Summary
وقد وضعنا برنامجا ميكروأري عالية الكثافة التي تتألف من 3D نانو الأغشية الحيوية من
Abstract
المبيضات البيض يبقى العامل الرئيسي المسبب لداء المبيضات، والتي تمثل في الوقت الراهن رابع أكثر شيوعا عدوى المستشفيات مجرى الدم في مستشفيات الولايات المتحدة 1. هذه العدوى الانتهازية تشكل تهديدا متزايدا بالنسبة لعدد متزايد من الأفراد للخطر، وتحمل معدلات وفيات مرتفعة بشكل غير مقبول. هذا ويرجع ذلك جزئيا إلى ترسانة محدودة من الأدوية المضادة للفطريات، ولكن أيضا إلى ظهور مقاومة ضد وكلاء ومضاد للفطريات الأكثر شيوعا. يزيد من تعقيد العلاج هو حقيقة أن ترتبط غالبية مظاهر المبيضات مع تشكيل الأغشية الحيوية، وخلايا داخل هذه الأغشية الحيوية تظهر زيادة مستويات المقاومة للمضادات الفطور معظم سريريا المستخدمة 2. نحن هنا وصف وضع ميكروأري عالية الكثافة التي تتكون من C. المبيضة البيضاء نانو الأغشية الحيوية، والتي قمنا اسمه كا BChip 3. لفترة وجيزة، يتم استخدام microarrayer الروبوتية تيس خلايا الخميرة الطباعة من C. المبيضة البيضاء على ركيزة صلبة. أثناء الطباعة، يتم تضمين خلايا الخميرة في مصفوفة ثلاثية الأبعاد باستخدام حجم ما يصل الى 50 NL ويجمد على ركيزة الزجاج بطلاء مناسب. بعد الطباعة الأولية، وحضنت الشرائح على 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة للسماح للتنمية بيوفيلم. خلال هذه الفترة بقع تنمو لتصبح كاملة النمو "نانو الأغشية الحيوية" الذي عرض نموذجي الخصائص الهيكلية والمظهري المرتبطة جيم ناضجة المبيضة البيضاء الأغشية الحيوية (أي تعقيد الصرفية، وثلاثة الأبعاد والهندسة المعمارية المقاومة للأدوية) 4. وبشكل عام، يتكون BChip الكالسيوم من الأغشية الحيوية ما يعادل 750 ~ ومميزة مكانيا، مع ميزة إضافية التي يمكن طباعتها رقائق متعددة ومعالجتها في وقت واحد. ويقدر بقاء الخلية عن طريق قياس كثافة فلوري من FUN1 التمثيل الغذائي وصمة باستخدام ماسح ضوئي ميكروأري. يعتبر مثاليا هذه الشريحة الفطرية لأجلك ..سراج الدين في الفرز الفائق الإنتاجية الحقيقية لاكتشاف الأدوية المضادة للفطريات. بالمقارنة مع المعايير الحالية (أي لوحة microtiter 96-جيدا نموذج من تشكيل بيوفيلم 5)، والمزايا الرئيسية للرقاقة بيوفيلم الفطرية والتشغيل الآلي، والتصغير، وفورات في حجم وتكاليف الكواشف ووقت التحليلات، فضلا عن القضاء على عمل خطوات مكثفة. ونحن نعتقد أن مثل هذه رقاقة تسريع كبيرة في اكتشاف دواء مضاد للفطريات عملية.
Protocol
1. إعداد الشرائح Functionalized
- وضع شرائح المجهر في رفوف الشريحة القابلة للإزالة، ويغسل مرتين من تخبط في وعاء يحتوي على تلطيخ الايثانول 99٪ (الصف النسيجية). مسح الشرائح تنظيف استخدام المناديل الورقية (لضمان عدم تولد الغبار ورقة)، والجاف باستخدام طائرة من غاز النيتروجين المضغوط.
ملاحظة: لا تستخدم كيم المسحات لمسح الشرائح كما من شأنه أن يولد غرامة الغبار ورقة.
