Summary
En metode for å immunostain og visualisere chordotonal organer i larver og pupper av
Abstract
Propriosepsjon er evnen til å oppfatte bevegelse, eller stilling, av kroppsdeler ved å svare på stimuli som oppstår i kroppen. I bananfluer og andre insekter propriosepsjon er levert av spesialiserte sanseorganer betegnes chordotonal organer (ChOs) 2. Som mange andre organer i Drosophila, ChOs utvikle to ganger i løpet av levetiden på flua. Først larver ChOs utvikle seg i løpet embryogenese. Deretter de voksne ChOs begynner å utvikle seg i larver imaginal plater og fortsette å differensiere under metamorfose.
Utviklingen av larver ChOs under embryogenese har blitt studert grundig 10,11,13,15,16. Sentralt i hver Cho er en sensorisk enhet består av et nevron og en scolopale celle. Den sensoriske Enheten er strukket mellom to typer tilbehør celler som festes til cuticle via spesialiserte epidermale vedlegg celler 1,9,14. Når en flue larva trekk, den relative forskyvning av epidermal vedlegg celler fører til strekking av sensorisk enhet og påfølgende åpning av spesifikke forbigående receptor potensielle vanilloid (TRPV) kanaler ved ytre delen av dendrite 8,12. Den fremkalte Signalet blir så overført til locomotor sentrale mønster generator krets i det sentrale nervesystemet.
Flere ChOs har blitt beskrevet i den voksne flua 7. Disse er plassert nær leddene i voksne fluefiskere vedheng (ben, vinger og hodelag) og i thorax og buk. I tillegg er flere hundre ChOs kollektivt danne Johnston orgel i den voksne antenne som transduce akustisk til mekanisk energi 3,5,17,4.
I motsetning til den omfattende kunnskap om utvikling av ChOs i embryonale stadier, er svært lite kjent om morfologi av disse organene i løpet av larvestadiet. Dessuten, med unntak av femorale ChOs 18 og Johnston orgel, vår knowledge om utvikling og struktur av ChOs i den voksne flua er svært fragmentarisk.
Her beskriver vi en metode for farging og visualisere ChOs i tredje instar larver og pupper. Denne metoden kan brukes sammen med genetiske verktøy for å bedre karakterisere morfologi og forstå utviklingen av de ulike ChOs i flua.
Protocol
Før du begynner
- Dyrk de ønskede fly kulturer. Oppbevar hetteglassene urørte (ca 30 fluer pr 50 ml hetteglass). La fluene legge egg for bare én dag i hvert hetteglass. Dette vil gi larvene nok matforsyning og tillate dem å nå maksimal størrelse før krypende ut av maten. Oppbevar hetteglassene i riktig temperatur frem til tredje instar larvene begynner å vandre på hetteglasset veggen.
- Utarbeide en frisk bestand av fosfat saltløsning (PBS) og PBT (0,1% Tween i PBS). Hold 10 ml PBS på is.
- Forbered 1-5 ml av frisk fiksativ (4% formaldehyd i PBT) og holde den på is. Vi bruker flaske 37-38% formaldehyd som en stamløsning.
1. Disseksjon og fiksering av tredje Instar Larver
- Plukk en vandrende tredje instar larve fra hetteglasset veggen og plasser den i en 50 mL dråpe iskald PBS på en Sylgard disseksjon plate (laget av Sylgard 184 silikonelastomer kit, Dow Corning Corporation i envevskultur parabolen).
- Hold larve, dorsal side opp, nær munningen krokene, bruker fine tang (Dumont # 5 tang), og stikke en insekt-pin (minutien, 0,1 mm, rustfritt stål) gjennom larve hjerne.
- Grab bakre enden av larven med tang, trekk forsiktig og strekke larven forsiktig langs. Stikk et annet insekt pin mellom de to bakre spiracles.
- Bruke våren saks klippet to horisontale snitt i kroppen veggen (vinkelrett på anterior-posterior aksen), i nærheten til de fremre og bakre pins.
- Bruke våren saksen klippe larvenes kroppen veggen langs dorsale midtlinjen fra fremre til bakre snitt.
- Fjern indre organer (tarm, spyttkjertlene, malpighian tubuli etc.) og luftrøret bruker fine tang. Vask forsiktig en eller to ganger med PBS.
- Grab de to kroppsveggen klaffer med tang, strekke dem ut og feste dem til platen ved hjelp av to insekt pinner for hver side.
