Summary
의 유충과 pupae에 chordotonal 장기 immunostain하고 시각화하는 방법
Abstract
Proprioception은 몸 안에서 발생하는 자극에 반응하여 신체 부위의 움직임이나 위치를 감지할 수있는 능력입니다. fruitflies와 다른 곤충에 proprioception는 chordotonal 기관 (ChOs) 2 되나 특별한 감각 기관에 의해 제공됩니다. Drosophila의 많은 다른 기관들과 마찬가지로 ChOs는 플라이의 수명주기 동안 두번 개발할 수 있습니다. 첫째, 애벌레 ChOs이 embryogenesis 동안 개발할 수 있습니다. 그런 다음, 성인 ChOs는 애벌레 imaginal 디스크에서 개발하고 변형하는 동안 차별화하는 데 계속해서 시작합니다.
embryogenesis 동안 애벌레 ChOs의 개발은 광범위하게 10,11,13,15,16 연구되었습니다. 각 조의 중심은 신경 세포와 scolopale 세포들로 구성된 감각 단위입니다. 감각 단위 1,9,14 전문 표피 부착 세포를 통해 표피에 연결 액세서리 세포의 두 종류 사이에 뻗어있다. 언제 파리 유충 이동, 전자의 상대 변위pidermal 첨부 전지는 감각 유닛과 dendrite 8,12의 바깥 부분에서 구체적인 일시적인 수용체 잠재적인 vanilloid (TRPV) 채널의 논리상 필연의 개통으로 스트레칭이 생깁니다. elicited 신호는 다음 중추 신경계에서 전위의 중앙 패턴 발생기 회로로 전송됩니다.
여러 ChOs은 성인 플라이 7에 설명되어있다. 이들은 성인 플라이 appendages (다리, 날개 halters)의 관절 부근과 흉부와 복부에 위치하고 있습니다. 또한, ChOs 여러 수백 총칭 기계 에너지 3,5,17,4에 해당 transduce의 음향 성인 안테나에 존스턴의 장기를 형성하고 있습니다.
배아 단계의 ChOs의 개발에 관한 광범위한 지식와는 달리, 거의가 애벌레 단계 동안 이들 장기의 형태에 대해 알려져 있습니다. 또한, 대퇴 ChOs의 예외 18 존스턴의 오르간과, 우리 knowled성인 파리의 ChOs의 개발과 구조에 대한 GE는 매우 단편적인 것입니다.
여기는 세번째 instar의 애벌레와 pupae의 ChOs를 더럽히는 것하고 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 더 나은 형태와 특징 및 플라이의 다양한 ChOs의 발전을 이해하는 유전자 도구를 함께 적용할 수 있습니다.
Protocol
당신이 시작하기 전에
- 원하는 플라이 문화를 성장. (50 ML의 유리병 당 약 30 파리) 솟아 튜브를 유지. 파리는 각 유리병에서 단 하루 동안 알을 보자. 이것은 애벌레 충분한 식량 공급을 제공하며 그들이 음식을 밖으로 크롤 링하기 전에 최대한의 크기에 도달할 수 있습니다. 셋째 instar의 유충이 유리병 벽에 방황하기 시작 전까지는 적절한 온도의 튜브를 유지.
- 인산염의 신선한 재고가 식염수 (PBS)와 PBT (PBS에 0.1 %의 십대 초반)를 버퍼 준비합니다. 빙판에 PBS의 10 ML 보관하십시오.
- 신선한 정착액의 1-5 ML (PBT 4 %의 포름 알데히드)을 준비하고 얼음에 보관하십시오. 우리는 주식 솔루션으로 병 37~38%의 포름 알데히드를 사용합니다.
1. 셋째 Instar의 애벌레의 절개 및 고정
- 유리병 벽에서 방황하는 셋째 instar의 유충을 선택하고 Sylgard의 해부 플레이트 (에 Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트, DOW 코닝 주식 회사로 만들어진 얼음처럼 차가운 PBS의 50 μl 드롭에 배치조직 문화 요리).