- تزج رف الشريحة التي تحتوي على الشرائح في وعاء مليء تلطيخ حامض الكبريتيك المركز واحتضانها في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
ملاحظة: لتجنب ملامسة الجلد، واستخدام مقاومة للمواد الكيميائية والقفازات ونظارات السلامة أثناء العمل مع الأحماض والمواد الكيميائية السامة والمسببة للتآكل.
- يصوتن الشرائح لمدة 30 دقيقة، ويغسل مع ميلي-Q (18 MΩ) الماء لمدة 30 دقيقة، مع متابعة آخر يغسل فيcetone لمدة 5 دقائق. هذا العلاج يعرض مجموعات silanol على سطح الزجاج.
- معطف الشرائح نظيفة مع 2.5٪ (المجلد / المجلد في الماء) من aminopropyltriethoxysilane-3 (APTES) حل، بغمر رف الشريحة في APTES لمدة 30 دقيقة، والغسيل 3 مرات في الملة-Q الماء لمدة 15 دقيقة كل الغسيل، والخبز الشرائح في الفرن على 110 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. الخبز يسمح عبر الربط بين APTES، مما أدى إلى-functionalization-NH2 من السطح.
ملاحظة: تحقق الحل APTES في وعاء من البلاستيك منذ الودائع APTES تفضيلي على جدران إناء زجاجي.
- باستخدام تدور المغطي، معطف الشرائح مع 1٪ (وزن / المجلد في التولوين) البوليستيرين-CO-هيدرازيد الاندريد (PS-MA) (سيجما) للتوصل إلى أحادية طبقة من طلاء مسعور 6. إضافة 2.0 مل من PS-MA على شريحة زجاجية نظيفة شنت على المغطي تدور ومعطف في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ق. قد تختلف هذه الشروط على معايير طلاء تدور مثل طلاء لذلكlution، الركيزة، سمك الطلاء والتي تحكمها المعادلة التالية (7)
حيث ح هو سمك طلاء الفيلم، والبريد هو معدل التبخر، η، C و ρ هي اللزوجة، والتركيز والكثافة من الحل طلاء، على التوالي، وω هي السرعة الزاوية.
ويوصى التولوين هو ضار عند استنشاقه لفترة طويلة واستخدام غطاء الدخان: ملاحظة.
- ويمكن تخزين الشرائح في رف الشريحة لمدة تصل الى شهر واحد في ظروف جافة خالية من الغبار، في 2-8 درجة مئوية.
2. إعداد قائح الخميرة وتغليف الكولاجين
- تعد الثقافة بين عشية وضحاها من C. المبيضة البيضاء سلالة SC5314، في البيبتون خميرة سكر العنب [YPD، و 10 جرام / لتر خلاصة الخميرة، و 20 البيبتون غ / ل و 20 الدكستروز غ / ل] المتوسطة السائل، فحقن مستعمرة واحدة من C. آلbicans إلى 10-20 مل من YPD 8. احتضان الثقافة في شاكر المداري (حوالي 150-200 دورة في الدقيقة) حتى 30 درجة مئوية خلال الليل. مخزنة حصاد 1 مل خميرة المبيضة البيضاء الخلايا المبيضات من ثقافات YPD بين عشية وضحاها (بواسطة الطرد المركزي عند 5000 دورة في الدقيقة لمدة 5-10 دقائق)، وغسل مرتين لمدة 10 دقيقة في 1 مل من الفوسفات العقيمة المالحة (PBS، و 10 العازلة الفوسفات مم، 2.7 ملي مول كلوريد البوتاسيوم، 137 ملم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4) (سيجما) للغسيل. غسلت حصاد الخلايا أيضا بواسطة الطرد المركزي في 1900 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. Resuspend الخلايا غسلها في 1 العازلة إعادة الإعمار مل (0.2 محلول هيدروكسيد الصوديوم N مع بيكربونات الصوديوم 2.2٪ (وزن / المجلد) و 4.8٪ (وزن / المجلد) HEPES، ودرجة الحموضة 7.2).
ملاحظة: C. المبيضة البيضاء هي 1/BSL1 مجموعة الكائنات الحية الدقيقة المخاطر. تذكر دائما إلى حسن استخدام تقنيات التطهير / معقم للعمل مع هذه الكائنات الحية الدقيقة واتباع الإجراءات المؤسسية في مجال التخلص السليم من المواد biohazardous.
