Summary
の幼虫や蛹に振動や音響に反応する臓器を免疫染色し、可視化する方法
Abstract
固有感覚は、身体内の生じる刺激に応答することによって、身体の部分の動き、または位置を感知する能力である。ショウジョウバエや他の昆虫に固有感覚は、振動や音響に反応する器官（ChOs 2）と呼ばれる特殊な感覚器官で提供されています。 ショウジョウバエの他の多くの臓器と同様に、ChOsはハエのライフサイクル中に2回開発しています。まず、幼虫ChOsは、胚形成の間に開発しています。その後、成人ChOsは、幼虫成虫に開発し、変態中に区別するために継続して開始します。
胚発生時の幼虫のChOsの開発が広く10,11,13,15,16検討されている。各CHOの目玉は、ニューロンとscolopaleセルで構成される感覚のユニットです。感覚のユニットは特殊な表皮添付ファイル細胞1,9,14を経由してキューティクルに接続するアクセサリー2種類の細胞の間に張られています。時ハエの幼虫の動きは、電子の相対変位pidermal付着細胞は樹状突起8,12の外側のセグメントで特定の一過性受容器電位バニロイド（TRPV）チャネルの感覚装置とその結果としての開口部の延伸につながる。信号は、中枢神経系における運動中枢パターン発生回路に転送される誘発した。
複数ChOsは、大人のフライ7に記載されている。これらは成人のフライ付属器（足、翼とホルター）の関節の近くにあり、胸部と腹部に位置しています。さらに、ChOs数百は、総称して機械的エネルギー3,5,17,4、その伝達し音響大人のアンテナでジョンストン器官を形成しています。
胚の段階でChOsの開発に関する広範な知識とは対照的に、ほとんどは幼虫の段階でこれらの器官の形態について知られている。また、大腿ChOsの例外18、ジョンストン器官で、私たちのknowled大人のフライでChOsの開発と構造についてGEは、非常に断片的です。
ここでは、3齢幼虫と蛹のChOsを染色し、可視化する方法について説明します。このメソッドは、優れた形態を特徴づけるとフライの様々なChOsの発展を理解するために遺伝的ツールと一緒に適用することができます。
Protocol
始める前に
- 希望するフライの文化を育てる。 （50mlのバイアルあたり約30ハエ）空いてバイアルを保持します。ハエは、それぞれのバイアルに一日だけのために卵を産みましょう。これは幼虫十分な食糧供給を提供し、彼らが食べ物から出クロールする前に、最大サイズに到達することができます。 3齢幼虫は、バイアルの壁にさまようし始めるまで、適切な温度でバイアルを保持します。
- 生理食塩水（PBS）とPBT（0.1％PBSでTween）のリン酸緩衝新鮮な株式を準備します。氷上で10 mlのPBSを保持します。
- 新鮮な固定液中1-5ミリリットル（PBTの4％ホルムアルデヒド）を準備し、それを氷上で保管してください。我々は、ストック溶液としてボトル37から38パーセントのホルムアルデヒドを使用しています。
1。 3齢幼虫の解剖と固定
- バイアル壁から放浪3齢幼虫を選び、Sylgard清板（にSylgard 184シリコーンエラストマーキット、ダウコーニング社製の氷冷PBS50μlのドロップに入れてください組織培養皿）。
- 微細な鉗子を（デュモン＃5鉗子）を使用して、口のフックの近くに、幼虫、背側を保持し、幼虫の脳を介して虫ピン（minutien、0.1ミリメートル、ステンレス鋼）を貼り付けます。
- ピンセットで幼虫の後端をつかみ、慎重に引き抜いて、ゆっくりと縦に幼虫を伸ばす。 2後部気門の間に別の虫ピンを貼り付けます。
- 春のはさみを使用すると、前部と後部のピンに近づけ体の壁に2つの水平方向の切開を（垂直前後軸まで）、カット。
- 春のはさみを使用すると、前方から後方に切開背側正中線に沿って幼虫の体壁を切った。
- 微細な鉗子を使用して、内部器官（腸、唾液腺、マルピーギ管など）や気管を削除します。 PBSで一度か二度優しく洗ってください。
- それらを伸ばし、各サイドに2つの虫ピンを使用してプレートにピン、ピンセットを持つ2つの体壁フラップをつかむ。
- Pを削除します。BSと定着液（PBTの4％ホルムアルデヒド）の50μlを加える。室温で20分間インキュベートします。
- 固定を外します。 PBSで2回洗浄します。虫ピンを引き抜きます。春のはさみを使用すると、長方形のフィレットを残して幼虫の頭と尾を切った。 PBSで冷却したエッペンドルフチューブに固定した組織を転送します。
- 幼虫の十分な数が固定されると、一つは抗体染色に直接続けることができます。即時の染色が必要でない場合は、固定の幼虫は、95％エタノールで3回、各5分間洗浄し、そして-20℃で95％エタノールに格納する必要があります
2。解剖および蛹の固定
パートI
- 3齢幼虫がpupariate始めるまで、幼虫の固定用としてバイアルに参加しています。バイアルにpupariatedた時間ごとやマークの幼虫を調べます。マーク蛹は29℃で24℃、または24から27時間で30から40時間を開発することができ℃の
