Summary
Метод immunostain и визуализировать хордотональные органов у личинок и куколок
Abstract
Проприоцепция это возможность ощутить движение или положение частей тела, реагируя на стимулы, возникающие в организме. В fruitflies и других насекомых проприоцепции осуществляется специализированными органами чувств называется хордотональные органов (Chos) 2. Как и многие другие органы, у дрозофилы, Chos развивать два раза в течение жизненного цикла лету. Во-первых, личиночной Chos развиваться во время эмбриогенеза. Затем взрослый Chos начинают развиваться в личиночной имагинальной диски и продолжают дифференцироваться во время метаморфоза.
Развитие личинок Chos во время эмбриогенеза была изучена 10,11,13,15,16. Центральное место в каждом ХО является сенсорный блок состоит из нейронов и scolopale клетки. Сенсорный блок растягивается между двумя типами вспомогательных клеток, которые крепятся к кутикуле через специализированные клетки эпидермиса вложений 1,9,14. Когда личинка мухи перемещается, относительное смещение электроннойpidermal клеток вложений приводит к растяжению сенсорные устройства и последующее открытие конкретных переходный рецепторный потенциал ваниллоидных (TRPV) каналов на внешнем сегменте дендритов 8,12. Вызвало сигнал затем передается опорно-двигательного центральной цепи генератора картина в центральной нервной системе.
Несколько Chos были описаны у взрослых мух 7. Они расположены вблизи суставов у взрослых мух придатки (ноги, крылья и поводов) и в области грудной клетки и живота. Кроме того, несколько сотен Chos вместе образуют орган Джонстона во взрослом антенны, преобразовывать акустические в механическую энергию 3,5,17,4.
В отличие от обширных знаний о развитии Chos в эмбриональной стадии, очень мало известно о морфологии этих органов в личиночной стадии. Кроме того, за исключением бедренной Chos 18 и орган Джонстона, наши knowledGE о развитии и структуре Chos во взрослой мухи очень отрывочны.
Здесь мы опишем метод окрашивания и визуализации Chos в третьем личинок и куколок возраста. Этот метод может применяться вместе с генетическими инструментами, чтобы лучше характеризуют морфологию и понять развитие различных Chos в лету.
Protocol
Перед тем как начать
- Рост желаемого культуры лету. Хранить флаконы непереполненные (около 30 мух на 50 мл флакон). Пусть мухи откладывают яйца только на один день в каждом флаконе. Это обеспечит достаточное количество личинок пищей и дать им возможность достичь максимального размера до вылезая из пищи. Хранить флаконы в соответствующем температуре до третьего возраста личинки начинают бродить на флаконе стены.
- Подготовить новый запас фосфатным буферным раствором (PBS) и PBT (0,1% Tween в PBS). Держите 10 мл PBS на льду.
- Подготовить 1-5 мл свежего фиксатора (4% формальдегида в PBT) и держать его на льду. Мы используем бутылки 37-38% формальдегида в качестве исходного раствора.
1. Вскрытие и фиксации личинки третьего Инстар
- Выберите блуждающих третьей взрослой личинки из флакона стены и поместить его в 50 мкл капли ледяной PBS на тарелку Sylgard рассечение (из 184 Sylgard силиконового эластомера комплект корпорации Dow Corning вкультуры тканей блюдо).
- Держите личинки, спинной стороной вверх, в районе устья крючки, с помощью тонкой щипцы (Дюмон # 5 щипцы), и придерживаться насекомых контактный (minutien, 0,1 мм, нержавеющая сталь) с помощью мозга личинок.
- Возьмите задний конец личинки пинцетом, осторожно тянуть и растягивать личинку аккуратно продольно. Придерживайтесь другое насекомое контактный двух задних дыхальца.
- Используя ножницы весной вырезать две горизонтальные разрезы в стенке тела (перпендикулярно передне-задней оси), недалеко от переднего и заднего контактов.
- С помощью ножниц разрезать весной личиночной стенкой тела вдоль спинной средней линии от передней к задней разрез.
- Удалить внутренних органов (кишечника, слюнных желез, мальпигиевых сосудов и т.д.) и трахеи с использованием тонких щипцов. Мойте мягко один или два раза PBS.
- Возьмите двух створок стенки тела щипцами, растянуть их и прикрепите их к пластине с помощью двух насекомых контактов с каждой стороны.
- Удалить PBS и добавить 50 мкл фиксирующем растворе (4% формальдегида в PBT). Инкубировать 20 минут при комнатной температуре.
- Снимите фиксатор. Мыть два раза PBS. Вытяните насекомых булавками. Используя ножницы весной сократить личиночной голову и хвост оставить прямоугольной филе. Передача фиксированной ткани охлажденной трубки Эппендорф с PBS.
- После того, как достаточное количество личинок являются фиксированными, можно продолжить непосредственно на антитела окрашивания. Если немедленно окрашивание не требуется, фиксированные личинки должны быть вымыты в 3 раза, 5 минут, с 95% этанола и хранят в 95% этанола при -20 ° C.
