Summary
L'approche présentée ici PCR directe facilite l'amplification par PCR directement à partir de petites quantités de plantes non purifié et tissus d'origine animale.
Abstract
L'approche directe PCR facilite l'amplification par PCR directement à partir de petites quantités d'échantillons non purifiés, et se manifeste ici pour plante plusieurs et tissus animaux (Figure 1). Direct PCR est basée sur Phusion spécialement conçu Thermo Scientific et ADN polymérase Phire, qui comprennent un domaine d'ADN double brin contraignant qui leur confère des propriétés uniques telles que la tolérance élevée d'inhibiteurs.
Basée sur la PCR de détection d'ADN cible a de nombreuses applications dans la recherche végétale, y compris l'analyse génotype de la plante et la vérification des transgènes. PCR à partir de tissus végétaux implique traditionnellement une étape initiale d'ADN isolée, ce qui peut nécessiter des réactifs coûteux ou toxiques. Le processus prend du temps et augmente le risque de contamination croisée 1, 2. A l'inverse, en utilisant Thermo Scientific Phire usine direct kit PCR de l'ADN cible peut être facilement détectée, sans extraction de l'ADN avant. Dans le modèle montré ici, unpar exemple des dérivés analyse clivée séquence polymorphe amplifié (dCAPS) 3,4 est effectuée directement à partir de feuilles de la plante Arabidopsis. dCAPS tests de génotypage peuvent être utilisés pour identifier les polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) par SNP allèle-spécifique digestion par une endonucléase de restriction 3.
Certains échantillons de plantes ont tendance à être plus difficile lors de l'utilisation directe des méthodes de PCR car ils contiennent des composants qui interfèrent avec la PCR, tels que les composés phénoliques. Dans ces cas, une étape supplémentaire pour éliminer les composés sont traditionnellement tenus 2,5. Ici, ce problème est résolu en utilisant un protocole de dilution simple et rapide suivie d'une amplification par PCR directe (figure 1). Quinze feuilles de chêne ans sont utilisés comme un modèle pour les plantes difficiles que l'échantillon contient de grandes quantités de composés phénoliques dont les tanins.
Le transfert de gènes chez la souris est largement utilisé pour étudier le rôle des gènes dans dévepement, la physiologie et les maladies humaines. L'utilisation de ces animaux nécessite le dépistage de la présence du transgène, généralement par PCR. Traditionnellement, il s'agit d'une étape longue durée isolement de l'ADN, au cours de laquelle l'ADN pour l'analyse PCR est purifié à partir de tissus d'oreille, la queue ou de l'orteil 6,7. Cependant, avec les Thermo Scientific Phire animaux souris transgéniques tissus directs PCR kit peuvent être génotypés sans purification de l'ADN avant. Dans ce protocole de génotypage de souris transgénique est obtenu directement à partir de tissus de l'oreille de souris, comme en témoigne ici pour un exemple stimulant où un seul ensemble d'amorces est utilisée pour l'amplification de deux fragments de taille très différentes.
Protocol
1. Le génotypage des individus plante Arabidopsis avec le protocole Direct
- Pour commencer le test de génotypage dCAPS directement sur la feuille de la plante Arabidopsis, tout d'abord formuler des 20 ou 50 pi de réactions de PCR utilisant l'Phire usine direct kit PCR comme décrit dans le tableau 1.
- Ensuite, découpez un coup de poing de 0,50 mm à partir d'une feuille de la plante Arabidopsis en utilisant le Harris Uni-Core et Tapis de découpe Harris. Tenir fermement le perforateur, appuyez sur le bord de coupe dans le tissu et faire tourner le poinçon d'avant en arrière.
- Appuyer sur le piston pour éjecter le disque coup de poing dans un mélange réactionnel de PCR. Assurez-vous que l'échantillon tombe dans la solution de PCR et ne colle pas aux parois du tube.
- Nettoyez la pointe du poinçon entre chaque échantillon pour éviter la contamination croisée en le plongeant dans une solution de NaClO 2%. Appuyez sur le piston vers le haut et vers le bas à quelques reprises et essuyer le bord de coupe avec une serviette en papier propre. Le tapis de découpe doit également êtrerincées entre les échantillons.
