Summary
Een methode om immunostain en chordotonal organen te visualiseren in de larven en poppen van
Abstract
Proprioceptie is de mogelijkheid om de beweging, of positie, van lichaamsdelen te voelen door te reageren op stimuli die zich in het lichaam. In fruitvliegen en andere insecten proprioceptie wordt verzorgd door gespecialiseerde zintuigen genoemd chordotonal organen (Chos) 2. Net als vele andere organen in Drosophila, chos ontwikkelen tweemaal tijdens de levenscyclus van de vlieg. Ten eerste, de larvale chos te ontwikkelen tijdens de embryogenese. Dan, de volwassen chos beginnen te ontwikkelen in het larvale denkbeeldige schijven en om onderscheid te maken tijdens de metamorfose voort te zetten.
De ontwikkeling van de larvale chos tijdens de embryogenese is uitgebreid 10,11,13,15,16 bestudeerd. De kern van elk CHO is een zintuiglijke eenheid bestaande uit een neuron en een scolopale cel. De sensorische eenheid is gespannen tussen twee soorten accessoire cellen die hechten aan de cuticula via gespecialiseerde epidermale bijlage cellen 1,9,14. Als een vlieg larve beweegt, de relatieve verplaatsing van de epidermal bevestiging cellen leidt tot uitrekken van de zintuiglijke eenheid en de daaruit voortvloeiende opening van specifieke transient receptor potential vanilloid (TRPV) kanalen aan de buitenste segment van de dendriet 8,12. Het ontlokte signaal wordt vervolgens overgedragen aan het bewegingsapparaat centrale patroon generator circuit in het centrale zenuwstelsel.
Meerdere chos zijn beschreven in de volwassen vlieg 7. Deze bevinden zich in de buurt van de gewrichten van de volwassen vlieg aanhangsels (poten, vleugels en halsters) en in de thorax en de buik. Daarnaast zijn enkele honderden chos samen de Johnston's orgel in de volwassen antenne die transduceren akoestische in mechanische energie 3,5,17,4.
In tegenstelling tot de uitgebreide kennis over de ontwikkeling van chos in embryonale stadia, is zeer weinig bekend over de morfologie van deze organen tijdens de larvale stadia. Bovendien, met uitzondering van de femorale chos 18 en Johnston's orgel, onze kennis van zaken inge over de ontwikkeling en de structuur van chos in de volwassen vlieg is zeer fragmentarisch.
Hier beschrijven we een methode voor het kleuren en visualiseren van chos in derde instar larven en poppen. Deze methode kan worden toegepast met het oog op betere genetische karakterisering van de morfologie en begrijpen de ontwikkeling van de verschillende chos in de vlieg.
Protocol
Voordat u begint
- Groei van de gewenste vlieg culturen. De injectieflacons uncrowded (ongeveer 30 vliegen per 50 ml flacon). Laat de vliegen eitjes leggen voor slechts een dag in elke flacon. Dit zal de larven voldoende voedselvoorziening en hen in staat stellen om maximale grootte bereiken voordat kruipen uit het voedsel. Bewaar de injectieflacons in de juiste temperatuur tot derde instar larven beginnen te dwalen op de flacon muur.
- Bereid een nieuwe voorraad fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en PBT (0,1% Tween in PBS). Houd 10 ml PBS op ijs.
- Bereid 1-5 ml vers fixatief (4% Formaldehyde in PBT) en houdt het op ijs. We maken gebruik van gebotteld 37-38% formaldehyde als een stamoplossing.
1. Dissectie en fixatie van de derde Instar Larven
- Kies een zwervende derde instar larve van de flacon muur en plaats deze in een 50 ul druppel ijskoud PBS op een Sylgard dissectie plaat (gemaakt van Sylgard 184 siliconen elastomeer kit, Dow Corning Corporation in eenweefselkweek schotel).
- Houd de larve-, rug-kant naar boven, bij de monding haken, met fijn pincet (Dumont # 5 tang), en plak een insect pin (minutien, 0,1 mm, roestvrij staal) door middel van de hersenen van de larve's.
- Pak het achterste eind van de larve met de tang, trek en strek de larve zachtjes de lengte. Plak een ander insect pin tussen de twee achterste siphonen.
- Met behulp van de lente een schaar knippen twee horizontale insnijdingen in het lichaam muur (loodrecht op de anterior-posterior as), dicht bij de voorste en achterste pinnen.
- Met behulp van het voorjaar een schaar knip de larvale lichaam muur langs de dorsale middellijn van de voorste tot de achterste incisie.
- Verwijder de interne organen (darmen, speekselklieren, buisjes van Malpighi enz.) en de luchtpijp met behulp van fijne pincet. Was voorzichtig een of twee keer met PBS.