- عد الخلايا باستخدام hemocytometer على مجهر حقل مشرق والتكيف مع كثافة خلية من 5 × 10 7 خلية / مل.
- تخفيف مزيد من التعليق عشر مرات من قبل اضافة 10 × RPMI-1640 تستكمل مع الجلوتامين-L ومخزنة مع morpholinepropanesulfonic (اجتماعات الأطراف) حامض (درجة الحموضة 7.2).
- تغليف خلايا الخميرة في الكولاجين عن طريق خلط تعليق خلية في RPMI-1640 مع الكولاجين (1.8 ملغ / مل) (نوع 1 من ذيل فأر، العلوم البيولوجية دينار بحريني، بيدفورد، ماجستير)، للحصول على تركيز نهائي من 4 × 10 6 خلية / مل. الحفاظ على تعليق الكولاجين خلية على الجليد لمنع دبق الكولاجين قبل الطباعة.
3. إعداد BChip كاليفورنيا
- تنظيف وتطهير جميع الأسطح من microarrayer، بما في ذلك غسل لوحة مصدر، محطة ومحطة فراغ، فراغ طبق من الشرائح وغرفة الطباعة، من قبل القضاء مع 70٪ الأيزوبروبانول.
- وتضع عقد من فراغ العدد المرغوب فيه من الشرائح الزجاجية PS-MA-المغلفة على سطح الشريحة من هيئة التصنيع العسكريroarrayer.
- دوامة تعليق خلية في الكولاجين بقوة ونضح 100 ميكرولتر من تعليق الجيدة الخلط في بئر من لوحة 96-جيدا، فقط قبل الطباعة. وضع هذه اللوحة مصدر في محطة التحميل.
- التبديل على مرطب للحفاظ على الرطوبة النسبية 100٪ في غرفة ميكروأري في جميع مراحل عملية الطباعة.
- طباعة 50 NL من تعليق خلية في مجموعة من 48 الصفوف والأعمدة 16 مع وجود بقع متباعدة 1.2 مم وبصرف النظر باستخدام نصاب ميكروأري (Omnigrid مايكرو، Digilab شركة، Holliston، MA) من غير اتصال ترسيب باستخدام مدبب بشكل مخروطي فوهة ميكرومتر نصائح السيراميك 190 (Digilab).
- رئيس الوزراء، شطف وفراغ الجافة النصائح مرتين بعد كل جولة من الطباعة.
- مباشرة بعد الطباعة، ضع الشريحة في غرفة، محكمة الغلق مرطب (كاسيت التهجين، ArrayIt شركة، سانيفيل كاليفورنيا)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة للسماح لتشكيل بيوفيلم.
4. اختبارات الحساسية للعلاقات العامةالأغشية الحيوية eformed BChip في كاليفورنيا ضد وكلاء مضاد
- من الحلول الأوراق المالية أو مسحوق من الأدوية المضادة للفطور، وإعداد العاملين في التوصل إلى حل وسط-1640 RPMI. التركيزات القصوى نموذجي من الحل تعمل على 1024 ميكروغرام / مل لفلوكونازول و 16 ميكروغرام / مل لالأمفوتريسين B 5. ويمكن استخدام تركيزات أخرى عن وكلاء مختلفة.
- 8 إعداد تركيزات مختلفة من مركب من تمييع الحل الأوراق المالية في شقين التخفيفات، تغطي مجموعة مع IC يقدر بنحو 50 لمجمع في وسطه.
- بعد 24 ساعة من نمو بيوفيلم، استخدم microarrayer لطباعة 50 NL ثمانية تركيزات مختلفة من الأدوية، إلى جانب إيجابي (أي خلايا أي دواء في وسائل الاعلام فقط) والسلبية (تعامل مع هيبوكلوريت الصوديوم لمدة 20 دقيقة) وعناصر التحكم، في ما لا يقل عن 6 مكررات على أعلى من الأغشية الحيوية.
ملاحظة: المحافظة على الرطوبة النسبية 100٪ لمنع تجفيف من البقع في حين الوظيفةجى المخدرات.