- Ensuite, utiliser un Thermo Scientific Piko de 24 puits et Thermocycleur PCR Thermo Scientific Piko Plaque pour effectuer les réactions de PCR utilisant les conditions décrites à vélo dans le tableau 2. Les réactions de PCR peut également être effectuée dans conventionnels thermocycleurs PCR.
- Après PCR, le ralentissement de la matière végétale. Transférer 5 pl du surnageant dans un nouveau tube. Ajouter 4 pi d'eau et 1 ul d'enzyme de restriction, Sspl. Mélanger doucement et centrifuger brièvement pour recueillir contenu dans le fond du tube. Incuber le mélange réactionnel pendant une heure à 37 ° C. Inactiver l'enzyme de restriction par une incubation à 65 ° C pendant 20 min.
- Lors de l'amplification d'ADN directement à partir de tissus végétaux, les produits de PCR comprennent des composants végétaux et PCR dérivé qui peuvent interférer avec l'enzyme de digestion de restriction. Par conséquent, il peut être nécessaire de diluer ce soit (par exemple 1:2 ou 1:3 dans l'eau) ou de purifier le produit de PCR avant til digestion ultérieure, par exemple en utilisant un kit commercial approprié tel que Thermo Scientific GeneJET kit de purification PCR.
- Après digestion par des enzymes de restriction, analyse des fragments résultants sur un gel d'agarose. Ajouter 2,5 ul de tampon de chargement 5x à la réaction et une électrophorèse sur gel d'agarose avec 10 ul du mélange résultant.
2. Amplifier des fragments d'ADN spécifiques de chêne de 15 ans Feuilles en utilisant le protocole de dilution
- Pour commencer, couper un poinçon 2 mm de feuille de chêne.
- Placer l'échantillon dans 20 ul de tampon de dilution fourni avec la centrale Phire direct Kit PCR. Nettoyez la pointe du poinçon et tapis de découpe comme avant.
- Écraser la feuille d'échantillon avec une pointe de pipette 100 ul en appuyant brièvement contre la paroi du tube. En fonction de la matière végétale, le protocole de dilution fonctionne parfois mieux sans écraser l'échantillon.
- Faites tourner les échantillons brièvement dans une microcentrifugeuse jusqu'à til ya des réactions dans le fond de tubes.
- Le surnageant peut être utilisé directement dans la PCR, ou il peut être dilué 1:10 ou 1:100 dans de l'eau stérile en fonction du type d'échantillon. Utiliser 0,5 à 1 ul ul du surnageant ou de dilution comme modèle pour un 20 réactif PCR. Préparer la réaction comme décrit dans le tableau 1.
- Une fois que les réactions sont préparés, employer un Thermo Scientific Piko de 24 puits et Thermocycleur PCR Thermo Scientific Piko Plaque pour effectuer les réactions de PCR utilisant les conditions décrites à vélo dans le tableau 2. Les réactions de PCR peut également être effectuée dans conventionnels thermocycleurs PCR.
- Après PCR, ajouter 5 pl de tampon de chargement 5x à la réaction et une électrophorèse sur gel d'agarose avec 15 ul du mélange résultant.
3. Le génotypage des souris transgéniques en utilisant le protocole de dilution
- Commencer la procédure de dilution sur des souris transgéniques en plaçant un poinçon 2 mm de la mouse oreille dans 20 ul de tampon de dilution contenant 0,5 ul de l'additif DNARelease fourni avec le kit de tissus animaux Phire PCR directe.
- Incuber les échantillons à température ambiante pendant 2 min, suivie d'une incubation de 2 min à 98 ° C.
- Tourner les échantillons brièvement dans une microcentrifugeuse jusqu'à ce que les réactions sont au fond des tubes.
- Utilisez 1 pl de surnageant comme modèle pour un 20 réactif PCR, préparé comme décrit dans le tableau 3. Toute surnageant qui ne doit pas être utilisé tout de suite peut être transférée dans un nouveau tube et stockés à -20 ° C.
