Summary
Nós desenvolvemos uma plataforma de microarray de alta densidade que consiste em 3D nano-biofilmes de
Abstract
Candida albicans continua a ser o principal agente etiológico da candidíase, que atualmente representa a infecção da corrente sangüínea quarta nosocomial mais comum em hospitais dos Estados Unidos 1. Estas infecções oportunistas são uma ameaça crescente para um número crescente de indivíduos comprometidos, e levar as taxas de mortalidade inaceitavelmente elevados. Isto é em parte devido ao arsenal limitado de drogas antifúngicas, mas também para o aparecimento de resistência contra os agentes mais utilizados antifúngicos. Para complicar ainda mais o tratamento é o facto de que uma maioria das manifestações de candidíase estão associados com a formação de biofilmes, e as células dentro destas biofilmes mostrar aumento dos níveis de resistência à maioria clinicamente utilizados agentes antifúngicos 2. Descrevemos aqui o desenvolvimento de uma micromatriz de alta densidade, que consiste de C. albicans nano-biofilmes, o que temos chamado Ca BChip 3. Resumidamente, um microarrayer robótico é utilizado tO impressão células de levedura de C. albicans sobre um substrato sólido. Durante a impressão, as células de levedura são colocadas em uma matriz tridimensional usando um volume tão baixo como 50 nL e imobilizada sobre um substrato de vidro com um revestimento adequado. Após a impressão inicial, as lâminas são incubadas a 37 ° C durante 24 horas para permitir a formação do biofilme. Durante este período, as manchas crescem em plenamente desenvolvidos "nano-biofilmes" que exibem características típicas estruturais e fenotípicos associados C. maduro albicans biofilmes (ie complexidade morfológica, três arquitetura dimensional e resistência às drogas) 4. Em geral, a BChip Ca é composto de ~ 750 biofilmes equivalentes e espacialmente distinto; com a vantagem adicional de que múltiplos chips podem ser impressos e processados simultaneamente. A viabilidade celular é estimada pela medição da intensidade de fluorescência de fun1 metabólica mancha usando um scanner microarray. Este chip de fungos é ideal para usi na triagem de alto rendimento verdadeiro para a descoberta de drogas anti-fúngico. Em comparação com as normas em vigor (isto é, a de 96 poços modelo placa de microtitulação de biofilme formação 5), as principais vantagens do chip biofilme fúngica são automação, a miniaturização, a poupança em quantidade e custo dos reagentes e análises em tempo, bem como a eliminação do trabalho passos intensivos. Acreditamos que tais chips irá acelerar significativamente o processo de descoberta de drogas antifúngicas.
Protocol
1. Preparação de Slides funcionalizados
- Colocar as lâminas de microscópio em um porta-lâminas removível, e lava-se duas vezes por imersão em um frasco de coloração contendo etanol a 99% (grau histológico). Limpe as lâminas limpar usar toalhas de papel (garantia não gerar poeira de papel) e secos usando um jato de gás comprimido nitrogênio.
NOTA: Não use Kim-Wipes para limpar as lâminas como iria gerar poeira de papel fino.
- Mergulha-se o porta-lâminas contendo as lâminas em um frasco de coloração com ácido sulfúrico concentrado e incube à temperatura ambiente durante a noite.
NOTA: Para evitar o contato com a pele, usar produtos químicos resistentes luvas e óculos de segurança ao trabalhar com ácidos concentrados e produtos químicos tóxicos e corrosivos.
- Sonicar as lâminas durante 30 min e lavagem com Milli-Q (18 mohms) de água durante 30 min, seguir com outra lavagem em umcetona durante 5 min. Este tratamento expõe os grupos silanol na superfície do vidro.
- Revestir as lâminas limpas com 2,5% (vol / vol em água) de 3-aminopropiltrietoxissilano (APTES) de solução, por imersão do porta-lâminas em APTES durante 30 min, lavar 3 vezes em água Milli-Q durante 15 min cada lavagem, e panificação as lâminas num forno a 110 ° C durante 15 min. Cozimento permite a ligação cruzada das APTES, resultando em-NH2 funcionalização de superfície.
