioner under anvendelse af cyklusbetingelser beskrevet i tabel 4.. Igen kan de PCR-reaktioner også udføres i konventionelle PCR-cyclere.
- Efter PCR, 5 pi 5x loadingbuffer tilsættes til reaktionsblandingen, og udføre agarosegelelektroforese wi'te 15 pi af den resulterende blanding.
4. Repræsentative resultater
I dCAPS teknikken restriktionsstedet i SNP af interesse, enten indført eller ødelagt under anvendelse af en PCR-primer med en eller flere fejlparringer til mål-DNA'et. Genotypebestemmelse af Arabidopsis plante individer blev udført med dCAPS teknik direkte fra blad slag. De amplificerede produkter blev spaltet og de resulterende fragmenter afslører genotype af hver enkelt blev analyseret ved gelelektroforese (figur 2).
I dette eksempel blev 160 bp PCR-produkter indeholdende SNP-stedet af interesse (G eller A allelen) i Arabidopsis-genomet amplificeret fra plante blad slag med Phire Plant Direkte PCR Kit. Den fremadrettede primer indeholdt en fejlparring ved 3'-enden, hvilket skaber en SspI-specifikt restriktionssted i mål-DNA'et, som omfattede SNP af interesse (A-allel), men ikkei den anden allel af SNP (figur 2B).
Fortynding protokoller er nødvendige for udfordrende plantemateriale, såsom eg blad, på grund af dets høje koncentration af phenolforbindelser. Ved hjælp af fortynding protokollen beskrevet her blev det 297 bp-fragment af chloroplast DNA amplificeret under anvendelse af 3-trins protokol. Egeblad prøver med forskellige fortyndinger er vist i figur 3, ud over positive og negative kontroller.
The Phire Animal Tissue Direkte PCR Kit blev anvendt med en udfordrende protokol, hvor kun en primer sæt blev anvendt til amplificering af to fragmenter med en stor størrelsesforskel, hvilket resulterer i rigelige udbytter af både korrekt dimensionerede produkter af 1500 bp for transgene mus og 200 bp for vildtypemus (fig. 4). Den svagere øvre bånd med heterozygote mus skyldes konkurrence af begge skabeloner (alleler) for samme primerpar, men den genotypING resultaterne er entydige.
Stabiliteten af prøverne fremstillet ved hjælp af fortynding protokol blev også testet. Resultaterne viser, at fortynding prøver kan opbevares ved -20 ° C i mindst et år. Desuden har gentagne fryse / optøningscykler ikke væsentligt påvirker reaktionen (fig. 5). Også vist er det robust amplificering fra museøre vævsprøver under anvendelse Phire DNA-polymerase og den direkte PCR-metode i forhold til hot start Taq polymerase og oprenset DNA (figur 6).
| Komponenter | 20 ul reaktion | 50 ul reaktion | Final Conc. |
| H2O | tilsættes til 20 pi | tilsættes til 50 gl | |
| 2x Phire Plant PCR-buffer | 10 ul | 25 ul | 1x |
| primer A | X pi | X pi | 0,5 uM |
| primer B | X pi | X pi | 0,5 uM |
| Phire Hot StartTM II DNA Polymerase | 0,4 gl | 1 pi | |
| Sample / direkte protokol | 0,50 mm dorn | ||
| Prøve / fortynding protokol | 0,5-1 ul |
Tabel 1. Reaktionsbetingelser for Plant PCR anvendt i denne protokol.
| Cycle Step | Temp. | Tid | Cycles |
| Indledende denaturering | 98 ° C | 5 min | 1 |
| Denaturering Annealing * Extension | 98 ° C X ° C 72 ° C | 5 sek 5 sek 20 sec | 40 |
| Final Extension | 72 ° C 4 ° C | 1 min hold | 1 |
Tabel 2. Cykling betingelser for Plant PCR anvendt i denne protokol.