- Ensuite, utiliser un Thermo Scientific Piko de 24 puits et Thermocycleur PCR Thermo Scientific Piko Plaque pour effectuer les réactions de PCR utilisant les conditions décrites à vélo dans le tableau 4. Encore une fois, les réactions PCR peut également être effectuée dans les thermocycleurs PCR conventionnelles.
- Suite à la PCR, ajouter 5 pl de tampon de chargement 5x à la réaction et d'effectuer l'électrophorèse sur gel d'agarose wvec 15 ul du mélange résultant.
4. Les résultats représentatifs
Dans la technique dCAPS le site de restriction dans le SNP d'intérêt est introduit ou détruits à l'aide d'une amorce PCR avec une ou plusieurs mésappariements de l'ADN cible. Le génotypage d'individus végétaux Arabidopsis a été réalisée avec la technique dCAPS directement à partir de poinçons feuilles. Les produits amplifiés ont été digérés et les fragments résultants révélant le génotype de chaque individu ont été analysés par électrophorèse sur gel (Figure 2).
Dans cet exemple, les 160 pb produits de PCR contenant le site SNP d'intérêt (G ou allèle) dans le génome d'Arabidopsis ont été amplifiés à partir de poinçons feuilles des plantes avec l'usine Phire direct Kit PCR. L'amorce sens contient un mésappariement à l'extrémité 3 ', la création d'un site de restriction Ssp spécifique dans l'ADN cible, qui comprend le SNP d'intérêt (allèle), mais pasdans l'autre allèle du SNP (figure 2B).
Protocoles de dilution sont nécessaires pour le matériel végétal difficiles, comme la feuille de chêne, en raison de sa forte concentration en composés phénoliques. En utilisant le protocole de dilution décrit ici, le fragment de 297 pb de l'ADN chloroplastique a été amplifié en utilisant le protocole 3-étape. Échantillons de feuilles de chêne avec différentes dilutions sont présentés dans la figure 3, en plus des contrôles positifs et négatifs.
L'animal Phire Tissue Kit PCR directe a été utilisée avec un protocole exigeant où un seul ensemble d'amorces a été utilisé pour l'amplification de deux fragments avec une différence de taille importante, ce qui entraîne des rendements abondantes de ces deux produits de taille correcte de 1.500 pb pour les souris transgéniques et 200 pb pour souris de type sauvage (figure 4). Le faible bande supérieure avec des souris hétérozygotes est due à la concurrence des deux modèles (allèles) pour la paire d'amorces même, mais le génotypagerésultats décevants sont sans ambiguïté.
La stabilité des échantillons préparés en utilisant le protocole de dilution a également été testé. Les résultats montrent que les échantillons de dilution peut être conservé à -20 ° C pendant au moins un an. Par ailleurs, à plusieurs reprises cycles gel / dégel n'a pas affecté significativement la réaction (Figure 5). On voit également l'amplification robuste à partir d'échantillons de tissus de souris oreille en utilisant l'ADN polymérase Phire et la méthode PCR directe par rapport à début polymérase Taq chaude et de l'ADN purifié (figure 6).
| Composants | Réaction de 20 ul | Réactionnel de 50 ul | Conc. |
| H 2 O | ajouter à 20 pi | ajouter à 50 ul | |
| 2x Phire usine tampon PCR | 10 pl | 25 pi | 1x |
| Une amorce | X ul | X ul | 0,5 uM |
| amorce B | X ul | X ul | 0,5 uM |
| Phire Hot Start ADN polymérase II | 0,4 pi | 1 pl | |
| Exemple / Direct Protocol | 0,50 mm poinçon | ||
| Échantillon / dilution protocole | 0,5 à 1 ul |
Tableau 1. Les conditions de réaction PCR de végétaux utilisés dans le présent protocole.
| Etape cycle de | Temp. | Temps | Cycles |
| Dénaturation initiale | 98 ° C | 5 min | 1 |
| Dénaturation Recuit * Extension | 98 ° C X ° C 72 ° C | 5 sec 5 sec 20 sec | 40 |
| Extension finale | 72 ° C 4 ° C | 1 min tenir | 1 |
Tableau 2. Conditions vélo pour Plant PCR utilisée dans le présent protocole.
