Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) för hög genomströmning antimykotikum Screening

Published: July 18, 2012 doi: 10.3791/3845

Summary

Vi har utvecklat en hög densitet microarray-plattform som består av 3D nano-biofilmer av

Abstract

Candida albicans är fortfarande den viktigaste etiologiska medlet för candidiasis, som för närvarande representerar den fjärde vanligaste nosokomial blodomloppet infektion i amerikanska sjukhus 1. Dessa opportunistiska infektioner utgör ett växande hot för ett ökande antal nedsatt individer, och bära oacceptabelt hög dödlighet. Detta beror delvis på grund av den begränsade arsenal av läkemedel mot svamp, men även till uppkomsten av resistens mot de vanligast använda antimykotika. Ytterligare komplicerande behandling är det faktum att en majoritet av manifestationer av candidainfektion är associerade med bildningen av biofilmen, och celler inom dessa biofilmer visar ökade nivåer av resistens mot de flesta kliniskt använda antimykotika 2. Här beskriver vi utvecklingen av en hög täthet microarray som består av C. albicans nano-biofilmer, som vi har namngett Ca BChip 3. Kortfattat är en robotliknande microarrayer används to skriva ut jästceller av C. albicans på ett fast substrat. Under tryck, är de jästceller inneslutna i en tredimensionell matris med användning av en volym så låg som 50 nL och immobiliseras på ett glassubstrat med en lämplig beläggning. Efter initial tryck, är objektglasen inkuberades vid 37 ° C under 24 timmar för att medge biofilmen utveckling. Under denna period fläckarna växa till fullt utvecklade "nano-biofilmer" som visar typiska strukturella och fenotypiska egenskaper förknippade med mogna C. albicans biofilmer (dvs morfologiska komplexitet, tredimensionell arkitektur och läkemedelsresistens) 4. Sammantaget är Ca BChip består av ~ 750 motsvarande och rumsligt distinkt biofilmer, med den ytterligare fördelen att flera chips kan skrivas ut och bearbetas samtidigt. Cellviabilitet uppskattas genom mätning av fluorescensintensiteten hos FUN1 metabolisk färgning med användning av en mikromatris skanner. Denna svamp chip är idealisk för usig i sann högkapacitetsavsökning för antifungala läkemedel. Jämfört med gällande normer (dvs. 96-brunnsmikrotiterplatta modell av biofilm bildning 5) de viktigaste fördelarna med svamp biofilmen chip är automation, miniatyrisering, besparingar i mängd och kostnader för reagenser och analyser tid, liksom avskaffandet av arbets- intensiva steg. Vi tror att en sådan chip väsentligt kommer att påskynda svampdödande utveckling av nya läkemedel.

Protocol

1. Beredning av Funktionaliserade Slides

  1. Placera objektglas i ett avtagbart bild rack, och tvätta två gånger med nedsänkning i en färgning burk som innehåller 99% etanol (histologisk grad). Torka objektglasen rent med hushållspapper (se inte skapa pappersdamm), och torra med hjälp av en stråle av komprimerad kvävgas.

OBS: Använd inte Kim-Wipes att torka glasen eftersom det skulle skapa finpapper damm.

  1. Sänk bilden rack med glasen i en färgning burk fylld med koncentrerad svavelsyra och inkubera vid rumstemperatur över natten.

OBS: För att undvika kontakt med huden, använd kemikalieresistenta handskar och skyddsglasögon när du arbetar med koncentrerade syror och giftiga och frätande kemikalier.

  1. Sonikera objektglasen under 30 min och tvättning med Milli-Q (18 MQ) vatten under 30 min genom att följa med en annan tvätt i encetone under 5 min. Denna behandling exponerar silanolgrupper på glasytan.
  2. Belägga rena objektglas med 2,5% (volym / volym i vatten) av 3-aminopropyltrietoxisilan (APTES)-lösning, genom nedsänkning av sliden stället i APTES i 30 min, tvättning 3 gånger i Milli-Q-vatten under 15 min varje tvätt, och bakning de glider i en ugn vid 110 ° C under 15 minuter. Bakning tillåter tvärbindning av de APTES, vilket resulterar i-NH2-funktionalisering av ytan.

OBS: Gör APTES lösningen i ett plastkärl eftersom APTES avlagringar företrädesvis på väggarna i glasbehållare.