NOTA: Verifique a solução APTES em um recipiente de plástico desde APTES depósitos preferencialmente nas paredes do recipiente de vidro.
- Usando um spin revestidor revestimento, as lâminas com 1% (peso / vol em tolueno) de poliestireno-Co-anidrido maleico (PS-MA) (Sigma) para atingir uma mono-camada de revestimento hidrofóbico 6. Adicionar 2,0 mL de PS-MA numa lâmina de vidro limpo montado sobre um revestidor de spin e pelagem a 3.000 rpm durante 30 s. Estas condições podem variar de acordo com parâmetros de rotação de revestimento como revestimento paralução, o substrato de espessura, de revestimento e regulada pela seguinte equação 7
em que h é a espessura da película de revestimento, e é a taxa de evaporação, η, C e ρ são a concentração de viscosidade e densidade da solução de revestimento, respectivamente, e ω é a velocidade angular.
NOTA: O tolueno é prejudicial quando inalado por um longo tempo e da utilização de um exaustor é recomendada.
- As lâminas podem ser armazenadas em um porta-lâminas para até um mês em seco, o pó condições isentas de a 2 - 8 ° C.
2. Preparação dos inóculos de leveduras e encapsulamento de colágeno
- Prepare uma cultura durante a noite de C. albicans estirpe SC5314, em levedura Peptona Dextrose [YPD; 10 g / L de extracto de levedura, 20 g / L de peptona e 20 g / L de dextrose] meio líquido por inoculação de uma única colónia de C. albicans em 10-20 mL de YPD 8. Incubar cultura em um agitador orbital (cerca de 150 - 200 rpm) a 30 ° C durante a noite. Colheita 1 mL de Candida albicans células de leveduras obtidas durante a noite culturas YPD (por centrifugação a 5.000 rpm durante 5-10 minutos) e lava-se duas vezes durante 10 min em 1 ml de fosfato estéril tamponada salina (PBS; tampão fosfato 10 mM, 2,7 mM cloreto de potássio, cloreto de sódio 137 mM, pH 7,4) (Sigma) por lavagem. Colheita lavada células também por centrifugação a 1900 rpm durante 10 minutos. Ressuspender as células lavadas em tampão de 1 a reconstrução mL (0,2 N solução de NaOH com bicarbonato de sódio 2,2% (peso / vol) e 4,8% (p / vol) de HEPES, pH 7,2).
NOTA: C. albicans é um microorganismo de Risco 1/BSL1 Grupo. Lembre-se sempre usar boas técnicas assépticas / estéril para o trabalho com este microorganismo e seguir os procedimentos institucionais para o descarte adequado de materiais perigosos.
- Contar as células utilizando um hemocytometer sobre um microscópio de campo brilhante e se ajustar a uma densidade celular de 5 x 10 7 células / mL.
- Além disso diluir a suspensão de dez vezes por adição de 10 × RPMI-1640 suplementado com L-glutamina e tamponado com morpholinepropanesulfonic (MOPS) de ácido (pH 7,2).
- Encapsular as células de levedura em colagénio por mistura da suspensão de células em meio RPMI-1640 com colagénio (1,8 mg / mL) (Tipo 1 a partir de cauda de rato, BD Biosciences, Bedford, MA), para se obter uma concentração final de 4 × 10 6 células / mL. Manter a suspensão de colagénio de células em gelo para evitar a gelificação do colagénio antes da impressão.
3. Preparação de Ca BChip
- Limpar e desinfectar todas as superfícies do microarrayer, incluindo a placa de lavagem estação de origem, e da estação de vácuo, travessa corrediça vácuo e câmara de impressão, limpando-o com 70% de isopropanol.
- Coloque e mantenha a vácuo o número desejado de slides PS-MA revestidos de vidro sobre o conjunto de slides do microfoneroarrayer.
- Vórtice a suspensão da célula em colagénio vigorosamente e aspirar 100 uL da suspensão bem misturada em um poço de uma placa de 96 poços, pouco antes da impressão. Coloque esta placa de origem na estação de carregamento.
- Ligue o humidificador para manter uma humidade relativa de 100% na câmara de microarray ao longo do processo de impressão.