- Fjern PBS og tilsett 50 mL av festing løsning (4% formaldehyd i PBT). Inkuber 20 minutter ved romtemperatur.
- Fjern bindemiddel. Vask to ganger med PBS. Trekk ut insekt pinnene. Bruke våren saks klippe larve hode og hale forlate en rektangulær filet. Overfør faste vevet til en kjølt Eppendorf rør med PBS.
- Når et tilstrekkelig antall larver er løst, kan man fortsette direkte til antistoff flekker. Dersom umiddelbar farging ikke er ønskelig, bør den faste larvene vaskes 3 ganger, 5 minutter hver, med 95% etanol og lagres i 95% etanol ved -20 ° C.
2. Disseksjon og fiksering av puppe
Del I
- Ivareta hetteglassene som for larver fiksering, frem til tredje instar larvene begynner å pupariate. Undersøk hetteglassene hver time og mark larver som har pupariated. La merket puppe å utvikle 30-40 timer ved 24 ° C, eller 24-27 timer ved 29 ° C.
- Bruke fin pinsett plukke 20-30 puppe av the passende alder og legg dem i en mørk porselen multi-brønn dissekere parabolen. Vær forsiktig så du ikke skader vevet av interesse.
- Pakk ut puppe fra pupal saken. Begynn med å trekke av operculum og fortsette inntil puppe er gratis. Sett puppe i en brønn fylt med PBT. Fortsett å trekke alle puppe. Trinn 2.4-2.6 bør gjøres i små grupper på fem puppe gangen.
- Plasser fem puppe på et flatt underlag mellom brønnene på dissekere parabolen. Ved hjelp av en mikro disseksjon kniv kuttet tuppen av hodet og den bakre enden av magen (alternativt, er det mulig å bruke to par pinsett for å rive hull i begge ender av puppe).
- Hold puppe på plass med fin pinsett og bruke en 1 ml sprøyte for å vaske ut de indre organer i puppe, ved å injisere PBT gjennom fremre åpningen.
- Vask dissekert puppe kort ved å dyppe den i en godt fylt med PBS og flytter den inn i kald fiksativ i en Eppendorf rør holdt på is.
- Inkuber over natten (ON) ved 4 ° C.
Del II
- Kast fiksativ og vaske puppe tre ganger, 5 minutter hver, med PBT. Hold vasket puppe på is.
- Fyll to brønner på dissekere fatet med PBT. Ved hjelp av en polyetylen Pasteur pipette overføre flere puppe til en av brønnene.
- Flytt en puppe gangen i den andre brønnen. Bruk to par skarpe tang med perfekt justerte tips, skrelle av gjennomsiktige pupal skjellaget av vingen: feste puppe til bunnen av brønnen ved hjelp av en pinsett, og forsiktig rive skjellaget med andre pinsett. Når cuticle er revet, skrelle den av vingen. Vær forsiktig så du ikke å koble vingen fra puppe. Etter peeling av skjellaget fra vingen bladet, fortsetter peeling skjellaget av vingen hengsel (der vingen ChOs befinner seg).
- Etter peeling av vingen skjellaget, kan man forsøke å trekke av beinet skjellaget på en lignende måte.Mange ben er trolig tapt i prosessen, men til tross for lav avkastning, er dette trinnet anbefales sterkt fordi det i stor grad forbedrer farging av ben ChOs. De ChOs av haltere og underlivet kan bli visualisert uten videre trekke av skjellaget.
- Plasser "barket" puppe i en Eppendorf rør fylt med metanol og holde ved romtemperatur. Fortsett å trekke av skjellaget av alle puppe, og legge dem til i samme rør. Minst 10 pent skrellet puppe bør samles for hver farging.
- Fjern metanol og vask tre ganger, 5 minutter hver, med 95% etanol. Fast puppe kan oppbevares i lange perioder av gangen i 95% etanol ved -20 ° C.
3. Farging av larver og pupper
- Vask fast vev med PBT tre ganger, 30 minutter hver, i romtemperatur. Larvene kan vaskes med forsiktig risting på en roterende plate. Puppe vaskes uten risting.
- Erstatt PBT med blokkering buffer (PBT + 5% normal geit serum) og inkuber PÅ ved 4 ° C.
- Fjern Blokkering buffer og inkuberes med primære antistoffer utvannet i blokkering buffer) PÅ ved 4 ° C.
- Vask fire ganger med PBT som beskrevet i trinn 3.1.