- بعد فترة وجيزة واضاف ان المخدرات، واحتضان الشريحة مع المخدرات في غرفة مرطب على 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- غسل المخدرات قبالة عن طريق التغميس في CaBChip 3-5 مرات لمدة 2 دقيقة في كل مرة في برنامج تلفزيوني وصمة عار من احتضان BChip الكالسيوم مع 0.5 ميكرومتر FUN1 عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة 9.
- غسل وصمة عار قبالة عن طريق التغميس في BChip الكالسيوم 3-5 مرات في برنامج تلفزيوني لمدة دقيقة كل 1-3 دونك، وتجفيف BChip كاليفورنيا باستخدام تيار النيتروجين. قراءة كثافة مضان باستخدام ماسح ضوئي ميكروأري (GenePix 4100A، أكسون الآلات، كاليفورنيا) في الطول الموجي من 532 نانومتر مع زيادة PMT من 380.
- تعيين كثافة مضان من السيطرة الايجابية (لا للمخدرات) وميت (مبيض المعالجة) البقع بيوفيلم بنسبة 100٪ و 0٪، على التوالي.
- تحديد نسبة تثبيط بواسطة الانخفاض في كثافة مضان (F) وفقا لمتوسط من النقاط للسيطرة على استخدام المعادلة التالية
حيث F، F ماكس وفهرنهايت هي كثافة مضان الخام من معاملة المخدرات، ومكافحة المخدرات وعدم تبييض البقع المعالجة، على التوالي. تم تعديل إعدادات الماسح الضوئي للحصول على أقصى F و F يا من 30000 و 4000 RFU، على التوالي.
- حساب تركيز 50٪ أو المثبطة IC 50 بحلول تركيب تل منحدر متغير باستخدام معادلة GraphPad برامج بريزم (لا جولا، كاليفورنيا).
5. ممثل النتائج
مرجع مصدق ممثل BChip، التي تتألف من 48 × 16 مجموعة من النانو الأغشية الحيوية من C. ويرد المبيضة البيضاء، في الشكل 2. في مجال مشرق المجهري يظهر ميزة الشاملة المعماري للنانو بيوفيلم. لمسح الصور المجهرية الإلكترون من العرض بيوفيلم التي هي جزء لا يتجزأ من خيوط فطرية داخل مصفوفةألياف الكولاجين، والتي هي حوالي 2 ميكرومتر و 100 نانومتر في القطر، على التوالي. الماسح الضوئي ميكروأري FUN1 الملطخة تظهر الصور الخميرة وأشكال خوطي، التي هي سمة من الأغشية الحيوية الفطرية. ويمكن رؤية هذه الصور 2D و 3D-مبائر ومضان من FUN1 الملطخة الأغشية الحيوية لديها التنوع المكاني، مع مناطق من خلايا نشطة تتخللها عملية الأيض داخل المصفوفة خارج الخلية (التي تتألف من الكولاجين كمادة التغليف، وعلى الأرجح أيضا من المواد التي تنتجها exopolymeric خلايا بيوفيلم)، والذي لم تلطخ بواسطة الصبغة الأيض. وقدرت سماكة بيوفيلم أن يكون ما يقرب من 50 ميكرون. تم استخدام BChip كاليفورنيا لتقدير قابلية مضاد للعقارين، فلوكونازول وباء الامفوتريسين، وتظهر النتائج في الشكل (3). يتفق مع تقارير نشرت على مستوى صناعة المقايسات لوحة 96-جيدا، والأغشية الحيوية هي مقاومة ضد فلوكونازول (10) وجيم محسوب 50 لل الأمفوتريسين B هو 0.3 ميكروغرام / مل 11.
الرسم البياني رقم التدفق 1. لصنع BChip الكالسيوم.
الشكل 2. صورة لBChip الكالسيوم عالية thoughput، وطبع باستخدام microarrayer الروبوتية والتي تحتوي على 768 نقاط في PS-MA-المغلفة الشرائح. كل بقعة نصف كروي هو 50 NL في الحجم، وحوالي 700 ميكرون في القطر، مع وجود انفصال بين 1،2 ملم البقع. أظهرت أيضا (في اتجاه عقارب الساعة) هي المجهر الضوئي، وماسحة ضوئية ميكروأري، الفحص المجهري 2D، 3D والتألق، ومسح الصور المجهر الإلكتروني من الأغشية الحيوية الفردية على BChip الكالسيوم. الشكل ووزارة شؤون المرأة في التكبير عالية من 25000 س يظهر الخيط خوطي من 2 ميكرومتر عرض.