2. Вскрытие и фиксации Куколки
Часть I
- Участие в ампулах, как и для личинок фиксации, до третьего возраста личинки начинают pupariate. Изучить флаконов в час и знак личинки, которые pupariated. Позвольте отмеченной куколки развиваться 30-40 часов при температуре 24 ° С, или 24-27 часов при 29 ° C.
- Используя тонкий пинцет выбрать 20-30 куколок-йэлектронной соответствующего возраста и поместить их в темное фарфора мульти-и рассечения блюдо. Будьте осторожны, чтобы не повредить ткани интерес.
- Извлечение из куколки куколки случае. Начнем с отшелушивающим крышечки и продолжаются до куколки бесплатно. Положить в куколку и заполнены PBT. Продолжить извлечения всех куколок. Шаги 2.4-2.6 должно быть сделано в маленьких партиях из пяти куколок одновременно.
- Разместить пять куколок на ровную поверхность между скважин вскрытия блюдо. Использование микро-нож рассечение сократить кончик головы и задний конец брюшка (в качестве альтернативы, можно использовать две пары щипцов рвать отверстиями на обоих концах куколки).
- Держите куколки на месте с помощью пинцета и тонких использовать 1 мл шприц промыть внутренних органов куколки, вводя PBT через передние отверстия.
- Вымойте расчлененный куколки кратко, опуская его в хорошо заполнены PBS и переместить его в холодную фиксатор в пробирку Эппендорфа держится на льду.
- Выдержите в течение ночи (ON) при 4 ° C.
Часть II
- Откажитесь от фиксатора и мыть куколок три раза по 5 минут каждая, с PBT. Храните вымытые куколок на льду.
- Заполнить две скважины на вскрытии блюдо с PBT. Использование полиэтиленовой пипетки Пастера передачи несколько куколок в одной из ям.
- Перемещение на одну куколку в то время, во второй хорошо. С помощью двух пар острый пинцет с идеально ровные советы, снимите прозрачную куколки кутикулы крыла: обеспечить куколки на дно и с помощью одной пары щипцов и аккуратно оторвать кутикулы используя вторую пару щипцов. После того, кутикула разрывается, очистить его от крыла. Будьте осторожны, чтобы не отключать крыла из куколки. После пилинга от кутикулы от крыла лезвие, продолжают пилинг кутикулы крыла петли (там, где крыло Chos расположены).
- После пилинга с крылом кутикулы, можно попытаться отшелушивающим ногу кутикулы в подобной манере.Многие ноги, вероятно, будут потеряны в процессе, но, несмотря на низкую доходность, то этот шаг рекомендуется, поскольку она значительно улучшает окрашивания ног Chos. Chos из haltere и живота могут быть визуализированы без дальнейшего отшелушивающим кутикулы.
- Поместите "очищенные" куколки в пробирку Эппендорфа заполнены метанола и держать при комнатной температуре. Продолжить отшелушивающим кутикулы всех куколок, и добавить их к той же трубе. По меньшей мере 10 хорошо очищенные куколки должны быть собраны для каждого окрашивания.
- Удалите метанол и промыть три раза, 5 минут, с 95% этанола. Исправлена куколок можно хранить в течение длительного периода времени в 95% этанола при -20 ° C.
3. Иммуноокрашивание личинок и куколок
- Вымойте фиксированной ткани с PBT в три раза, 30 минут при комнатной температуре. Личинки можно мыть с мягким тряски на вращающейся тарелке. Куколки моются без встряхивания.
- Замените PBT блокирующим буфером (PBT + 5% нormal сыворотки козьего) и инкубировать ON при 4 ° C.
- Удалите блокирующий буфер и инкубировать с первичными антителами (разбавленный в блокирующем буфере) ON при 4 ° C.
- Промойте в четыре раза с PBT, как описано в шаге 3.1.
- Удалить PBT и инкубировать с вторичными антителами (разбавленный в блокирующем буфере) ON при 4 ° C.
- Мыть два раза PBT и один раз PBS, как описано в пункте 3.1.
- Замените PBS с монтажной среды (Dako флуоресцентная Монтаж среднего (Dako Cytomation, Glostrup, Дания) и инкубировать при температуре 4 ° C ON.
4. Монтаж Личинки
- Личинки установлены на предметное стекло в каплю монтаж средств массовой информации с их кутикулу вниз и мышцах стенки тела вверх. Нанесите небольшое падение монтажа среды на чистую скольжения крышки и использовать его для покрытия подготовки. Не применять любое давление на смонтированном личинок.
5. Монтаж Куколки
- Приготовьте два слайды микроскопомс каплей установки среды, по одному для вскрытия, а второй для монтажа.
- Положите несколько куколок на одном из слайдов.
- Используя ножницы весной удалить головы и задней части брюшной полости.