- 微細な鉗子を使用すると、目の20-30蛹を選ぶ電子適切な年齢と暗い磁器マルチウェル解剖皿に入れます。興味のある組織を傷つけないように注意してください。
- 蛹のケースから蛹を抽出します。蓋を剥離することから始めると蛹が解放されるまで継続する。よくPBTでいっぱいに蛹を入れてください。すべての蛹を抽出し続けています。ステップ2.4から2.6までは、一度に5蛹の小さなバッチで実行する必要があります。
- 解剖皿のウェル間の平らな面に5蛹を置きます。ミクロ解剖ナイフを使用すると、頭部と腹部の後端（あるいは、それは蛹の両端に穴を引き裂くように鉗子の2ペアを使用することが可能である）の先端を切った。
- 微細な鉗子を使ってその場で蛹を保持し、前部の開口部を通してPBTを注入することにより、蛹の内臓を洗浄するために1 mlのシリンジを使用しています。
- ウェルのPBSを充填し、氷上で保存エッペンドルフチューブに冷たい固定に移動にそれを浸漬することにより解剖蛹手短に洗います。
- 4時（ON）で一晩インキュベートします。
パートII
- 固定液を捨て、PBTで蛹三回、各5分間に、洗ってください。氷の上で洗浄した蛹を保持します。
- PBTと解剖皿の二つの井戸を埋める。井戸のいずれかにポリエチレンパスツールピペット転送いくつかの蛹を使用します。
- 第2ウェルに一度蛹を移動します。翼の透明な蛹の表皮を剥がし、完全に一致ヒントをシャープ鉗子の2ペアを使用して：鉗子をよく使用して1つのペアの底に蛹を確保し、ゆっくりと鉗子の第二のペアを使用してキューティクルを引き裂く。一度キューティクルは、その皮翼から、引き裂かれています。蛹から羽を切断しないように注意してください。ウイングブレードからキューティクルを剥離した後、翼ヒンジ（ここで、翼ChOsが配置されている）のキューティクルの剥離を続ける。
- 翼キューティクルを剥離した後、人は同様の方法で足のキューティクルを剥離試みることができます。多くの足がプロセスで失われる可能性がありますが、それは非常に脚ChOsの染色を向上させるため、低収率にもかかわらず、この手順を強くお勧めします。平均棍と腹部のChOsはさらに表皮を剥離することなく可視化することができる。
- メタノールを充填したエッペンドルフチューブに "剥離"蛹を置き、室温で保持します。すべての蛹の表皮を剥離し続け、同じチューブに追加します。少なくとも10うまく剥離蛹は、それぞれの染色のために収集する必要があります。
- メタノールを除去し、95％エタノールで3回、各5分間に、洗ってください。固定の蛹は、-20℃で95％エタノールに長時間保つことができます
3。幼虫および蛹の免疫染色
- 室温でPBT 3回、各30分、で固定した組織を洗浄する。幼虫は回転板上で穏やかに振盪しながら洗浄することができる。蛹は、振とうせずに洗浄される。
- ブロッキングバッファー（PBTを交換PBT + 5％、Normalヤギ血清）と4℃でインキュベート℃、
- ブロッキングバッファーを除去し、4℃でONに一次抗体（ブロッキングバッファーで希釈した）でインキュベート
- ステップ3.1で説明したようにPBTで4回洗浄します。
- 4℃での二次抗体を用いたPBTとインキュベートする（ブロッキングバッファーで希釈した）を削除します。
- PBTで2回洗浄し、PBSで1回、ステップ3.1で説明します。
- マウンティング培地（Dako社製蛍光マウンティングメディウム（DAKO社サイトメーション、グロストラップ、デンマーク）と4℃でインキュベートONでPBSを交換してください。
4。幼虫の取り付け
- 幼虫は、その下に向けてキューティクルと上向きに体壁の筋肉を使って取り付け、メディアのドロップ顕微鏡スライド上にマウントされています。きれいなカバースリップ上で封入剤の小滴を入れて準備をカバーするために使用します。マウントされた幼虫上の任意の圧力を加えないでください。
5。蛹の取り付け
- 2顕微鏡スライドを準備します。マウンティング培地、解剖用と実装用番目のドロップダウンである。
- スライドのいずれかにいくつかの蛹を入れてください。
- 使用して、春のはさみは、頭部と腹部の後方部分を削除します。
- 翼と脚の間に切断して腹側の半分から胸部の背側半分を分離します。
- マウンティング溶液の液滴第二顕微鏡スライド上に蛹の解剖体の部分を配置します。翼と脚を伸ばしていることを確認し、組織のオーバーレイを可能な限り最小限に抑えるようにしてください。
- カバースリップ上に取り付け培地のドロップを配置し、試料上に置きます。マウントされたサンプルに圧力を加えないでください。
6。代表的な結果
3齢幼虫の免疫染色ChOsの例を図1に示されています。この例では、8 ChOsの7がはっきりと見えるこれでうまく伸ばして腹部のセグメントを示します。ニューロンは、実験室です。MAb22C10（1:20、アイオワ大学の発達研究ハイブリドーマバンクから得られる）とeled、キャップ、靭帯、キャップアタッチメントおよび靭帯付着細胞は抗αTub85E（1:10、Kleinらが付いています。 2010）。蛍光染色のための二次抗体はCy3、またはCy5標識anti-mouse/rabbit（1:200、ジャクソンイムノ研究所）であった。サンプルは共焦点顕微鏡（LSM 510、Zeiss）を用いて観察した。
35時間齢の蛹の腹部の半径方向の静脈で翼ChOsのクラスタを図2に示します。
図1単一Chの臓器を構成する6つの細胞型の（A）の模式図。キャップアタッチメント（CA）、キャップ（C）、scolopale（S）、ニューロン（N）、靭帯（L）および靭帯付着（LA 。） 5 ChOsがクラスタ化されているLCh5臓器は、（LT横横の筋肉のグループ全体に引き伸ばされ1-4）。横縦筋（LL1）、腹側縦筋（VL1-4）と横方向の腹斜筋（LO1）も示されている。腱細胞は茶色の球体た（Klein et al。、2010年から撮影した）として示されている。 （B）3齢幼虫の一つは腹部のセグメントは10倍の倍率で見た。それぞれの腹部のセグメント内に存在する8 ChOsのセブンは明白です：一緒にpentascolopidial臓器（LCh5）、単一横臓器（LCh1）と二つの腹ChOs（VChB）のいずれかを形成する5外側の臓器。 ChOsのニューロン（N）は神経細胞のマーカーモノクローナル抗体22C10（赤）で標識されています。靭帯（L）、キャップ（C）と添付ファイルの細胞（LA、CA）（青）抗αTub-85Eが付いています。キャップと靱帯細胞は、さらにデイ座（Nachman ら 、未発表データ）からの調節要素を保有するCHO-特定のGFPレポーターが付いています。
図2。 ら 、未発表データ）と共同でラベル付けされます。
Discussion
このビデオで説明されたプロトコルでは、幼虫および蛹の段階で自己受容ChOsを可視化する方法を提供します。自己受容ChOsの構造と開発に関する研究はこれまで主に胚の段階へと幼虫の成虫に制限されている。したがって、幼虫と成虫の両方ChOsの開発の後期段階の多くの側面は、大部分は不明のままである。 ショウジョウバエの共通の遺伝的ツールと組み合わせて記述されたプロトコルは、ChOs開発の後の段階で役割を果たす新しい遺伝子および経路を特定し、研究に利用することができます。このプロトコルは、CHOの可視化のために最適化されたが、そのような蛹の翼6のような他の組織の染色に適合させることができます。
Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
著者は私達の抗体を送信するためにアイオワ大学の発達研究ハイブリドーマバンクに感謝します。この作品は、イスラエル科学財団からの助成金（第29号/ 08）によってサポートされていました。 ASにもDFG（ドイツ学術振興）から研究助成金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 (or #55) forceps, biologie tip | F.S.T. | 11252-20 or 11252-10 (or similar forceps) | |
| Austerlitz stainless steel insect pins, minutiens 0.1mm | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6083-10 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 240.4019862 | |
| Vannas micro scissors (straight, 7.5 cm, blade 3mm) | AS Mdeizintechnik GmbH | 11-590-00 | Vannas Spring Scissors with identical specifications can be purchased from Roboz Surgical Instrument Co. |
| Orbital shaker - Rotamax-120 | Heidolph | N/A | |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Dako | ||
| X10 PBS formulation | The quality of PBS is critical for the success of this protocol | 2 gr/lit KCl, 2 gr/lit KH2PO4, 80 gr/lit NaCl, 21.7 gr/lit Na2HPO4.7H2O |
|
| PBT | X1 PBS + 0.1% Tween 20 |
References
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