* Tm regnemaskine vedoscientific.com / pcrwebtools "target =" _blank "> www.thermoscientific.com / pcrwebtools anbefales, når fastsættelsen af Tm for primere, der skal anvendes med Phire Hot Start II DNA Polymerase. Den anbefalede annealingstemperatur for primere ≤ 20 nt er lig med den lavere Tm givet ved webværktøjet. For primere> 20 nt, anvende en annealingstemperatur 3 ° C højere end den nedre Tm givet ved webværktøjet.
| Komponenter | 20 ul reaktion | Final Conc. |
| H2O | tilsættes til 20 pi | |
| 2x Phire Animal Tissue PCR-buffer | 10 ul | 1x |
| primer A | X pi | 0,5 uM |
| primer B | X pi | 0,5 uM |
| Phire Hot StartTM II DNA Polymerase | 0,4 gl | |
| Prøve / fortynding protokol | 1 pi |
Tabel 3. Reaktionsbetingelser for dyrevæv PCR anvendes i denne protokol.
| Cycle Step | Temp. | Tid | Cycles |
| Indledende denaturering | 98 ° C | 5 min | 1 |
| Denaturering Annealing * Extension | 98 ° C X ° C 72 ° C | 5 sek 5 sek 20 sek ≤ 1 kb 20 sek / kb> 1 kb | 40 |
| Final Extension | 72 ° C 4 ° C | 1 min Hold | 1 |
Tabel 4. Cykling betingelser for Animal Tissue PCR anvendt i denne protokol.
* Tm regnemaskine på www.thermoscientific.com / pcrwebtools anbefales, når fastsættelsen af Tm for primere, der skal anvendes med Phire Hot Start II DNA Polymerase. Den anbefalede hærdningstemperatur for primere ≤ 20 nt er lig med den lavere Tm givet ved webværktøjet. For primere> 20 nt, en annealingstemperatur 3 Anvendelse ° C højere end den nedre Tm afgivet webværktøjet.
Figur 1. Direkte PCR arbejdsgang. Direkte PCR kan udføres ved anvendelse af to alternative protokoller. I direkte protokol en lille mængde prøve tilsættes direkte til pc'enR reaktion. Fortyndingen Protokollen anvender en kort præinkubation trin før PCR for at frigive DNA fra prøvematerialet.
Figur 2. Genotypebestemmelse af Arabidopsis plante individer med dCAPS teknik direkte fra blad slag. A) Figur 2A viser princippet om dCAPS assayet udføres. Restriktionsstedet i SNP af interesse, enten indført eller fjernet ved PCR under anvendelse af en primer med en eller flere fejlparringer til mål-DNA'et. PCR-produkterne fordøjes, og de resulterende fragmenter afslører genotype af hver enkelt, når analyseret ved elektroforese. B) 0,50 mm patricer fra planteblade blev anbragt direkte i 50 pi PCR-reaktioner. 160 bp PCR-produkter indeholdende SNP-stedet (G eller A-allel) blev amplificeret med primere indfører et unikt SspI stedet for A-allelen. De urensede PCR-produkter blev fordøjelsesret med SspI restriktionsenzym. Resulterende fragmenter blev analyseret på en 3% agarosegel. Bane M er størrelsesmarkør, bane A og G svarer til SNP alleler af hver prøve. De opnåede resultater blev bekræftet ved traditionel analyse af DNA-ekstraktion efterfulgt af PCR og restriktionsfordøjelse (data ikke vist). De negative kontrolreaktioner uden template-DNA blev inkluderet i testen etablere og drive en separat agarosegel sideløbende med de faktiske PCR-reaktioner før udførelse af fordøjelser (data ikke vist).
Figur 3. Fortyndingsprotokol hjælp af eg bladprøver. Fortyndings protokol blev anvendt til at amplificere 297 bp-fragment af chloroplast DNA i eg bladprøver (3-trins protokol, annealing ved 62 ° C) ved forskellige fortyndinger (1:100, 1:10, 1 : 1 og 2:1) og positive og negative kontroller [C +: positiv kontrol fra oprenset DNA (Arabidopsis), C-: negativ kontrol uden template-DNA]. Prøven glossar udgør prøven indsamlingssted (byer i Finland) og prøven nummerering.