- Fjern PBT og inkuber med sekundære antistoffer (utvannet i blokkering buffer) PÅ ved 4 ° C.
- Vask to ganger med PBT og en gang med PBS som beskrevet i trinn 3.1.
- Erstatt PBS med montering medium (Dako Fluoriserende Mounting Medium (Dako Cytomation, Glostrup, Danmark) og inkuber ved 4 ° C på.
4. Montering av larver
- Larvene blir montert på et objektglass i en dråpe montering media med sin skjellaget vendt nedover og kroppen veggen muskler vendt opp. Sett en liten dråpe montering medium på en ren dekkglass og bruke den til å dekke forberedelse. Ikke legg noe press på den monterte larver.
5. Montering av puppe
- Forbered to objektglassmed en dråpe montering medium, en for disseksjon og andre for montering.
- Sett flere puppe på en av lysbildene.
- Bruke våren saks fjerne hodet og bakre del av buken.
- Skill dorsal halvdel av thorax fra ventrale halvdelen kutte mellom vingene og bena.
- Plasser dissekert kroppsdeler av puppe på andre objektglass i en dråpe montering løsning. Sørg for at vingene og bena er strukket ut og prøve å minimalisere overliggende vev så mye som mulig.
- Plasser en dråpe montering medium på en dekkglass og legg den over prøven. Ikke legg press på den monterte prøven.
6. Representative Resultater
Et eksempel på immuno Fargede ChOs av tredje instar larve er vist i Figur 1. Dette eksemplet viser et pent strukket abdominal segment der sju av de åtte ChOs er klart synlig. Nerveceller er labeled med MAb22C10 (1:20, hentet fra utviklingsstudier hybridoma Bank ved Universitetet i Iowa), lokket, ligament, cap-tilknytning og ligament vedlegg celler er merket med anti-αTub85E (1:10, Klein et al,. 2010). Sekundære antistoffer for lysrør farging var Cy3, eller Cy5-konjugert anti-mouse/rabbit (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories). Prøvene ble vist ved hjelp konfokalmikroskopi (LSM 510, Carl Zeiss).
En klynge av vinge ChOs ved ventrale radial åre av en 35 timers gammel puppe er vist i figur 2.
Figur 1 (A) Skjematisk illustrasjon av de seks celletyper som utgjør en enkelt Ch organ:. Cap festesystemet (CA), lue (C), scolopale (S), neuron (N), ligament (L) og ligament vedlegg (LA ). Den LCh5 organ, der fem ChOs er gruppert, er strukket tvers over gruppen av lateral tverrgående muskler (LT1-4). Den laterale langsgående muskel (LL1), ventrale langsgående musklene (VL1-4) og laterale skråstilte muskler (LO1) er også illustrert. Sene celler er illustrert som brune kuler (hentet fra Klein et al., 2010). (B) En abdominal segment av et tredje instar larve sett på en 10X forstørrelse. Sju av de åtte ChOs stede i hvert abdominal segment er tydelig: fem laterale organer som sammen danner pentascolopidial organ (LCh5), et enkelt lateral organ (LCh1) og en av to ventrale ChOs (VChB). Nervecellene (N) av ChOs er merket med nevronale markør MAB 22C10 (rød). Den ligament (L), lue (C) og vedlegg celler (LA, CA) er merket med anti-αTub-85E (blå). Hetten og ligament celler er i tillegg merket med en Cho-spesifikk GFP reporter harboring en regulatorisk element fra dei locus (Nachman et al. Upubliserte data).
Figur 2. et al. Upubliserte data).