- Imprimir 50 nL de suspensão de células em uma matriz de 48 linhas e 16 colunas com manchas espaçadas de 1,2 mm para além usando um spotter microarray (Omnigrid Micro, Inc. Digilab, Holliston, MA) por não-contato deposição usando cónica cônicos 190 dicas mM orifício de cerâmica (Digilab).
- Primeiro, lavar e aspirar-seque as pontas duas vezes depois de cada rodada de impressão.
- Imediatamente após a impressão, coloque a lâmina em uma câmara estanque ao ar, humedecido (cassete de hibridação, ArrayIt Corporation, Sunnyvale, CA) e incubar a 37 ° C durante 24 horas para permitir a formação de biofilmes.
4. Testes de susceptibilidade de PrBiofilmes eformed em Ca BChip contra agentes antifúngicos
- De soluções de reserva ou pó de drogas antifúngicas, preparar uma solução de trabalho em meio RPMI-1640. Típicos concentrações máximas da solução de trabalho são 1.024 ug / mL para fluconazol e 16 ug / mL para a anfotericina B 5. Outras concentrações podem ser utilizados para diferentes agentes.
- Preparar oito concentrações diferentes do composto por diluição da solução estoque em duas diluições, abrangendo uma gama com o IC 50 estimado do composto no meio.
- Após 24 h de crescimento do biofilme, utilizar o microarrayer para imprimir 50 nL de oito diferentes concentrações dos fármacos, juntamente com positiva (isto é, não existem células de drogas em meios apenas) e negativo (tratada com hipoclorito de sódio durante 20 min) controlos, em pelo menos seis repetições em cima dos biofilmes.
NOTA: Manter uma humidade relativa de 100% para evitar a secagem das manchas, enquanto suplementoção das drogas.
- Logo após a adição dos fármacos, incubar o chip com os medicamentos em uma câmara humidificada a 37 ° C durante 24 hr.
- Lavar os medicamentos fora por dunking o CaBChip 3-5 vezes durante 2 min de cada vez em PBS e mancha por incubação da BChip Ca com 0,5 uM fun1 a 37 ° C durante 30 min 9.
- Lava-se a mancha por dunking o BChip Ca 3-5 vezes em PBS durante 1-3 min cada enterrada, e secar a BChip Ca usando uma corrente de azoto. Ler a intensidade de fluorescência utilizando um digitalizador microarray (GenePix 4100A, Axon Instruments, CA) com um comprimento de onda de 532 nm com um ganho de PMT de 380.
- Definir a intensidade de fluorescência do controlo positivo (sem fármaco) e mortos (lixívia) tratados com manchas de biofilme a 100% e 0%, respectivamente.
- Determinar a percentagem de inibição pela redução na intensidade de fluorescência (F) em relação à média dos pontos de controlo utilizando a seguinte equação
onde F, F max e F-primas são o intensidades de fluorescência de drogas tratados, nenhum medicamento de controle e tratados com lixívia pontos, respectivamente. As configurações do scanner foram ajustados para obter F max e F o de 30000 e 4000 RFU, respectivamente.
- Calcular a concentração inibitória 50% ou IC 50 encaixando a equação de Hill variável inclinação utilizando GraphPad Software Prism (La Jolla, CA).
5. Os resultados representativos
Um representante Ca BChip, consistindo de um 48 × 16 conjunto de nano-biofilmes de C. albicans, é mostrado na Figura 2. A microscopia de campo claro mostra uma característica geral de arquitetura do nano-biofilme. As imagens microscópicas de elétrons de digitalização do show que o biofilme hifas fúngicas são incorporados dentro da matriz defibras de colagénio, que são cerca de 2 uM e 100 nm de diâmetro, respectivamente. Os fun1 manchadas de imagens do scanner microarray mostrar o fermento e as formas de hifas, que são característicos de biofilmes de fungos. As imagens 2D e 3D-confocal de fluorescência de fun1 coradas biofilmes pode ser visto como tendo heterogeneidade espacial, com as regiões de células metabolicamente activas intercaladas no interior da matriz extracelular (composto de colagénio como o material de encapsulação e muito provavelmente também de material exopolymeric produzido por células do biofilme), que não é coradas pelo corante metabólicas. A espessura do biofilme foi estimada em cerca de 50 uM. O BChip Ca foi utilizada para estimar a susceptibilidade antifúngica de dois fármacos, fluconazol e anfotericina B, e os resultados são mostrados na Figura 3. Consistente com relatórios publicados sobre ensaios padrão da indústria placa de 96 poços, os biofilmes são resistentes contra o fluconazol 10 e 50 do IC calculado para anfotericina B é de 0,3 ug / mL 11.