  1. Användning av en spinnbeläggare, kappa objektglasen med 1% (vikt / volym i toluen) polystyren-sam-maleinsyraanhydrid (PS-MA) (Sigma) för att uppnå en mono-skikt av hydrofob beläggning 6. Tillsätt 2,0 ml av PS-MA på ett rent objektglas monterade på en spinnbeläggare och beläggningen vid 3000 rpm under 30 s. Dessa betingelser kan variera beroende på parametrar spinnbeläggning såsom beläggning såföroreningarna, substrat, skikttjocklek och regleras av följande ekvation 7

Ekvation 1
där h är tjockleken av filmbeläggning, e är avdunstningshastigheten, η, C och ρ är viskositeten, koncentration och densitet av beläggningslösningen, respektive, och ω är vinkelhastighet.

OBS: Toluen är skadligt vid inandning under en lång tid och användning av ett dragskåp rekommenderas.

  1. Bilderna kan lagras i en bild rack för upp till en månad i torra, dammfria förhållanden vid 2 - 8 ° C.

2. Beredning av Jäst Inokula och kollagen Inkapsling

  1. Framställa en över natten kultur av C. albicans stam SC5314, i jäst, pepton Dextros [YPD; 10 g / L jästextrakt, 20 g / L pepton och 20 g / L dextros] vätskemedium genom ympning av en enda koloni av C. flbicans i 10 till 20 ml YPD-8. Inkubera kulturen i en orbitalblandare (ca 150 till 200 rpm) vid 30 ° C över natten. Skörd 1 ml Candida albicans jästceller från över natten YPD kulturer (genom centrifugering vid 5000 rpm under 5-10 minuter) och tvätta två gånger under 10 minuter i 1 ml steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 10 mM fosfatbuffert, 2,7 mM kaliumklorid, 137 mM natriumklorid, pH 7,4) (Sigma) per tvätt. Skörd tvättades cellerna också genom centrifugering vid 1900 rpm under 10 minuter. Resuspendera de tvättade cellerna i 1 ml rekonstruktion buffert (0,2 N NaOH-lösning med 2,2% (vikt / volym) natriumbikarbonat och 4,8% (vikt / volym) HEPES, pH 7,2).

OBS: C. albicans är en riskgrupp 1/BSL1 mikroorganism. Kom ihåg att alltid använda bra aseptiska / steril teknik för arbete med denna mikroorganism och följa de institutionella förfaranden för korrekt omhändertagande av biologiskt riskfyllda material.

  1. Räkna celler med användning av en hemocytOmeter på ett ljust fält mikroskop och anpassa sig till en celldensitet av 5 x 10 7 celler / ml.
  2. Ytterligare späda suspensionen tio gånger genom tillsats av 10 x RPMI-1640 kompletterat med L-glutamin och buffrades med morpholinepropanesulfonic (MOPS)-ättiksyra (pH 7,2).
  3. Inkapsla jästcellerna i kollagen genom blandning av cellsuspensionen i RPMI-1640 med kollagen (1,8 mg / ml) (typ 1 från råttsvans, BD Biosciences, Bedford, MA) för att få en slutlig koncentration av 4 x 10 6 celler / ml. Håll kollagen-cellsuspensionen på is för att förhindra gelning av kollagen före utskrift.

3. Framställning av Ca BChip

  1. Rengör och desinficera alla ytor microarrayer, inklusive källan plattan stationen tvätt och vakuum station, vakuum bild tallrik och tryck kammaren, genom att torka av med 70% isopropanol.
  2. Placera och håll med vakuum önskat antal PS-MA-belagda objektglas på bilden däck microarrayer.
  3. Virvel cellsuspensionen i kollagen om kraftigt och aspirera 100 | il av det välblandade suspensionen i en brunn av en 96-brunnsplatta, strax före tryckning. Placera denna källa platta i lastningsstationen.
  4. Slå på luftfuktaren för att upprätthålla en relativ fuktighet på 100% i microarray kammaren under hela tryckprocessen.
  5. Skriv 50 nL cellsuspension i en matris av 48 rader och 16 kolumner med fläckar avstånd 1,2 mm från varandra med hjälp av en microarray spotter (Omnigrid Micro, Digilab Inc., Holliston, MA) av icke-kontakt deposition med koniskt avsmalnande 190 nm öppning keramiska tips (Digilab).
  6. Prime, skölj och vakuum-torka tipsen två gånger efter varje omgång av utskrift.
  7. Omedelbart efter tryckning, placera objektglaset i en lufttät, fuktad kammare (Hybridisering kassett, ArrayIt Corporation, Sunnyvale, CA) och inkubera vid 37 ° C under 24 h för att medge bildning av biofilm.