* La calculatrice à Tmoscientific.com / pcrwebtools "target =" _blank "> www.thermoscientific.com / pcrwebtools est recommandé lors de la détermination de la Tm des amorces pour être utilisés avec Phire Hot Start ADN polymérase II. La température recommandée pour le recuit amorces ≤ 20 nt est égale à inférieure à la Tm proposée par l'outil Web. Par amorces> 20 nt, utiliser une température de recuit 3 ° C supérieure à la Tm inférieure proposée par l'outil Web.
| Composants | Réaction de 20 ul | Conc. |
| H 2 O | ajouter à 20 pi | |
| 2x Phire tissu animal tampon PCR | 10 pl | 1x |
| Une amorce | X ul | 0,5 uM |
| amorce B | X ul | 0,5 uM |
| Phire Hot Start ADN polymérase II | 0,4 pi | |
| Échantillon / dilution protocole | 1 pl |
Tableau 3. Conditions de réaction pour les tissus animaux PCR utilisée dans le présent protocole.
| Etape cycle de | Temp. | Temps | Cycles |
| Dénaturation initiale | 98 ° C | 5 min | 1 |
| Dénaturation Recuit * Extension | 98 ° C X ° C 72 ° C | 5 sec 5 sec 20 sec ≤ 1 ko 20 sec / kb> 1 kb | 40 |
| Extension finale | 72 ° C 4 ° C | 1 min Tenir | 1 |
Tableau 4. Conditions vélo pour les tissus animaux PCR utilisés dans le présent protocole.
* La calculatrice Tm à www.thermoscientific.com / pcrwebtools est recommandé lors de la détermination de la Tm des amorces pour être utilisés avec Phire Hot Start ADN polymérase II. La température recommandée pour le recuit amorces ≤ 20 nt est égale à la plus faible Tm donnée par l'outil Web. Pour des amorces> 20 nt, utiliser une température de recuit 3 ° C supérieure à la Tm inférieure proposée par l'outil Web.
Figure 1. PCR directe flux de travail. Direct PCR peut être effectuée en utilisant deux protocoles alternatifs. Dans le protocole directement une petite quantité d'échantillon est ajouté directement à l'ordinateurR réactionnel. Le protocole de dilution emploie une mémoire de pré-incubation avant l'étape de PCR pour libérer l'ADN de l'échantillon.
Figure 2. Le génotypage d'individus végétaux Arabidopsis avec la technique dCAPS directement à partir de poinçons feuilles. A) La figure 2A montre le principe de l'essai effectué dCAPS. Le site de restriction dans le SNP d'intérêt est introduit ou retiré par PCR en utilisant une amorce avec un ou plusieurs mésappariements de l'ADN cible. Les produits de PCR sont digérés et les fragments résultants révéler le génotype de chaque individu lorsqu'il est analysé par électrophorèse. B) 0,50 mm poinçons de feuilles de plantes ont été placées directement dans 50 pi de réactions PCR. Les 160 pb produits de PCR contenant le site SNP (G ou allèle) ont été amplifiés avec des amorces introduisant un site unique Sspl à l'A-allèle. Les produits non purifiés PCR étaient digestionted l'enzyme de restriction Ssp. Fragments résultants ont été analysés sur un gel d'agarose à 3%. Lane M est le marqueur de taille; voies A et G correspondent aux allèles SNP de chaque échantillon. Les résultats obtenus ont été confirmés par l'analyse conventionnelle de l'extraction d'ADN suivie par PCR et digestion de restriction (données non présentées). Les réactions de contrôle négatif sans ADN matrice ont été inclus dans l'essai mis en place et exécuté sur un gel d'agarose séparé en parallèle avec les réactions de PCR réels avant d'effectuer les digestions (données non présentées).