Figur 4. Genotypebestemmelse af transgene mus med et primerpar med fortynding protokollen. Øres væv i ni individuelle mus (bane 1-9) blev anbragt i 20 pi fortyndingsbuffer herunder DNARelease Additive. Efter inkubationer ved stuetemperatur og 98 ° C, blev 1 ml af supernatanten anvendt som en template i 20 ul PCR-reaktion. Fragmentstørrelser: 1.500 bp (transgene) og 200 bp (vildtype).
Figur 5. Prøver fremstillet ifølge fortynding protokollen er stabile til langtidsopbevaring. Prøver af museøre væv var inc ubated i 20 pi fortyndingsbuffer herunder DNARelease Additiv og underkastet gentagen frysning / optøning (bane 1), opbevaret ved -20 ° C i et år (bane 2), eller straks anvendes til PCR (bane 3). De amplificerede fragmentstørrelser var 900 bp, 1500 bp og 3200 bp.
Figur 6. Phire Animal Tissue Direkte PCR Kit udkonkurrerer et kommercielt DNA-oprensningssystemet kombineret med en varm start Taq DNA polymerase. Fire amplikoner (0,5-1,5 kb) blev amplificeret fra muse øres væv ved hjælp af fortynding protokol Phire Animal Tissue Direkte PCR Kit. Til sammenligning blev DNA først renset anvendelse af et kommercielt DNA-ekstraktionskit, og de samme fragmenter blev amplificeret ved anvendelse af en varm start Taq DNA polymerase ifølge producentens anbefalinger. Kun med Phire Animal Tissue Direkte PCR Kit var alle fire amplikoner succes forstærkes.
Figur 7. Universal sammenligning af arbejdsprocessen med estimering af gange / forbruges reagenser. Thermo Scientific Direkte PCR-fremgangsmåde i forhold til DNA-isolering tilgang, Ekstraktionsbuffer fremgangsmåde, og PCR-puffer fremgangsmåde. Den anslåede tid for hver metode forud for PCR-trin er opført i rød tekst. Thermo Scientific Direct PCR tilgang tager kun 0-4 min for prøveforberedelse forud for PCR. Under hvert metode, kan forbruges reagenser opført. Thermo Scientific Direct PCR metode bruger den mindste mængde af reagenser i forhold til de andre metoder. Klik her for at se større figur .
Discussion
Den direkte PCR metode demonstreret her giver mulighed for PCR-amplifikation direkte fra små mængder af urenset prøver, hvilket reducerer den nødvendige tid og forenkle arbejdsgangen for planter og dyr genotypebestemmelse (fig. 7). Også vist her er anvendelsen af fortynding protokol i kombination med direkte PCR-fremgangsmåde (fig. 3). Fortyndings protokol anbefales med vanskelige prøver (f.eks alderen planteblade, plantearter, der indeholder interfererende forbindelser) eller med lange (eller GC-rig) ampliconer. Denne protokol er især nyttig, når en ny Direkte PCR-forsøg, der giver mulighed for optimering af reaktionen. Protokollen kan tjene som et redskab til at håndtere lejlighedsvis problemer såsom lavt produktudbytter grund af forskelle i vævsmateriale og / eller anvendte primere. Endvidere, når køre flere reaktioner fra den samme prøve, anvendelse af fortyndingen protokol sikrer hele prøven ikke forbruges på enreaktion.
For at oprense DNA fra planter til PCR, konventionen var at udføre cellelyse efterfulgt af DNA-isolering ved hjælp af forskellige komponenter, der potentielt kan interferere med PCR-analyse 8. For særligt udfordrende planter med højt fenolindhold, tilsætning af polyvinylpyrrolidon blev traditionelt anvendt til at fjerne de forbindelser, der binder til DNA efter cellelyse 2,5. Som det fremgår her, kan disse komplicerede, tidskrævende trin kan undgås ved anvendelse af Phire Plant Direkte PCR Kit til påvisning af mål-DNA. Cellelyse og DNA-isoleringstrin kan udelades ved hjælp af følsomme dCAPS teknikker direkte fra Arabidopsis blade (figur 2). Som påvist her, fortyn-protokol effektivt håndterer tilstedeværelsen af problematiske komponenter, som kan forstyrre PCR (figur 3).