4. Resistensbestämning av Preformed Biofilmer i Ca BChip Against Antimykotikum

  1. Från förrådslösningar eller pulver av läkemedel mot svamp, framställa en arbetslösning i RPMI-1640-medium. Typiska maximala koncentrationer av att arbeta lösningen är 1.024 ng / ml för flukonazol och 16 ug / ml för amfotericin B 5. Andra koncentrationer kan användas för olika medel.
  2. Framställ åtta olika koncentrationer av föreningen genom utspädning av stamlösningen i tvåfaldiga utspädningar, som spänner över ett intervall med det uppskattade IC50 för föreningen i mitten.
  3. Efter 24 h av biofilmspåväxt använd microarrayer att skriva ut 50 nL av åtta olika koncentrationer av de läkemedel, tillsammans med positiv (inget läkemedel dvs celler i endast medium) och negativa (behandlad med natriumhypoklorit under 20 min) kontroller, i åtminstone sex replikat på toppen av biofilmer.

NOT: Upprätthåll en relativ fuktighet av 100% för att förhindra torkning av fläckar medan tilläggetning drogerna.

  1. Snart efter tillsats av läkemedlen, inkubera chipet med de läkemedel i en fuktad kammare vid 37 ° C under 24 timmar.
  2. Tvätta de läkemedel bort genom att doppa den CaBChip 3-5 gånger under 2 min varje gång i PBS och färgas genom att inkubera det Ca BChip med 0,5 | iM FUN1 vid 37 ° C under 30 minuter 9.
  3. Tvätta fläcken bort genom att doppa Ca BChip 3-5 gånger i PBS för 1-3 minuter varje dunk och torka Ca BChip med hjälp av en kvävgasström. Läs fluorescensintensitet med användning av en mikromatris skanner (GenePix 4100A, Axon Instruments, CA) vid en våglängd av 532 nm med en PMT förstärkning 380.
  4. Ställa fluorescensintensiteten hos den positiva kontrollen (inget läkemedel) och DEAD (blekmedel-behandlad) fläckar biofilm på 100% och 0%, respektive.
  5. Bestämning av den procentuella inhiberingen av minskningen av fluorescensintensitet (F) i förhållande till medelvärdet av kontrollsystemen fläckar med hjälp av följande ekvation

Ekvation 2
där F, F max och F o är råa fluorescensintensiteter av läkemedel behandlas-, no-narkotikakontroll och blek-behandlade fläckar, respektive. Skannerinställningarna justerades för att erhålla F max och F o av 30000 och 4000 RFU, respektive.

  1. Beräkna 50% hämmande koncentration eller IC 50 genom att montera den rörliga ekvationen backen Hill med hjälp av GraphPad Prism Software (La Jolla, CA).

5. Representativa resultat

Ett representativt Ca BChip, bestående av ett 48 x 16 rad nano-biofilmer av C. albicans, visas i figur 2. Den ljusa fältet mikroskopi visar en övergripande arkitektoniskt inslag av nano-biofilmen. De svepelektronmikroskopiska bilder av biofilmen visar att svamphyfer är inbäddade i matrisen avkollagenfibrer, som är ungefär 2 pm och 100 nm i diameter. De FUN1-färgade microarray scanner bilder visar att jästen och hyfernas former, vilka är karakteristiska för fungala biofilmer. 2D-och 3D-konfokalt fluorescensbilder av FUN1-färgade biofilmer kan ses ha fysisk heterogenitet, med regioner av metaboliskt aktiva celler utspridda inom den extracellulära matrisen (som består av kollagen som det inkapslande materialet och troligen även av exopolymeric framställt material av celler i biofilmer), som inte färgats av den metaboliska färgämnet. Tjockleken av biofilmen uppskattades vara ungefär 50 | im. Ca BChip användes för att uppskatta den antimykotiska mottaglighet av två läkemedel, flukonazol och amfotericin B, och resultaten visas i figur 3. I överensstämmelse med publicerade rapporter om branschstandard 96-brunnar analyser, de biofilmer är resistenta mot flukonazol 10 och den beräknade IC 50 för amfotericin B är 0,3 | ig / ml 11.