Figura Fluxograma 1. Para a fabricação de Ca BChip.
Figura 2. A imagem do alto thoughput Ca BChip, impresso usando um microarrayer robótica e contendo 768 pontos em PS-MA-revestidos slides. Cada ponto é hemisférica 50 nL, em volume, cerca de 700 um de diâmetro, e com uma separação de 1,2 mm entre pontos. Também é mostrado (sentido horário) são microscopia de luz, scanner microarray, microscopia 2D e 3D-fluorescência, e digitalização de imagens de microscopia eletrônica dos biofilmes individuais na BChip Ca. A figura SEM com ampliação elevada de 25.000 x mostra um filamento de hifas de largura de 2 uM.
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Figura 3. Resultados dos testes de susceptibilidade antifúngica e determinação de valores de IC50 para (A) fluconazol e (B) a anfotericina B, utilizando Ca BChip. As imagens de microscopia de fluorescência de anfotericina B tratadas com biofilmes são mostrados em (C). Os resultados são a média ± erro padrão para significar dois chips separados contendo 10 réplicas para cada condição.
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Discussion
Nós desenvolvemos uma célula baseado microarray de alta densidade, Ca BChip, consistindo em volumes nanolitros de biofilmes de Candida albicans. O microarray foi impresso em substratos de vidro modificado, o que permitiu a fixação robusta de pontos de gel de colágeno, proporcionando hidrofobicidade necessário para um não-divulgação, gel hemisférica 3D. Um único Ca BChip pode substituir cerca de oito placas de 96 alvéolos, e vários chips podem ser impressos e processado, ao mesmo tempo. O chip utiliza nano-escala culturas, permite a manipulação fácil e rápido, é passível de automação, minimiza o trabalho manual e os custos e é totalmente compatível com a tecnologia de microarray padrão e equipamentos. Além disso, a tecnologia é flexível e pode ser facilmente adaptado a outros microorganismos. Apesar da miniaturização, os nano-biofilmes formados sobre as propriedades de exibição Ca BChip que são característicos do C. albicans biofilme estilo de vida, incluindo 3D architecturE e resistência à droga. Assim, o BChip Ca permite uma seleção de alto rendimento verdadeiro, e tem o potencial para uma mudança de paradigma na descoberta de medicamentos antimicrobianos.
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Disclosures
Jose L. Lopez-Ribot e Anand K. equidade Ramasubramanian própria MicrobeHTS Technologies, Inc., que está desenvolvendo agentes antifúngicos. MicrobeHTS Technologies, Inc. não forneceu qualquer apoio financeiro para estes estudos.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte por doações do Sul do Texas Technology Management (POCrr 2009,041), o Instituto para a Integração de Medicina e Ciência do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos (UL 1RR025767), e do Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial ( 5R21DE017294).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Polystyrene-Co-Maleic Anhydride (PS-MA) | Sigma-Aldrich | 426946 | |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | |
| Rat Tail collagen type I | BD Biosciences | 354236 | |
| Robotic Microarrayer | Omnigrid Micro | MICROSYS4000/4100A | |
| Microarray Scanner | Genepix Personal 4100A | GENEPIX4100A | |
| Hybridization Cassette | ArrayIt Corporation | AHCXD | |
| FUN1 [2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-phenylquinoliniumiodide] | Invitrogen Corp. | F-7030 | |
| Fluconazole | Sicor Pharmaceuticals, Inc. | J02AC01 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2411 | |
| RPMI-1640 | Mediatech, Inc. | 50-020-PC | |
| Ceramic Tip 190 μm orifice | Digilab | 60020441-00 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc. | ||
| Genepix Pro V4.1 | Molecular Devices |
References
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