- 좋은 포셉을 (뒤몽 # 5 포셉)를 사용하여, 입 후크 근처 유충, 등 부분의 면을 꽉 및 유충의 두뇌를 통해 곤충 핀 (minutien, 0.1 mm, 스테인레스 스틸)에 붙어 있어라.
- 집게와 애벌레의 뒷부분 끝을 잡아, 부드럽게 당겨 부드럽게 길이로 유충을 스트레칭. 두 후부 spiracles 사이에 다른 곤충 핀을 찔러.
- 사용하기 스프링 가위는 앞부분과 후부 핀이 가까운 신체 벽에 두 수평 incisions을 (수직 앞부분 - 후부 축까지), 컷.
- 봄 가위를 사용하면 사후 절개로 앞부분에서 지느러미 중간선에 따라 애벌레의 몸을 벽을 끊었어.
- 미세 집게를 사용하여 내부 장기 (창자, 침샘, malpighian tubules 등) 및 호흡 관을 제거합니다. PBS로 한 두 번 가볍게 씻는다.
- 그들이 밖에서 스트레칭과 각 측면하기위한 두 곤충 핀을 사용하여 접시에 뒤집어 씌워, 포셉과 두 신체 벽면 펄럭을 풉니다.
- P 제거학사 및 정착액 (PBT 4 %의 포름 알데히드) 50 μl를 추가합니다. 실온에서 20 분 알을 품다.
- 정착액을 제거합니다. PBS로 두 번 씻는다. 곤충 핀을 빼낸다. 사용하기 스프링 가위 사각형 등심을 떠나는 애벌레 머리와 꼬리를 잘라. PBS로 냉장 Eppendorf 튜브에 고정 조직을 전송합니다.
- 애벌레의 충분한 수의 고정되면, 하나는 항체 염색법에 직접 계속할 수 있습니다. 즉각적인 염색법이 원하는되지 않을 경우 고정 애벌레는 95 % 에탄올로 3 회 5 분마다을 씻어하고 -20 ° C.에 95 % 에탄올에 보관해야
2. 해부 및 Pupae의 고정
부 전
- 셋째 instar의 애벌레가 pupariate 시작할 때까지, 애벌레 고정 용과 같은 튜브에 참석. 튜브에게 pupariated했습니다 매시간 마크 애벌레를 검사합니다. 표시된 pupae는 29에서 24 ° C, 또는 24-27시간에서 30-40시간을 개발하도록 허용 ° C.
- 미세 집게를 사용하면 차의 20-30 pupae을 선택전자 적절한 연령과 어두운 도자기 다중 잘 해부 접시에 넣어 두었어요. 관심있는 조직을 손상하지 않도록주의하십시오.
- pupal 사건에서 나온 pupae의 압축을 풉니다. operculum를 벗겨내으로 시작하고 번데기는 무료입니다 때까지 계속합니다. 잘 PBT 가득에 번데기를 넣고. 모든 pupae를 추출 계속합니다. 단계 2.4-2.6은 번에 5 pupae 작은 일괄적으로 수행되어야한다.
- 해부 접시의 우물 사이의 평평한 표면에 서류가 다섯 pupae를 놓습니다. 마이크로 해부 나이프를 사용하면 머리 끝부분을 잘라 복부의 후부 팁은 (또는 그것 pupae의 양쪽 끝에 구멍을 뚫는 데 포셉 두 쌍을 사용할 수 있습니다.)
- 미세 집게를 사용 장소에 번데기를 잡고 앞부분은 오프닝을 통해 PBT을 주입하여 번데기의 내부 장기를 씻어 1 ML의 주사기를 사용합니다.
- 잘 PBS로 가득에 찍기로 해부하는 번데기를 간단히 씻고 얼음에 보관 Eppendorf 튜브에 감기 정착액으로 이동합니다.
- 4에서 (ON) 하룻밤 사이에 품어 ° C.
파트 II
- 정착액을 취소하고 PBT와 pupae 세 번 5 분마다을 씻는다. 얼음 한물간 pupae 보관하십시오.
- PBT와 해부 접시 두 우물을 채웁니다. 우물 중 하나에 폴리에틸렌 파스퇴르 피펫 송금 여러 pupae 사용하기.
- 두 번째로 잘 한 번에 하나의 번데기를 이동합니다. 날개의 투명한 pupal 표피 보지, 완전히 일직선 조언과 날카로운 집게의 두 쌍을 사용 포셉의 잘 사용 일쌍 바닥에 번데기를 보호하고 부드럽게 포셉의 두 번째 쌍을 사용하여 표피를 찢어. 일단 표피가 그걸 벗겨 날개 떨어져, 찢겨있다. 번데기에서 날개를 분리하지 않도록주의하십시오. 날개 날개의 표피를 벗겨내는 후에 날개 경첩 (여기서 날개 ChOs이있는)의 표피를 필링 계속합니다.
- 날개 표피를 벗겨내 후, 하나는 유사한 방식으로 다리의 표피를 벗겨내는 시도할 수 있습니다.많은 다리는 과정에서 손실될 가능성이 있지만, 크게 다리 ChOs의 염색법을 향상 때문에 낮은 수확량에도 불구하고,이 단계는 것이 좋습니다. haltere과 복부의 ChOs 추가로 표피를 벗겨내는 않고 시각이 될 수 있습니다.
- 메탄올로 가득 Eppendorf 튜브에있는 '벗겨'번데기를 놓고 실온에서 보관. 모든 pupae의 표피를 벗겨내는 계속하고, 같은 튜브에 추가합니다. 최소 10 멋지게 벗겨 pupae은 각 염색법으로 수집해야한다.
- 메탄올을 제거하고 95 % 에탄올로 세 번 5 분마다을 씻는다. 고정 pupae는 -20 ° C.에 95 % 에탄올에서 오랜 기간 동안 보관하실 수 있습니다
3. 애벌레와 Pupae의 Immunostaining
- 상온에서 PBT 세 번 30 분 각과 고정 조직을 씻으십시오. 애벌레는 회전 접시 부드러운 진동으로 씻어 수 있습니다. Pupae는 떨지 않고 씻어있다.
- 차단 버퍼 (와 PBT 교체 PBT + 5% Normal 염소 혈청)과 4에서있는 품어 ° C.
- 차단 버퍼를 제거하고 4 번 ° C. 켜져 일차 항체 (버퍼를 차단에 희석)로 품어
- 3.1 단계에서 설명한대로 PBT로 네 번 씻으십시오.
- 4 ° C.에서있는 이차 항체와 PBT 및 품어을 (버퍼를 차단에 희석)를 제거
- PBT로 두 번 씻어 한 번 PBS와 같은 단계를 3.1에서 설명한.
- 설치 매체 (Dako 형광등 장착 중간 (Dako Cytomation, Glostrup, 덴마크) 및 4에 품어 ° C에서 ON으로 PBS를 교체합니다.
4. 애벌레의 마운트
- 애벌레들은 표피가 아래로 향하게 및 신체 벽의 근육이 최대 직면한로 장착 미디어의 한 방울의 현미경 슬라이드에 탑재하고 있습니다. 깨끗한 커버 슬립에 장착 매체의 작은 방울을 넣고 준비를 충당하기 위해 그것을 사용합니다. 마운트 애벌레에 어떤 압력을 적용하지 마십시오.
5. Pupae의 마운트
- 이 현미경 슬라이드 준비설치 매체, 해부 용과 설치를위한 두 번째의 낙.
- 슬라이드 하나에 여러 pupae 입어.
- 사용하기 스프링 가위는 머리와 복부의 후부 부분을 제거합니다.
- 날개와 다리 사이로 절단하여 복부 이분의 일로부터 흉부의 지느러미 절반을 분리합니다.
- 장착 솔루션의 방울에서 두 번째로 현미경 슬라이드에 번데기의 해부 시체 조각을 놓으십시오. 날개와 다리가 밖으로 뻗어 있는지 확인하고 조직의 오버레이 가능 한한 최소화하려고합니다.
- 커버 슬립에 장착 매체의 방울을 넣은 샘플을 가져 오십시오. 탑재된 샘플 압력을 적용하지 마십시오.
6. 대표 결과
셋째 instar의 유충의 immuno-스테인드 ChOs의 예제는 그림 1에 표시됩니다. 이 예제는 8 ChOs 일곱 명확하게 표시되는 멋지게 뻗어 복부 세그먼트를 보여줍니다. 뉴런은 실험실입니다MAb22C10 (아이오와 대학에서 발달 연구 하이 브리 도마 은행에서 얻은 1시 20분,)로 eled;. 캡, 인대, 캡 부착 및 인대 부착 세포는 안티 - αTub85E (1시 10분, 클라인 외,으로 표시됩니다 2010). 형광 염색법을위한 차 항체는 Cy3 또는 Cy5-복합 anti-mouse/rabbit (1:200, 잭슨 Immunoresearch 연구소)했다. 샘플은 공촛점 현미경 (LSM 510 자이스 혈구)을 사용하여 조회되었습니다.
35 시간짜리 번데기의 복부 요골 정맥의 날개 ChOs의 클러스터는 그림 2에 표시됩니다.
그림 1은 단일 채널 기관을 구성하는 여섯 가지 세포 유형의 () 도식 그림 :. 캡 첨부 (CA), 캡 (C) scolopale (S), 신경 세포 (N), 인대 (L)과 인대 부착 (라 ). 다섯 ChOs가 클러스터된되는 LCh5 오르간은, 가로 가로 근육의 그룹 (LT 가로질러 뻗어있다1-4). 가로 세로 근육 (LL1), 복부 세로 근육 (VL1-4)와 측면 경사 근육 (LO1)도 그림하고 있습니다. 힘줄 세포는 갈색 분야 (클라인 외., 2010에서 가져온)로 그림한다. (B) 제 3 instar의 유충 중 하나는 복부 세그먼트 10X 배율로하셨습니다. 각 복부 세그먼트에있는 8 ChOs 중 일곱은 분명 위치 : 함께 pentascolopidial 기관 (LCh5), 하나의 측면 오르간 (LCh1) 두 복부 ChOs (VChB) 중 하나를 형성 다섯 측면 기관. ChOs의 뉴런 (N)는 마커의 연결 MAb 22C10 (적색)으로 표시됩니다. 인대 (L), 캡 (C) 및 부착 세포 (LA, CA)를 함께 분류되는 백신 αTub-85E (파란색). 뚜껑과 인대 세포가 추가로 데이 현장 (Nachman 외., 게시되지 않은 데이터)에서 규제 요소를 품고 조 특정 GFP 기자으로 표시됩니다.
그림 2. 외., 게시되지 않은 데이터)와 공동으로 분류됩니다.
Discussion
이 동영상에서 설명하는 프로토콜은 애벌레와 pupal 단계 동안 고유 ChOs을 시각화하는 방법을 제공한다. 고유 ChOs의 구조 및 개발에 관한 연구는 지금까지 주로 배아 단계와 애벌레 imaginal 디스크로 제한되었습니다. 따라서 애벌레와 어른 모두 ChOs 개발 후기 단계의 여러 측면은 크게 알려지지 않은 남아 있습니다. Drosophila에서 흔히 유전 도구와 결합하여 설명한 프로토콜은, 새로운 유전자 및 ChOs 개발의 후기 단계에서 역할을 경로를 파악하고 공부할 이용하실 수 있습니다. 이 프로토콜은 쵸의 시각화에 최적화되었지만, 그것은 그러한 pupal 날개 6 등 다른 조직의 염색법에 맞게 조정 할 수 있습니다.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 우리에게 항체를 보내주셔서 아이오와 대학에서 발달 연구 하이 브리 도마 은행을 감사드립니다. 이 작품은 이스라엘 과학 재단으로부터 보조금 (제 29 / 08)에 의해 지원되었다. 로도 DFG (독일 Forschungsgemeinschaft)의 연구 기금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 (or #55) forceps, biologie tip | F.S.T. | 11252-20 or 11252-10 (or similar forceps) | |
| Austerlitz stainless steel insect pins, minutiens 0.1mm | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6083-10 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 240.4019862 | |
| Vannas micro scissors (straight, 7.5 cm, blade 3mm) | AS Mdeizintechnik GmbH | 11-590-00 | Vannas Spring Scissors with identical specifications can be purchased from Roboz Surgical Instrument Co. |
| Orbital shaker - Rotamax-120 | Heidolph | N/A | |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Dako | ||
| X10 PBS formulation | The quality of PBS is critical for the success of this protocol | 2 gr/lit KCl, 2 gr/lit KH2PO4, 80 gr/lit NaCl, 21.7 gr/lit Na2HPO4.7H2O |
|
| PBT | X1 PBS + 0.1% Tween 20 |
References
- Brewster, R., Bodmer, R. Origin and specification of type II sensory neurons in Drosophila. Development. 121, 2923-2936 (1995).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16053-16053 (2003).