الشكل 3 "SRC =" / files/ftp_upload/3845/3845fig3.jpg "/>
الشكل 3. نتائج اختبار الحساسية للأدوية المضادة للفطريات، وتحديد القيم 50 IC: (أ) فلوكونازول و (ب) B الأمفوتريسين باستخدام الكالسيوم BChip. تظهر الصور مضان المجهر من الأغشية الحيوية B-المعالجة الأمفوتريسين في (C). فإن النتائج هي متوسط ± الخطأ المعياري يعني لاثنين من رقائق منفصلة تحتوي على 10 مكررات لكل حالة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد وضعنا خلية مقرها عالية الكثافة ميكروأري]، كاليفورنيا BChip، ويتألف من وحدات التخزين نانولتر من الأغشية الحيوية المبيضات البيض. تم طباعة ميكروأري على تعديل ركائز الزجاج، والذي سمح لمرفق قوي من بقع جل الكولاجين في الوقت الذي توفر hydrophobicity اللازمة للمادة هلامية غير الانتشار، 3D نصف كروية. ويمكن لاحد كا BChip تحل محل حوالي ثماني لوحات 96-جيدا، ويمكن طباعة عدة شرائح ومعالجتها في الوقت نفسه. رقاقة تستخدم نانو النطاق الثقافات، ويسمح لسهولة التعامل وبسرعة، غير قابلة للأتمتة، يقلل من العمل اليدوي والتكاليف ومتوافق تماما مع تكنولوجيا ميكروأري معيار والمعدات. وعلاوة على ذلك، فإن التكنولوجيا هي مرنة، ويمكن أن تتكيف بسهولة مع الكائنات الحية الدقيقة الأخرى. على الرغم من التصغير، والنانو الأغشية الحيوية التي شكلت في خصائص العرض BChip الكالسيوم التي هي سمة من C. المبيضة البيضاء بيوفيلم نمط الحياة، بما في ذلك البنيان 3Dه، ومقاومة الجراثيم للأدوية. وهكذا، فإن BChip كاليفورنيا يسمح لفحص عالية الإنتاجية الحقيقية، ولديه القدرة لنقلة نوعية في اكتشاف الأدوية المضادة للجراثيم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
خوسيه لوبيز L. ريبوت وأناند الأسهم Ramasubramanian K. الخاصة في شركة MicrobeHTS، والتكنولوجيات، التي تقوم بتطوير وكلاء مضاد للفطريات. قدمت MicrobeHTS تكنولوجيز، شركة أي دعم مالي لهذه الدراسات.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من إدارة تقنية جنوب ولاية تكساس (POCrr 2009.041)، ومعهد للتكامل الطب والعلوم من المركز الوطني للبحوث الموارد (UL 1RR025767)، و من المعهد الوطني لأبحاث طب الأسنان والجمجمة ( 5R21DE017294).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Polystyrene-Co-Maleic Anhydride (PS-MA) | Sigma-Aldrich | 426946 | |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | |
| Rat Tail collagen type I | BD Biosciences | 354236 | |
| Robotic Microarrayer | Omnigrid Micro | MICROSYS4000/4100A | |
| Microarray Scanner | Genepix Personal 4100A | GENEPIX4100A | |
| Hybridization Cassette | ArrayIt Corporation | AHCXD | |
| FUN1 [2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-phenylquinoliniumiodide] | Invitrogen Corp. | F-7030 | |
| Fluconazole | Sicor Pharmaceuticals, Inc. | J02AC01 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2411 | |
| RPMI-1640 | Mediatech, Inc. | 50-020-PC | |
| Ceramic Tip 190 μm orifice | Digilab | 60020441-00 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc. | ||
| Genepix Pro V4.1 | Molecular Devices |
References
- Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
- Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
- Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
- Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
- Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
- Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
- Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).