- Pak de twee lichaamswand kleppen met een pincet, rekken ze uit en ze op de plaat met behulp van twee insecten de spelden voor elke kant pin.
- Verwijder de PBS en voeg 50 ul fixeeroplossing (4% formaldehyde in PBT). Incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het fixeermiddel. Was tweemaal met PBS. Trek het insect pinnen. Met behulp van de lente een schaar knip de larvale kop en staart het verlaten van een rechthoekige filet. Breng de vaste weefsel tot een gekoelde Eppendorf buis met PBS.
- Als een voldoende aantal larven vastgesteld kan direct verder antilichaam kleuring. Als onmiddellijke kleuring niet gewenst is, moet de vaste larven worden gewassen 3 keer 5 minuten met 95% ethanol en opgeslagen in 95% ethanol bij -20 ° C.
2. Dissectie en Fixatie van Poppen
Deel I
- Woon aan de flesjes als voor larven fixatie, tot derde instar larven beginnen te pupariate. Onderzoek de flacons elk uur en Mark larven die pupariated. Laat de gemarkeerde poppen tot 30-40 uur te ontwikkelen bij 24 ° C, of 24 tot 27 uur bij 29 ° C.
- Met behulp van fijne tang halen 20-30 poppen van ee juiste leeftijd en doe ze in een donkere porselein multi-goed ontleden schotel. Zorg ervoor dat u de weefsels van belang kunnen beschadigen.
- Pak de poppen uit de pop geval. Begin met het afpellen van het operculum en gaan door tot de pop is gratis. Zet de pop in een goed gevuld met PBT. Ga door het extraheren van alle poppen. Stappen 2.4-2.6 worden uitgevoerd in kleine groepen van vijf poppen tegelijk.
- Plaats vijf poppen op een vlakke ondergrond tussen de putten van het ontleden schotel. Een microdissectie te snijden het uiteinde van de kop en de achterste uiteinde van de buik (alternatief is het mogelijk om twee paar tang gebruiken gaten scheuren aan beide uiteinden van de poppen).
- Houd de pop op zijn plaats met behulp van fijne pincet en gebruik een 1 ml spuit om de reiniging van de interne organen van de pop, door het injecteren van PBT door de voorste opening.
- Was de ontleed pop kort door dompelen in een goed gevuld met PBS en verplaats het in de koude fixeermiddel in een Eppendorf buis op ijs bewaard.
- Incubeer nacht (ON) bij 4 ° C.
Part II
- Gooi de fixatief en was de poppen drie keer, 5 minuten, met PBT. Houd de gewassen poppen op het ijs.
- Vul twee putjes van de schotel met het ontleden van PBT. Een polyetheen pasteurpipet overdracht verschillende poppen een van de putten.
- Verplaats een pop op een moment in de tweede put. Met behulp van twee paar scherpe pincet met perfect uitgelijnd tips, haal het transparante pop cuticula van de vleugel: zet de pop op de bodem van de put met behulp van een pincet, en voorzichtig scheuren de cuticula met behulp van het tweede paar pincetten. Zodra de cuticula is gescheurd, afschilferen van de vleugel. Zorg ervoor dat aan de vleugel los te koppelen van de pop. Na het afpellen van de cuticula van de vleugel mes, blijven het schillen van de cuticula van de vleugel scharnier (waar de vleugel chos zich bevinden).
- Na het afpellen van de vleugel cuticula, kan men proberen afpellen van het been cuticula op een vergelijkbare manier.Veel benen zijn waarschijnlijk verloren in het proces, maar ondanks de lage opbrengst, deze stap wordt ten zeerste aanbevolen, aangezien dit een aanzienlijke verbetering van de kleuring van het been chos. De chos van de haltere en de buik kunnen worden gevisualiseerd zonder verdere afpellen van de cuticula.
- Plaats het geschilde 'pop in een Eppendorf buis gevuld met methanol en houdt bij kamertemperatuur. Ga verder afpellen van de cuticula van alle poppen en voeg ze toe aan dezelfde buis. Ten minste 10 mooi geschild poppen moeten worden verzameld voor elke kleuring.
- Verwijder de methanol en was drie keer, 5 minuten, met 95% ethanol. Vaste poppen kan worden gehouden voor langere tijd in 95% ethanol bij -20 ° C.
3. Immunokleuring van larven en poppen
- Was de vaste weefsel PBT driemaal 30 minuten bij kamertemperatuur. Larven kunnen worden gewassen met zacht schudden op een roterende plaat. Poppen worden gewassen zonder schudden.
- Vervang de PBT met blokkerende buffer (PBT + 5% nEen normaal geit serum) en incubeer ON bij 4 ° C.
- Verwijder het blokkeren buffer en geïncubeerd met primaire antilichamen (verdund in blokkeringsbuffer) ON bij 4 ° C.
- Was viermaal uit met PBT zoals beschreven in stap 3.1.
- Verwijder het PBT en incubeer met secundaire antilichamen (verdund in blokkeringsbuffer) ON bij 4 ° C.
- Was twee keer met PBT en een keer met PBS, zoals beschreven in stap 3.1.
- Vervang de PBS met montage-medium (Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako Cytomation, Glostrup, Denemarken) en incuberen bij 4 ° C ON.
4. Montage van Larven
- Larven zijn gemonteerd op een microscoop dia in een daling van de montage-media met hun nagelriem naar beneden en lichaamswand spieren naar boven. Doe een klein druppeltje montage medium op een schoon dekglas en gebruik deze om de voorbereiding te dekken. Gebruik geen druk uit op de gemonteerde larven.
5. Montage van Poppen
- Bereid twee objectglaasjesmet een druppel montagemedium, een voor dissectie en de tweede voor montage.
- Leg een aantal poppen op een van de dia's.
- Met behulp van de lente een schaar te verwijderen het hoofd en het achterste deel van de buik.
- Scheid de dorsale helft van de thorax van ventrale half door snijden van de vleugels en de poten.
- Plaats ontleed lichaamsdelen van de pop de tweede microscoopglaasje een druppel montage oplossing. Controleer de vleugels en de benen gespannen en proberen superpositie van weefsels zoveel mogelijk te beperken.
- Breng een druppel van de montage medium op een dekglas en plaats deze op het monster. Oefen geen druk uit op de gemonteerde monster.
6. Representatieve resultaten
Een voorbeeld van immuno-gekleurde chos van Larve larve figuur 1. Dit voorbeeld toont een mooi gespannen buik-segment, waarin zeven van de acht chos zijn duidelijk zichtbaar. Neuronen zijn labeLED met MAb22C10 (1:20, verkregen uit de Developmental Studies Hybridoma Bank aan de Universiteit van Iowa), de cap, ligament, pet-gehechtheid en ligament bevestiging cellen zijn voorzien van anti-αTub85E (1:10, Klein et al.,. 2010). Secundaire antilichamen voor fluorescentiekleuring waren Cy3 of Cy5-geconjugeerd anti-mouse/rabbit (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories). Monsters werden bekeken met behulp van confocale microscopie (LSM 510, Zeiss).
Een cluster vleugel chos de ventrale radiale ader van 35 uur oude pop is weergegeven in figuur 2.
Figuur 1 (A) Schematische weergave van de zes celtypen die een Ch orgaan vormen. Kap aangebracht (CA), cap (C), scolopale (S), neuron (N), ligament (L) en ligament bevestiging (LA ). De LCh5 orgel, waarin vijf chos geclusterd, is uitgestrekt over de groep van de laterale dwarse spieren (LT1-4). De laterale lengterichting spier (LL1) ventrale longitudinale spieren (VL1-4) en laterale schuine spier (LO1) worden eveneens getoond. Tendon cellen worden geïllustreerd als bruine bollen (Genomen uit Klein et al.., 2010). (B) Een abdominale segment van een derde instar larve bekeken op een 10x vergroting. Zeven van de acht chos in elk abdominaalsegment zijn evident: vijf laterale organen die samen de pentascolopidial orgaan (LCh5) een laterale orgaan (LCh1) en een twee ventrale chos (VChB). De neuronen (N) van de chos zijn voorzien van de neuronale marker MAb 22C10 (rood). Het ligament (L), cap (C) en bevestiging cellen (LA, CA) zijn voorzien van anti-αTub-85E (blauw). De dop en ligament cellen bovendien voorzien van een CHO-specifieke GFP reporter herbergen van een reguleringselement van de dei locus (Nachman et al.., Ongepubliceerde gegevens).
Figuur 2. et al.., Ongepubliceerde gegevens).
Discussion
Het protocol wordt beschreven in deze video biedt een manier om proprioceptieve chos visualiseren tijdens het larvale en popstadium fasen. Studies over de structuur en de ontwikkeling van proprioceptieve chos zijn tot nu toe beperkt vooral embryonale stadia en larven imaginaire schijven. Zo veel aspecten van de latere stadia van ontwikkeling, van zowel larvale en volwassen chos, blijven grotendeels onbekend. De beschreven protocol, in combinatie met gemeenschappelijke genetische tools in Drosophila, kan worden gebruikt om te identificeren en te bestuderen nieuwe genen en routes die een rol spelen in latere stadia van chos ontwikkeling. Dit protocol werd geoptimaliseerd voor de visualisatie van Cho, maar het kan worden aangepast voor de kleuring van andere weefsels, zoals pop vleugels 6.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de Developmental Studies Hybridoma Bank danken aan de Universiteit van Iowa voor het sturen van antilichamen. Dit werk werd ondersteund door een subsidie (nr. 29/08) van The Israel Science Foundation. AS wordt ook ondersteund door een onderzoeksbeurs van de DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 (or #55) forceps, biologie tip | F.S.T. | 11252-20 or 11252-10 (or similar forceps) | |
| Austerlitz stainless steel insect pins, minutiens 0.1mm | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6083-10 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 240.4019862 | |
| Vannas micro scissors (straight, 7.5 cm, blade 3mm) | AS Mdeizintechnik GmbH | 11-590-00 | Vannas Spring Scissors with identical specifications can be purchased from Roboz Surgical Instrument Co. |
| Orbital shaker - Rotamax-120 | Heidolph | N/A | |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Dako | ||
| X10 PBS formulation | The quality of PBS is critical for the success of this protocol | 2 gr/lit KCl, 2 gr/lit KH2PO4, 80 gr/lit NaCl, 21.7 gr/lit Na2HPO4.7H2O |
|
| PBT | X1 PBS + 0.1% Tween 20 |
References
- Brewster, R., Bodmer, R. Origin and specification of type II sensory neurons in Drosophila. Development. 121, 2923-2936 (1995).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16053-16053 (2003).
- Eberl, D. F. Feeling the vibes: chordotonal mechanisms in insect hearing. Curr. Opin. Neurobiol. 9, 389-393 (1999).
- Eberl, D. F., Boekhoff-Falk, G. Development of Johnston's organ in Drosophila. Int. J. Dev. Biol. 51, 679-687 (2007).
- Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila. J. Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).
- Egoz-Matia, N., Nachman, A., Halachmi, N., Toder, M., Klein, Y., Salzberg, A. Spatial regulation of cell adhesion in the Drosophila wing is mediated by Delilah, a potent activator of βPS integrin expression. Dev Biol. 351, 99-109 (2011).
- Field, L. H., Matheson, T. Chordotonal organs of insects. Advances in Insect Physiology. 27, 1-228 (1998).
- Gong, Z., Son, W., Chung, Y. D., Kim, J., Shin, D. W., McClung, C. A., Lee, Y., Lee, H. W., Chang, D. J., Kaang, B. K. Two interdependent TRPV channel subunits, inactive and Nanchung, mediate hearing in Drosophila. J. Neurosci. 24, 9059-9066 (2004).
- Inbal, A., Volk, T., Salzberg, A. Recruitment of ectodermal attachment cells via an EGFR-dependent mechanism during the organogenesis of Drosophila proprioceptors. Dev. Cell. 7, 241-250 (2004).
- Jarman, A. P., Grau, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. atonal is a proneural gene that directs chordotonal organ formation in the Drosophila peripheral nervous system. Cell. 73, 1307-1321 (1993).
- Jarman, A. P., Sun, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Role of the proneural gene, atonal, in formation of Drosophila chordotonal organs and photoreceptors. Development. 121, 2019-2030 (1995).
- Kim, J., Chung, Y. D., Park, D. Y., Choi, S., Shin, D. W., Soh, H., Lee, H. W., Son, W., Yim, J., Park, C. S. A TRPV family ion channel required for hearing in Drosophila. Nature. 424, 81-84 (2003).
- Klein, Y., Halachmi, N., Egoz-Matia, N., Toder, M., Salzberg, A. The proprioceptive and contractile systems in Drosophila are both patterned by the EGR family transcription factor Stripe. Dev. Biol. 337, 458-470 (2010).
- Matthews, K. A., Miller, D. F., Kaufman, T. C. Functional implications of the unusual spatial distribution of a minor alpha-tubulin isotype in Drosophila: a common thread among chordotonal ligaments, developing muscle, and testis cyst cells. Dev. Biol. 137, 171-183 (1990).
- Okabe, M., Okano, H. Two-step induction of chordotonal organ precursors in Drosophila embryogenesis. Development. 124, 1045-1053 (1997).
- Rusten, T. E., Cantera, R., Urban, J., Technau, G., Kafatos, F. C., Barrio, R. Spalt modifies EGFR-mediated induction of chordotonal precursors in the embryonic PNS of Drosophila promoting the development of oenocytes. Development. 128, 711-722 (2001).
- Todi, S. V., Sharma, Y., Eberl, D. F. Anatomical and molecular design of the Drosophila antenna as a flagellar auditory organ. Microsc. Res. Tech. 63, 388-399 (2004).
- zur Lage, P., Jarman, A. P. Antagonism of EGFR and notch signalling in the reiterative recruitment of Drosophila adult chordotonal sense organ precursors. Development. 126, 3149-3159 (1999).