- Eberl, D. F. Feeling the vibes: chordotonal mechanisms in insect hearing. Curr. Opin. Neurobiol. 9, 389-393 (1999).
- Eberl, D. F., Boekhoff-Falk, G. Development of Johnston's organ in Drosophila. Int. J. Dev. Biol. 51, 679-687 (2007).
- Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila. J. Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).
- Egoz-Matia, N., Nachman, A., Halachmi, N., Toder, M., Klein, Y., Salzberg, A. Spatial regulation of cell adhesion in the Drosophila wing is mediated by Delilah, a potent activator of βPS integrin expression. Dev Biol. 351, 99-109 (2011).
- Field, L. H., Matheson, T. Chordotonal organs of insects. Advances in Insect Physiology. 27, 1-228 (1998).
- Gong, Z., Son, W., Chung, Y. D., Kim, J., Shin, D. W., McClung, C. A., Lee, Y., Lee, H. W., Chang, D. J., Kaang, B. K. Two interdependent TRPV channel subunits, inactive and Nanchung, mediate hearing in Drosophila. J. Neurosci. 24, 9059-9066 (2004).
- Inbal, A., Volk, T., Salzberg, A. Recruitment of ectodermal attachment cells via an EGFR-dependent mechanism during the organogenesis of Drosophila proprioceptors. Dev. Cell. 7, 241-250 (2004).
- Jarman, A. P., Grau, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. atonal is a proneural gene that directs chordotonal organ formation in the Drosophila peripheral nervous system. Cell. 73, 1307-1321 (1993).
- Jarman, A. P., Sun, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Role of the proneural gene, atonal, in formation of Drosophila chordotonal organs and photoreceptors. Development. 121, 2019-2030 (1995).
- Kim, J., Chung, Y. D., Park, D. Y., Choi, S., Shin, D. W., Soh, H., Lee, H. W., Son, W., Yim, J., Park, C. S. A TRPV family ion channel required for hearing in Drosophila. Nature. 424, 81-84 (2003).
- Klein, Y., Halachmi, N., Egoz-Matia, N., Toder, M., Salzberg, A. The proprioceptive and contractile systems in Drosophila are both patterned by the EGR family transcription factor Stripe. Dev. Biol. 337, 458-470 (2010).
- Matthews, K. A., Miller, D. F., Kaufman, T. C. Functional implications of the unusual spatial distribution of a minor alpha-tubulin isotype in Drosophila: a common thread among chordotonal ligaments, developing muscle, and testis cyst cells. Dev. Biol. 137, 171-183 (1990).
- Okabe, M., Okano, H. Two-step induction of chordotonal organ precursors in Drosophila embryogenesis. Development. 124, 1045-1053 (1997).
- Rusten, T. E., Cantera, R., Urban, J., Technau, G., Kafatos, F. C., Barrio, R. Spalt modifies EGFR-mediated induction of chordotonal precursors in the embryonic PNS of Drosophila promoting the development of oenocytes. Development. 128, 711-722 (2001).
- Todi, S. V., Sharma, Y., Eberl, D. F. Anatomical and molecular design of the Drosophila antenna as a flagellar auditory organ. Microsc. Res. Tech. 63, 388-399 (2004).
- zur Lage, P., Jarman, A. P. Antagonism of EGFR and notch signalling in the reiterative recruitment of Drosophila adult chordotonal sense organ precursors. Development. 126, 3149-3159 (1999).