Figur 1
Figur 1. Flödesschema för tillverkning av Ca BChip.

Figur 2
Figur 2. En bild av den höga thoughput Ca BChip ut med hjälp av en robot microarrayer och som innehåller 768 punkter på PS-MA-belagda bilder. Varje halvsfärisk platsen är 50 nl i volym, cirka 700 nm i diameter och med en 1,2 mm separation mellan fläckar. Dessutom visas (medsols) är lätta mikroskopi, microarray scanner, 2D-och 3D-fluorescensmikroskopi, och svepelektronmikroskopi bilder av de enskilda biofilmer på Ca BChip. SEM siffran hög förstoring av 25.000 X visar en hyfal filament av bredd 2 nm.

Figur 3 "src =" / files/ftp_upload/3845/3845fig3.jpg "/>
Figur 3. Resultat av antimykotisk resistensbestämning och fastställande av IC 50-värdena för (A) flukonazol och (B) amfotericin B med Ca BChip. Fluorescensmikroskop bilder av amfotericin B-behandlade biofilmer visas i (C). Resultaten är medelvärde ± standardfel medelvärde för två separata bitar innehållande 10 replikat för varje tillstånd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har utvecklat ett cellbaserat hög densitet mikromatris, Ca BChip, bestående av metod i nanoliter volymer av Candida albicans biofilmer. Den microarray trycktes på modifierad glassubstraten, vilket gjorde för robust infästning av fläckar kollagengel samtidigt som hydrofobicitet krävs för en icke-spridning, halvsfärisk 3D gel. En enda Ca BChip kan ersätta approximativt åtta 96-brunnars plattor, och ett flertal chips kan tryckas och bearbetas på samma gång. Chipet använder nano-skala kulturer möjliggör enkel och snabb hantering, är mottaglig för automatisering, minimerar manuellt arbete och kostnader och är fullt kompatibla med standard microarray teknik och utrustning. Dessutom är tekniken flexibel och kan lätt anpassas till andra mikroorganismer. Trots miniatyrisering, nano-biofilmen bildas på Ca BChip display egenskaper som är karakteristiska för C. albicans biofilm livsstil, inklusive 3D architecture och läkemedelsresistens. Således tillåter Ca BChip för verklig high-throughput screening, och har potential för ett paradigmskifte inom antimikrobiella läkemedel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Jose L. Lopez-Ribot och Anand K. Ramasubramanian eget kapital i MicrobeHTS Technologies, Inc., som utvecklar antimykotika. MicrobeHTS Technologies, Inc. lämnade inget ekonomiskt stöd för dessa studier.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats delvis av bidrag från South Texas Technology Management (POCrr 2009,041), Institutet för integration av medicin och vetenskap från National Center for Research Resources (UL 1RR025767), och från National Institute of Dental & Kraniofaciala forskning ( 5R21DE017294).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) Sigma-Aldrich 440140
Polystyrene-Co-Maleic Anhydride (PS-MA) Sigma-Aldrich 426946
Glass microscopy slides Fisher Scientific 12-549-3
Rat Tail collagen type I BD Biosciences 354236
Robotic Microarrayer Omnigrid Micro MICROSYS4000/4100A
Microarray Scanner Genepix Personal 4100A GENEPIX4100A
Hybridization Cassette ArrayIt Corporation AHCXD
FUN1 [2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-phenylquinoliniumiodide] Invitrogen Corp. F-7030
Fluconazole Sicor Pharmaceuticals, Inc. J02AC01
Amphotericin B Sigma A2411
RPMI-1640 Mediatech, Inc. 50-020-PC
Ceramic Tip 190 μm orifice Digilab 60020441-00
GraphPad Prism Software GraphPad Software, Inc.
Genepix Pro V4.1 Molecular Devices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
  2. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
  3. Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
  4. Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
  5. Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
  6. Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
  7. Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
  8. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
  9. Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
  10. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
  11. Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).

Tags

Biomedical Engineering bioteknik immunologi infektion molekylärbiologi, Biofilm high-throughput screening
<em>Candida albicans</em> Biofilm Chip <em>(Ca</em> BChip) för hög genomströmning antimykotikum Screening
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L.,More

Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening. J. Vis. Exp. (65), e3845, doi:10.3791/3845 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter