Summary
وهناك طريقة لimmunostain ووضع تصور لأجهزة chordotonal في يرقات وعذارى من
Abstract
استقبال الحس العميق هو القدرة على استشعار الحركة، أو موقف، من أجزاء الجسم من خلال الاستجابة للمحفزات التي تنشأ داخل الجسم. في fruitflies وغيرها من الحشرات وتقدم بوضع الجسم بواسطة الحواس المتخصصة ووصف الأجهزة chordotonal (ChOs) 2. مثل العديد من الأجهزة الأخرى في ذبابة الفاكهة، ChOs تطوير مرتين خلال دورة حياة الذبابة. أولا، تطوير ChOs اليرقات خلال مرحلة التطور الجنيني. ثم، وChOs الكبار تبدأ في تطوير أقراص وتخيلي اليرقات والاستمرار في التفريق خلال مسخ.
وقد تمت دراسة وضع ChOs اليرقات على نطاق واسع خلال مرحلة التطور الجنيني 10،11،13،15،16. محور كل تشو هي وحدة حسية تتكون من الخلايا العصبية والخلايا scolopale. ويمتد وحدة حسية بين نوعين من الخلايا التبعي أن نعلق على بشرة عن طريق خلايا متخصصة مرفق البشرة 1،9،14. عندما يتحرك يرقة الذبابة، وتشريد النسبية للبريدخلايا مرفق pidermal يؤدي إلى تمتد من وحدة حسية والانفتاح يترتب على ذلك من إمكانات محددة مستقبلات عابر قنوات (TRPV) vanilloid في الجزء الخارجي من 8،12 التغصنات. ثم يتم نقل الإشارة إلى أثار الحركي المركزي نمط دائرة مولد في الجهاز العصبي المركزي.
وقد وصفت ChOs متعددة في ذبابة الكبار 7. وتقع بالقرب من هذه المفاصل من الزوائد ذبابة الكبار (الساقين، وأجنحة والارسنه) وكذلك في الصدر والبطن. وبالإضافة إلى ذلك، عدة مئات من ChOs تشكل مجتمعة الجهاز جونستون في الهوائي الكبار أن transduce الصوتية إلى طاقة ميكانيكية 3،5،17،4.
وعلى النقيض من معرفة واسعة عن تطور ChOs في مراحل جنينية، ولا يعرف سوى القليل جدا عن الشكل الظاهري لهذه الأجهزة خلال مراحل اليرقات. وعلاوة على ذلك، مع استثناء من ChOs الفخذ 18 و الجهاز جونستون، لدينا knowledشركة جنرال الكتريك عن تطور وهيكل ChOs في الذبابة الكبار مجزأة جدا.
نحن هنا وصف طريقة لتلطيخ وتصور ChOs في يرقات العمر الثالث والشرانق. ويمكن تطبيق هذه الطريقة مع الأدوات الوراثية لتوصيف أفضل للمورفولوجيا وفهم تطور ChOs مختلف في الطيران.
Protocol
قبل أن تبدأ
- تنمو الثقافات ذبابة المطلوب. الحفاظ على قارورة غير مزدحم (حوالي 30 الذباب في قارورة مل 50). السماح للذباب وضع البيض ليوم واحد فقط في كل قنينة. وسيوفر هذا العرض يرقات الغذاء الكافي، والسماح لهم للوصول إلى حجم القصوى قبل الزحف للخروج من المواد الغذائية. الحفاظ على قارورة في درجة حرارة مناسبة حتى 3 يرقات الطور تبدأ في التجول على جدار القارورة.
- تعد الأوراق المالية الجديدة من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وPBT (0.1٪ توين في برنامج تلفزيوني). ابقاء 10 مل من برنامج تلفزيوني على الجليد.
- إعداد 1-5 مل من مثبت الطازجة (فورمالديهايد 4٪ في PBT) وابقائه على الجليد. نحن نستخدم المعبأة الفورمالديهايد 37-38٪ كحل الأوراق المالية.
1. تشريح والتثبيت من يرقات العمر الثالث
- اختيار تجول يرقة الطور الثالث من جدار القارورة ووضعه في انخفاضا بنسبة 50 ميكرولتر من الجليد الباردة في برنامج تلفزيوني على طبق تشريح Sylgard (مصنوعة من 184 Sylgard سيليكون عدة الاستومر، شركة داو كورنينج فيالأنسجة صحن الثقافة).
- عقد يرقة، الجانب الظهري تصل بالقرب من فم السنانير، وذلك باستخدام ملقط غرامة (دومون # 5 ملقط)، وعصا 1 دبوس حشرة (minutien، 0.1 ملم، الفولاذ المقاوم للصدأ) من خلال الدماغ اليرقة و.
- الاستيلاء على نهاية الخلفي لليرقة مع ملقط، برفق وتمتد اليرقة بالطول بلطف. عصا آخر دبوس حشرة بين spiracles 2 الخلفي.
- قطع مقص ربيع باستخدام اثنين من الشقوق الأفقية في جدار الجسم (عمودي على محور الأمامي، الخلفي)، على مقربة من المسامير الأمامية والخلفية.
- باستخدام مقص ربيع قطع جدار الجسم اليرقات على طول خط الوسط ظهري من سابقة لشق الخلفي.
- إزالة الأعضاء الداخلية (الأمعاء الغليظة، والغدد اللعابية، مالبيغي الأنابيب وغيرها) والقصبة الهوائية واستخدام الملقط غرامة. غسل بلطف مرة أو مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- الاستيلاء على حائط الجسم 2 اللوحات بالملقط، وتمتد بها وارجاعهم الى لوحة باستخدام اثنين من المسامير حشرة لكل جانب.
- إزالة فBS وإضافة 50 ميكرولتر من محلول التثبيت (الفورمالديهايد 4٪ في PBT). احتضان 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة مثبت. غسل مرتين مع برنامج تلفزيوني. سحب دبابيس للحشرات. قطع مقص ربيع باستخدام الرأس والذيل اليرقات ترك شرائح مستطيلة. نقل الأنسجة الثابتة لأنبوب إيبندورف المبردة مع برنامج تلفزيوني.
- مرة واحدة يتم إصلاح عدد كاف من اليرقات، ويمكن للمرء أن يستمر مباشرة إلى تلطيخ الجسم المضاد. إذا لم يتم المطلوب تلطيخ فوري، يجب غسلها اليرقات ثابت 3 مرات، 5 دقائق لكل منهما، مع الايثانول 95٪ وتخزينها في الايثانول 95٪ عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
2. تشريح والتثبيت من شرانق
الجزء الأول
- حضور لقوارير كما لتثبيت اليرقات، وحتى 3 يرقات الطور تبدأ pupariate. دراسة قارورة كل ساعة ويرقات علامة التي pupariated. السماح للعذارى ملحوظ لتطوير ساعات 30-40 درجة مئوية في 24، أو ساعات 24-27 في 29 درجة مئوية.
- باستخدام ملقط غرامة اختيار 20-30 الشرانق من السن ه المناسبة ووضعها في صحن الظلام متعددة جيدا الخزف تشريح. يجب الحرص على عدم تلف الأنسجة من الاهتمام.
- استخراج الشرانق من حالة العذراء. تبدأ تقشير قبالة الوصاد وتستمر حتى خادرة مجانا. وضع خادرة إلى تعبئة بئر مع PBT. تواصل استخراج كل الشرانق. وينبغي القيام بالخطوات 2،4-2،6 على دفعات صغيرة من خمسة الشرانق في وقت واحد.
- 5 وضع الشرانق على سطح مستو بين الآبار للطبق تشريح. باستخدام سكين تشريح قطع صغيرة غيض من الرأس والطرف الخلفي من البطن (بدلا من ذلك، فمن الممكن استخدام اثنين من أزواج من ملقط لتمزيق الثقوب في كلا طرفي عذارى).
- عقد خادرة في مكان باستخدام ملقط غرامة واستخدام حقنة 1 مل لغسل الأعضاء الداخلية للخادرة، عن طريق حقن PBT من خلال فتح الأمامي.
- غسل لفترة وجيزة خادرة تشريح بواسطة غمس في ملأ بئر مع برنامج تلفزيوني ونقله إلى مثبت الباردة في أنبوب إيبندورف أبقى على الجليد.
- احتضان بين عشية وضحاها (ON) في 4 درجات مئوية.
الجزء الثاني
- تجاهل تثبيتي، وغسل الشرانق ثلاث مرات، 5 دقائق لكل منهما، مع PBT. الحفاظ على الشرانق غسلها على الجليد.
- شغل بئرين للطبق تشريح مع PBT. باستخدام مادة البولي ايثيلين نقل ماصة باستير الشرانق عدة إلى واحدة من الآبار.
- نقل أحد خادرة في وقت واحد إلى البئر الثانية. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط حاد مع نصائح المنحازة تماما، تقشر بشرة شفافة والعذراء من الجناح: تأمين خادرة إلى الجزء السفلي من زوج واحد باستخدام ملقط جيدا، وتمزيق بلطف بشرة باستخدام الزوج الثاني من الملقط. بمجرد مزقت إهاب، قشر تشغيله الجناح. يجب الحرص على عدم قطع الاتصال الجناح من خادرة. بعد تقشير قبالة إهاب من شفرة جناح، ما زالت تقشير للبشرة من العامل الحاسم في الجناح (حيث توجد ChOs جناح).
- بعد تقشير بشرة قبالة الجناح، يمكن للمرء أن يحاول تقشير بشرة قبالة المحطة بطريقة مماثلة.الساقين كثير من المرجح أن تضيع في هذه العملية، ولكن على الرغم من العائد المنخفض، ينصح بشدة هذه الخطوة نظرا لأنه يحسن كثيرا من تلطيخ من ChOs الساق. لا يمكن للChOs من haltere والبطن يمكن تصور دون تقشير مزيد قبالة بشرة.
- وضع "مقشرة" خادرة في أنبوب إيبندورف مليئة الميثانول والحفاظ على درجة حرارة الغرفة. يواصل تقشير قبالة إهاب من الشرانق في كل شيء، وإضافتها إلى أنبوب واحد. وينبغي جمع ما لا يقل عن 10 الشرانق مقشر لطيف لكل تلطيخ.
- إزالة الميثانول ويغسل ثلاث مرات، 5 دقائق لكل منهما، مع الايثانول 95٪. يمكن أن تظل ثابتة لالشرانق فترات طويلة من الزمن في الايثانول 95٪ عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
3. المناعية من اليرقات والشرانق
- يغسل النسيج ثابتة مع ثلاث مرات PBT، 30 دقيقة لكل منهما، في درجة حرارة الغرفة. يمكن غسلها اليرقات مع الهز لطيف على طبق من الدورية. تغسل الشرانق دون أن تهتز.
- استبدال PBT مع عازلة تمنع (PBT + 5٪ نormal مصل الماعز)، واحتضان ON في 4 درجات مئوية.
- إزالة المنطقة العازلة الحجب واحتضان مع الأجسام المضادة الأولية (المخفف في عرقلة العازلة) على درجة مئوية في تمام الساعة 4
- غسل أربع مرات مع PBT كما هو موضح في الخطوة 3.1.
- إزالة PBT واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية (المخفف في عرقلة العازلة) ON في 4 درجة مئوية.
- غسل مرتين مع PBT ومرة واحدة مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح في الخطوة 3.1.
- استبدال برنامج تلفزيوني مع تصاعد المتوسطة (داكو نيون متوسطة تركيب (داكو Cytomation، ببلاغ الدنمارك)، واحتضان في 4 درجات مئوية ON.
4. تصاعد من يرقات
- اليرقات هي التي شنت على شريحة المجهر في قطرة من وسائل الاعلام المتزايدة مع بشرة من أسفل الجسم وعضلات جدار مواجهة. وضع قطرة صغيرة من وسط تصاعد على زلة غطاء نظيف واستخدامه لتغطية إعداد. لا يتم تطبيق أي ضغط على اليرقات التي شنت.
5. تصاعد من الشرانق
- إعداد الشرائح المجهر 2مع انخفاض بنسبة متوسطة متزايدة، واحدة للتشريح، والثانية للتركيب.
- وضع الشرانق عدة على واحد من الشرائح.
- مقص ربيع باستخدام إزالة الرأس والجزء الخلفي من البطن.
- فصل في النصف الظهري للصدر من النصف البطني عن طريق قطع بين الجناحين والساقين.
- وضع أجزاء الجسم تشريح للخادرة على الشريحة الثانية في مجهر قطرة من حل في تصاعد مستمر. ضمان امتدت أجنحة وأرجل بها ومحاولة للتقليل من تتراكب من الأنسجة إلى أقصى حد ممكن.
- ضع قطرة من متوسطة متزايدة على زلة غطاء ووضعه على عينة. لا يتم تطبيق الضغط على العينة التي شنت.
6. ممثل النتائج
ويظهر مثال المناعية الملون ChOs من يرقة الطور الثالث في الشكل 1. هذا المثال يوضح قطعة تمتد لطيف في البطن التي سبعة من ChOs الثمانية هي واضحة للعيان. الخلايا العصبية هي مختبرإليد مع MAb22C10 (1:20، تم الحصول عليها من البنك التنموي ورم هجين الدراسات في جامعة أيوا)، وصفت وكأب، والرباط، وكأب التعلق والارتباط الخلايا الرباط مع αTub85E المضادة (1:10، كلاين وآخرون،. 2010). وكانت الأجسام المضادة الثانوية لتلطيخ فلوري Cy3، أو Cy5 مترافق anti-mouse/rabbit (1:200، جاكسون Immunoresearch مختبرات). واعتبرت عينات من استخدام متحد البؤر المجهري (LSM 510، زييس).
وترد مجموعة من ChOs جناح في الوريد الكعبري بطني من خادرة ساعة من العمر 35 في الشكل 2.
الشكل 1 (أ) توضيح تخطيطي لأنواع الخلايا الست التي تشكل جهازا الفصل واحد:. مرفق قبعة (CA)، وكأب (C)، scolopale (S)، الخلايا العصبية (N)، الرباط (L) والرباط المرفق (لوس انجليس ). ويمتد الجهاز LCh5، التي تتجمع في 5 ChOs، عبر مجموعة من العضلات عرضية جانبية (LT1-4). ويتضح أيضا في العضلات الجانبية الطولية (LL1)، عضلات بطني طولي (VL1-4) والعضلات المائلة الجانبية (LO1). ويوضح الخلايا وتر ومجالات البني (مأخوذة من كلاين وآخرون، 2010). (ب) جزء واحد في البطن من يرقة الطور 3 الاطلاع على التكبير 10x. سبعة من ChOs 8 الحالي في كل جزء من البطن واضحة: الأجهزة الجانبية الخمسة التي تشكل معا الجهاز pentascolopidial (LCh5)، وهو جهاز واحد جانبي (LCh1) واحد من اثنين من ChOs بطني (VChB). وصفت الخلايا العصبية (N) من ChOs مع 22C10 علامة ماب العصبية (الحمراء). تتم تسمية في الرباط (L)، وكأب (C) والخلايا المرفق (لوس انجليس، كاليفورنيا) مع المضادة للαTub-85E (الأزرق). وبالإضافة إلى ذلك وصفت الخلايا قبعة والرباط مع مراسل GFP تشو الخاصة بإيواء أحد العناصر التنظيمية من مكان دي (نحمان وآخرون، بيانات غير منشورة).
الشكل 2. وآخرون، بيانات غير منشورة).
Discussion
البروتوكول المذكور في هذا الفيديو يوفر وسيلة لتصور ChOs التحفيز خلال مراحل اليرقات والعذراء. وقد دراسات حول بنية وتطوير ChOs التحفيز حتى الآن تقتصر أساسا على مراحل الجنينية وعلى أقراص تخيلي اليرقات. وبالتالي، جوانب كثيرة من مراحل لاحقة من التطور، من ChOs على حد سواء اليرقات والكبار، لا تزال مجهولة إلى حد كبير. ويمكن استخدام بروتوكول صفها، جنبا إلى جنب مع أدوات الوراثية الشائعة في ذبابة الفاكهة، لتحديد ودراسة جينات جديدة والممرات التي تؤدي دورا في مراحل لاحقة من تطوير ChOs. وكان هذا البروتوكول الأمثل للتصور تشو، ولكن يمكن تكييفه لتلطيخ من الأنسجة الأخرى، مثل أجنحة العذراء 6.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر البنك التنموي ورم هجين الدراسات في جامعة ولاية ايوا لارسال لنا الأجسام المضادة. وقد أيد هذا العمل عن طريق منحة (رقم 29/08) من مؤسسة العلوم اسرائيل. كما يدعم أيضا من خلال منحة بحثية من DFG (دويتشه Forschungsgemeinschaft).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 (or #55) forceps, biologie tip | F.S.T. | 11252-20 or 11252-10 (or similar forceps) | |
| Austerlitz stainless steel insect pins, minutiens 0.1mm | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6083-10 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 240.4019862 | |
| Vannas micro scissors (straight, 7.5 cm, blade 3mm) | AS Mdeizintechnik GmbH | 11-590-00 | Vannas Spring Scissors with identical specifications can be purchased from Roboz Surgical Instrument Co. |
| Orbital shaker - Rotamax-120 | Heidolph | N/A | |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Dako | ||
| X10 PBS formulation | The quality of PBS is critical for the success of this protocol | 2 gr/lit KCl, 2 gr/lit KH2PO4, 80 gr/lit NaCl, 21.7 gr/lit Na2HPO4.7H2O |
|
| PBT | X1 PBS + 0.1% Tween 20 |
References
- Brewster, R., Bodmer, R. Origin and specification of type II sensory neurons in Drosophila. Development. 121, 2923-2936 (1995).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16053-16053 (2003).
- Eberl, D. F. Feeling the vibes: chordotonal mechanisms in insect hearing. Curr. Opin. Neurobiol. 9, 389-393 (1999).
- Eberl, D. F., Boekhoff-Falk, G. Development of Johnston's organ in Drosophila. Int. J. Dev. Biol. 51, 679-687 (2007).
- Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila. J. Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).
- Egoz-Matia, N., Nachman, A., Halachmi, N., Toder, M., Klein, Y., Salzberg, A. Spatial regulation of cell adhesion in the Drosophila wing is mediated by Delilah, a potent activator of βPS integrin expression. Dev Biol. 351, 99-109 (2011).
- Field, L. H., Matheson, T. Chordotonal organs of insects. Advances in Insect Physiology. 27, 1-228 (1998).
- Gong, Z., Son, W., Chung, Y. D., Kim, J., Shin, D. W., McClung, C. A., Lee, Y., Lee, H. W., Chang, D. J., Kaang, B. K. Two interdependent TRPV channel subunits, inactive and Nanchung, mediate hearing in Drosophila. J. Neurosci. 24, 9059-9066 (2004).
- Inbal, A., Volk, T., Salzberg, A. Recruitment of ectodermal attachment cells via an EGFR-dependent mechanism during the organogenesis of Drosophila proprioceptors. Dev. Cell. 7, 241-250 (2004).
- Jarman, A. P., Grau, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. atonal is a proneural gene that directs chordotonal organ formation in the Drosophila peripheral nervous system. Cell. 73, 1307-1321 (1993).
- Jarman, A. P., Sun, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Role of the proneural gene, atonal, in formation of Drosophila chordotonal organs and photoreceptors. Development. 121, 2019-2030 (1995).
- Kim, J., Chung, Y. D., Park, D. Y., Choi, S., Shin, D. W., Soh, H., Lee, H. W., Son, W., Yim, J., Park, C. S. A TRPV family ion channel required for hearing in Drosophila. Nature. 424, 81-84 (2003).
- Klein, Y., Halachmi, N., Egoz-Matia, N., Toder, M., Salzberg, A. The proprioceptive and contractile systems in Drosophila are both patterned by the EGR family transcription factor Stripe. Dev. Biol. 337, 458-470 (2010).
- Matthews, K. A., Miller, D. F., Kaufman, T. C. Functional implications of the unusual spatial distribution of a minor alpha-tubulin isotype in Drosophila: a common thread among chordotonal ligaments, developing muscle, and testis cyst cells. Dev. Biol. 137, 171-183 (1990).
- Okabe, M., Okano, H. Two-step induction of chordotonal organ precursors in Drosophila embryogenesis. Development. 124, 1045-1053 (1997).
- Rusten, T. E., Cantera, R., Urban, J., Technau, G., Kafatos, F. C., Barrio, R. Spalt modifies EGFR-mediated induction of chordotonal precursors in the embryonic PNS of Drosophila promoting the development of oenocytes. Development. 128, 711-722 (2001).
- Todi, S. V., Sharma, Y., Eberl, D. F. Anatomical and molecular design of the Drosophila antenna as a flagellar auditory organ. Microsc. Res. Tech. 63, 388-399 (2004).
- zur Lage, P., Jarman, A. P. Antagonism of EGFR and notch signalling in the reiterative recruitment of Drosophila adult chordotonal sense organ precursors. Development. 126, 3149-3159 (1999).