Discussion
Protokollen er beskrevet i denne videoen gir en måte å visualisere proprioseptive ChOs under larver og pupal etapper. Studier om struktur og utvikling av proprioseptive ChOs har vært så langt begrenset seg hovedsakelig til embryonale stadier og larver imaginal plater. Dermed mange aspekter ved senere stadier av utvikling, både larver og voksen ChOs, fortsatt i stor grad ukjent. Den beskrives protokollen, kombinert med vanlige genetiske verktøy i Drosophila, kan utnyttes til å identifisere og studere nye gener og gangstier som spiller en rolle i senere stadier av ChOs utvikling. Denne protokollen ble optimalisert for visualisering av Cho, men det kan tilpasses for farging av andre vev, for eksempel pupal vinger 6.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke utviklingsstudier hybridoma Bank ved Universitetet i Iowa for å sende oss antistoffer. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning (nr. 29/08) fra The Israel Science Foundation. AS er også støttet av et forskningsstipend fra DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 (or #55) forceps, biologie tip | F.S.T. | 11252-20 or 11252-10 (or similar forceps) | |
| Austerlitz stainless steel insect pins, minutiens 0.1mm | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6083-10 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 240.4019862 | |
| Vannas micro scissors (straight, 7.5 cm, blade 3mm) | AS Mdeizintechnik GmbH | 11-590-00 | Vannas Spring Scissors with identical specifications can be purchased from Roboz Surgical Instrument Co. |
| Orbital shaker - Rotamax-120 | Heidolph | N/A | |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Dako | ||
| X10 PBS formulation | The quality of PBS is critical for the success of this protocol | 2 gr/lit KCl, 2 gr/lit KH2PO4, 80 gr/lit NaCl, 21.7 gr/lit Na2HPO4.7H2O |
|
| PBT | X1 PBS + 0.1% Tween 20 |
References
- Brewster, R., Bodmer, R. Origin and specification of type II sensory neurons in Drosophila. Development. 121, 2923-2936 (1995).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16053-16053 (2003).
- Eberl, D. F. Feeling the vibes: chordotonal mechanisms in insect hearing. Curr. Opin. Neurobiol. 9, 389-393 (1999).
- Eberl, D. F., Boekhoff-Falk, G. Development of Johnston's organ in Drosophila. Int. J. Dev. Biol. 51, 679-687 (2007).
- Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila. J. Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).
- Egoz-Matia, N., Nachman, A., Halachmi, N., Toder, M., Klein, Y., Salzberg, A. Spatial regulation of cell adhesion in the Drosophila wing is mediated by Delilah, a potent activator of βPS integrin expression. Dev Biol. 351, 99-109 (2011).
- Field, L. H., Matheson, T. Chordotonal organs of insects. Advances in Insect Physiology. 27, 1-228 (1998).
- Gong, Z., Son, W., Chung, Y. D., Kim, J., Shin, D. W., McClung, C. A., Lee, Y., Lee, H. W., Chang, D. J., Kaang, B. K. Two interdependent TRPV channel subunits, inactive and Nanchung, mediate hearing in Drosophila. J. Neurosci. 24, 9059-9066 (2004).
- Inbal, A., Volk, T., Salzberg, A. Recruitment of ectodermal attachment cells via an EGFR-dependent mechanism during the organogenesis of Drosophila proprioceptors. Dev. Cell. 7, 241-250 (2004).
- Jarman, A. P., Grau, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. atonal is a proneural gene that directs chordotonal organ formation in the Drosophila peripheral nervous system. Cell. 73, 1307-1321 (1993).
- Jarman, A. P., Sun, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Role of the proneural gene, atonal, in formation of Drosophila chordotonal organs and photoreceptors. Development. 121, 2019-2030 (1995).
- Kim, J., Chung, Y. D., Park, D. Y., Choi, S., Shin, D. W., Soh, H., Lee, H. W., Son, W., Yim, J., Park, C. S. A TRPV family ion channel required for hearing in Drosophila. Nature. 424, 81-84 (2003).
- Klein, Y., Halachmi, N., Egoz-Matia, N., Toder, M., Salzberg, A. The proprioceptive and contractile systems in Drosophila are both patterned by the EGR family transcription factor Stripe. Dev. Biol. 337, 458-470 (2010).
- Matthews, K. A., Miller, D. F., Kaufman, T. C. Functional implications of the unusual spatial distribution of a minor alpha-tubulin isotype in Drosophila: a common thread among chordotonal ligaments, developing muscle, and testis cyst cells. Dev. Biol. 137, 171-183 (1990).
- Okabe, M., Okano, H. Two-step induction of chordotonal organ precursors in Drosophila embryogenesis. Development. 124, 1045-1053 (1997).
- Rusten, T. E., Cantera, R., Urban, J., Technau, G., Kafatos, F. C., Barrio, R. Spalt modifies EGFR-mediated induction of chordotonal precursors in the embryonic PNS of Drosophila promoting the development of oenocytes. Development. 128, 711-722 (2001).
- Todi, S. V., Sharma, Y., Eberl, D. F. Anatomical and molecular design of the Drosophila antenna as a flagellar auditory organ. Microsc. Res. Tech. 63, 388-399 (2004).
- zur Lage, P., Jarman, A. P. Antagonism of EGFR and notch signalling in the reiterative recruitment of Drosophila adult chordotonal sense organ precursors. Development. 126, 3149-3159 (1999).