Figure 3. Protocole de dilution en utilisant des échantillons de feuilles de chêne. Le protocole de dilution a été utilisé pour amplifier le fragment 297 pb de l'ADN chloroplastique dans des échantillons de feuilles de chêne (3-étape du protocole, un recuit à 62 ° C) à différentes dilutions (1:100, 1:10, 1 : 1 et 2:1) et con positifs et négatifscontrôles [C +: contrôle positif de l'ADN purifié (Arabidopsis), C-: témoin négatif sans ADN matrice]. La nomenclature échantillon représente le site de prélèvement de l'échantillon (villes de Finlande) et l'échantillon de numérotation.
Figure 4. Le génotypage des souris transgéniques avec une paire d'amorces en utilisant le protocole de dilution. Tissus d'oreille de neuf souris individuelles (voies 1-9) ont été placés dans 20 ul de tampon de dilution, y compris l'additif DNARelease. Après incubation à la température ambiante et 98 ° C, 1 pl de surnageant a été utilisé comme modèle dans les années 20 réactif PCR. Taille des fragments: 1.500 pb (transgénique) et 200 pb (type sauvage).
Figure 5. Les échantillons préparés selon le protocole de dilution sont stables pour le stockage à long terme. Échantillons de tissus de l'oreille de souris sont TTC ubated dans 20 ul de tampon de dilution, y compris l'additif DNARelease et soumis à une congélation répétée / dégel (piste 1), conservés à -20 ° C pendant une année (piste 2), ou utilisées immédiatement pour PCR (piste 3). La taille des fragments amplifiés étaient 900 pb, 1500 pb et 3200 pb.
Figure 6. Phire tissu animal Direct PCR Kit surpasse un système de purification d'ADN commerciale associée à une ADN polymérase Taq de démarrage à chaud. Quatre amplicons (0,5 à 1,5 kb) ont été amplifiés à partir de tissus de l'oreille de souris en utilisant le protocole de dilution directe des tissus animaux Phire Kit PCR. A titre de comparaison, l'ADN a été purifié en utilisant un kit ADN commerciale d'extraction et les mêmes fragments ont été amplifiés en utilisant une polymérase Taq ADN de démarrage à chaud selon les recommandations du fabricant. Ce n'est qu'avec l'Phire tissu animal Direct Kit PCR étaient les quatre amplicons amplification réussie.
Figure 7. Comparaison universelle du flux de travail avec une estimation de fois / réactifs consommés. Thermo Scientific PCR directe approche est comparée à l'approche isolement de l'ADN, l'approche Tampon d'extraction, et l'approche du tampon de PCR. Le temps estimé pour chaque approche avant l'étape de PCR est répertorié en rouge. Le Thermo Scientific PCR directe approche ne prend que 0-4 minutes pour la préparation des échantillons avant la PCR. En dessous de chaque méthode, les réactifs consommés sont répertoriés. Le Thermo Scientific PCR directe approche utilise le minimum de réactifs par rapport aux autres méthodes. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Discussion
L'approche directe PCR a démontré ici permet l'amplification par PCR directement à partir de petites quantités d'échantillons non purifiés, ce qui réduit le temps nécessaire et en simplifiant le flux de production pour l'usine et le génotypage des animaux (Figure 7). Également démontré ici est l'utilisation du protocole de dilution en combinaison avec l'approche directe par PCR (figure 3). Le protocole de dilution est recommandée avec des échantillons difficiles (par exemple les feuilles des plantes âgées, les espèces végétales qui contiennent des substances perturbatrices) ou longues (ou riche en GC) amplicons. Ce protocole est particulièrement utile lorsque vous commencez une nouvelle expérience directe PCR, permettant une optimisation de la réaction. Le protocole peut servir d'outil pour résoudre les difficultés occasionnelles telles que les rendements des produits faibles en raison de différences de matériel tissulaire et / ou amorces utilisées. En outre, lors de l'exécution de multiples réactions dans le même échantillon, l'utilisation du protocole de dilution assure la totalité de l'échantillon n'est pas consommée dans unréaction.
Afin de purifier l'ADN de plantes pour la PCR, la convention était d'effectuer la lyse cellulaire suivie d'isolement de l'ADN en utilisant divers composants qui pourraient potentiellement interférer avec l'analyse par PCR 8. Pour les plantes en particulier difficile avec fort contenu phénolique, plus de polyvinylpyrrolidone a été traditionnellement utilisé pour éliminer les composés qui se lient à l'ADN après 2,5 lyse cellulaire. Comme on le voit ici, ces temps compliqués, à forte intensité étapes peuvent être évités grâce à l'utilisation de l'usine Phire direct Kit PCR pour détecter l'ADN cible. La lyse des cellules et des mesures d'isolement d'ADN peut être omis en utilisant les techniques dCAPS sensibles directement à partir de feuilles de plantes d'Arabidopsis (Figure 2). Comme démontré ici, le protocole de dilution gère efficacement la présence de composants problématiques qui peuvent interférer avec la PCR (Figure 3).
Traditionnellement, une condition préalable à l'animal génotypage a été isolatisur de l'ADN génomique à partir de tissus d'origine animale grâce à une substance toxique, processus fastidieux caractérisé par une incubation prolongée avec la protéinase K pour digérer les tissus cutanés et conjonctifs, suivie d'extraction par solvant organique, précipitation à l'alcool, et les étapes de centrifugation 6,9,10. Comme démontré ici, la simplification de ce processus est réalisé grâce à l'utilisation de l'Phire tissu animal Direct Kit PCR permettant souris transgéniques pour être génotypés sans purification de l'ADN avant (figure 4). L'exemple montré dans cet article est particulièrement difficile car un seul ensemble d'amorces a été utilisé pour l'amplification de deux fragments avec une différence de taille importante. Malgré la difficulté innée du protocole, l'utilisation de l'approche directe par PCR en conjonction avec le protocole simple dilution donné des rendements élevés des produits de PCR deux (figure 4).
Basée sur la PCR de détection d'ADN cible a de nombreuses applications dans la recherche, y compris l'analyse du génotype d'identifierle rôle des gènes dans le développement, la physiologie et la maladie. En raison de la tolérance inhibiteur des ADN polymérases spécialisées, les protocoles peut être complété en un minimum de temps sans purification de l'ADN avant.
Disclosures
Production et le libre accès à cet article est sponsorisé par Thermo Fisher Scientific, Inc
Acknowledgments
Pour les échantillons d'Arabidopsis et les amorces de PCR concernés, nous remercions le professeur Jaakko Kangasjärvi et son groupe, le Groupe stress des plantes, biologie végétale, Département des sciences biologiques, Université de Helsinki. Les expériences avec la méthode traditionnelle ont été réalisés par Mme Airi Lamminmäki.
Échantillons de souris transgéniques ont été fournies par le Dr Jaana Vesterinen, Institut de biomédecine / Biochimie, Université d'Helsinki.
Harris Uni-Core et Tapis de découpe Harris sont des marques de Shunderson Communications Inc Toutes les autres marques sont la propriété de Thermo Fisher Scientific Inc et de ses filiales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phire Plant Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-130 | 200 reactions (50 μl each) |
| Phire Animal Tissue Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-140 | 200 reations (50 μl each) |
| Harris Uni-Core 0.35 mm (pink) | Thermo Fisher Scientific | F-180S/L | Qty: 5/25 |
| Harris Uni-Core 0.50 mm (blue) | Thermo Fisher Scientific | F-185S/L | Qty: 5/25 |
| Harris Cutting Mat 6.4 × 7.6 cm | Thermo Fisher Scientific | F-190 | Qty: 5 |
| SspI | Thermo Fisher Scientific | ER0771 | 100 μl (100 reactions) |
| Piko 24-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | TCP0024 | |
| 24-Well Piko PCR Plates | Thermo Fisher Scientific | SLP0241 | |
| GeneJET PCR Purification Kit |
Thermo Fisher Scientific | K0701 K0702 |
50 preps 250 preps |
References
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