Traditionelt er det en forudsætning for dyrs genotypebestemmelse var isolatiden af genomisk DNA fra dyrevæv gennem en toksisk, tidskrævende proces karakteriseret ved en langvarig inkubation med proteinase K for at nedbryde hud og bindevæv, efterfulgt af organisk opløsningsmiddel, alkoholpræcipitation og centrifugeringstrin 6,9,10. Som demonstreret her, er en forenkling af denne proces opnås ved anvendelse af Phire Animal Tissue Direkte PCR Kit, så transgene mus, der skal genotypebestemmes uden forudgående DNA-oprensning (figur 4). Eksemplet vist i denne artikel er særligt udfordrende som kun én primer sæt blev anvendt til amplificering af to fragmenter med en stor størrelsesforskel. Trods protokollen medfødte problemer, anvendelse af direkte PCR-fremgangsmåde i forbindelse med den simple fortynding protokol resulterede i høje udbytter af de to PCR-produkter (Figur 4).
PCR-baseret mål-DNA påvisning har mange anvendelser i forskning, herunder genotype analyse for at identificeregeners rolle i udvikling, fysiologi og sygdom. På grund af inhibitoren tolerance af de specialiserede DNA-polymeraser, kan protokollerne være afsluttet i minimal tid uden forudgående DNA-oprensning.
Disclosures
Produktion og fri adgang til denne artikel er sponsoreret af Thermo Fisher Scientific, Inc.
Acknowledgments
For de Arabidopsis prøver og de berørte PCR primere vi takke professor Jaakko Kangasjärvi og hans gruppe, The Plant Stress Group, Plantebiologi, Institut for Biosciences, University of Helsinki. Forsøgene med den traditionelle metode blev udført af Mrs Airi Lamminmäki.
Transgene mus prøver blev leveret af Dr. Jaana Vesterinen, Institut for Biomedicin / Biokemi, University of Helsinki.
Harris Uni-Core og Harris Cutting Mat er varemærker tilhørende Shunderson Communications Inc. Alle andre varemærker ejes af Thermo Fisher Scientific Inc. og dets datterselskaber.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phire Plant Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-130 | 200 reactions (50 μl each) |
| Phire Animal Tissue Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-140 | 200 reations (50 μl each) |
| Harris Uni-Core 0.35 mm (pink) | Thermo Fisher Scientific | F-180S/L | Qty: 5/25 |
| Harris Uni-Core 0.50 mm (blue) | Thermo Fisher Scientific | F-185S/L | Qty: 5/25 |
| Harris Cutting Mat 6.4 × 7.6 cm | Thermo Fisher Scientific | F-190 | Qty: 5 |
| SspI | Thermo Fisher Scientific | ER0771 | 100 μl (100 reactions) |
| Piko 24-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | TCP0024 | |
| 24-Well Piko PCR Plates | Thermo Fisher Scientific | SLP0241 | |
| GeneJET PCR Purification Kit |
Thermo Fisher Scientific | K0701 K0702 |
50 preps 250 preps |
References
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin. 19, 11-15 (1987).
- Kim, C. S., Lee, C. H., Shin, J. S., Chung, Y. S., Hyung, N. I. A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP. Nucleic Acids Research. 25, 1085-1086 (1997).
- Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. The Plant Journal. 14, 387-392 (1998).
- Michaels, S. D., Amasino, R. M. A robust method for detecting single-nucleotide changes as polymorphic markers by PCR. The Plant Journal. 14, 381-385 (1998).
- John, M. E. An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics. Nucleic Acids Research. 20, 2381-23 (1992).
- Wang, Z., Storm, D. R. Extraction of DNA from mouse tails. BioTechniques. 41, 410-412 (2006).
- Malumbres, M., Mangues, R., Ferrer, N., Lu, S., Pellicer, A. Isolation of High Molecular Weight DNA for Reliable Genotyping of Mice. BioTechniques. 22, 1114-1119 (1997).
- Yang, Y., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis Leaves Using AnyDirect system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40, 444-447 (2007).
- Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory. , 2nd ed, CSH Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Meldgaard, M., Bollen, P. J. A., Finsen, B. Non-invasive method for sampling and extraction of mouse DNA for PCR. Laboratory Animals. 3, 413-441 (2004).