- Отделите спинной половине грудной клетки от брюшной половина резки между крыльями и ногами.
- Поместите расчлененные части тела куколки на втором предметное стекло в каплю решение для монтажа. Убедитесь, что крылья и ноги вытянуты и стараются свести к минимуму наложение тканей как можно больше.
- Поместите каплю монтаж среды на покровным стеклом и поместить его по образцу. Не давите на смонтированном образца.
6. Представитель Результаты
Например иммуно-окрашенных Chos третьего возраста личинка показано на рисунке 1. Этот пример показывает, хорошо растягивается брюшной сегмент, в котором семь из восьми Chos четко видны. Нейроны являются лабораторииeled с MAb22C10 (1:20, полученные от Банка развития исследований Hybridoma в Университете штата Айова), шапки, связки, шапка-приложения и клетки связки вложений помечены анти-αTub85E (1:10, Клейн и др.. 2010). Вторичные антитела для флуоресцентной окраски были Cy3 или Cy5-сопряженных anti-mouse/rabbit (1:200, Джексон Immunoresearch Laboratories). Образцы были просмотрены с помощью конфокальной микроскопии (LSM 510, Zeiss).
Кластер крыла Chos на вентральной радиальные вены на 35 часов от роду куколки показано на рисунке 2.
Рисунок 1 (А) Схематическое изображение из шести типов клеток, которые составляют единый орган Ch. Крышка крепления (CA), шапка (C), scolopale (S), нейронов (N), связки (L) и связки вложений (LA ). LCh5 орган, в котором пять Chos сгруппированы, растягивается по всей группе боковых поперечных мышц (LT1-4). Боковые продольные мышцы (LL1), вентральных продольных мышц (VL1-4) и боковые косые мышцы (LO1) также показано на рисунке. Сухожилия клеток показано, как коричневые сферы (Взято из Klein и соавт., 2010). (B) один сегмент брюшка третьего возраста личинка посмотреть на 10-кратным увеличением. Семь из восьми Chos присутствует в каждом сегменте брюшка очевидны: пять боковых органов, которые вместе образуют pentascolopidial органа (LCh5), один боковой орган (LCh1) и один из двух вентральных Chos (VChB). Нейронов (N) в Chos помечены маркером нейронной MAb 22C10 (красный). Связки (L), шапка (C) и вложений клеток (Лос-Анджелес, Калифорния) помечены анти-αTub-85E (синий). Шапка и связки клетки дополнительно помечены ХО конкретных GFP репортер укрывательство регуляторного элемента из деи локус (Нахмана и соавт., Неопубликованные данные).
Рисунок 2. и соавт., Неопубликованные данные).
Discussion
Протокол, описанный в этом видео дает возможность визуализировать проприоцептивной Chos во личинок и куколки. Исследования о строении и развитии проприоцептивной Chos были до сих пор ограничены главным образом эмбриональной стадии и личиночной имагинальной дисков. Таким образом, многие аспекты более поздних стадиях развития, как личинок и взрослых Chos, остаются в основном неизвестными. Описанный протокол, в сочетании с общим генетическим инструментов у дрозофилы, может быть использована для выявления и изучения новых генов и путей, которые играют определенную роль в более поздних стадиях развития Chos. Этот протокол был оптимизирован для визуализации ХО, но она может быть адаптирована для окрашивания других тканей, таких как куколки крылья 6.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить развития исследований Hybridoma банка в Университете штата Айова для отправки нам антител. Эта работа была поддержана грантом (№ 29/08) из Израиля научного фонда. AS также поддерживает исследования грант DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 (or #55) forceps, biologie tip | F.S.T. | 11252-20 or 11252-10 (or similar forceps) | |
| Austerlitz stainless steel insect pins, minutiens 0.1mm | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6083-10 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 240.4019862 | |
| Vannas micro scissors (straight, 7.5 cm, blade 3mm) | AS Mdeizintechnik GmbH | 11-590-00 | Vannas Spring Scissors with identical specifications can be purchased from Roboz Surgical Instrument Co. |
| Orbital shaker - Rotamax-120 | Heidolph | N/A | |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Dako | ||
| X10 PBS formulation | The quality of PBS is critical for the success of this protocol | 2 gr/lit KCl, 2 gr/lit KH2PO4, 80 gr/lit NaCl, 21.7 gr/lit Na2HPO4.7H2O |
|
| PBT | X1 PBS + 0.1% Tween 20 |
References
- Brewster, R., Bodmer, R. Origin and specification of type II sensory neurons in Drosophila. Development. 121, 2923-2936 (1995).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16053-16053 (2003).
- Eberl, D. F. Feeling the vibes: chordotonal mechanisms in insect hearing. Curr. Opin. Neurobiol. 9, 389-393 (1999).
- Eberl, D. F., Boekhoff-Falk, G. Development of Johnston's organ in Drosophila. Int. J. Dev. Biol. 51, 679-687 (2007).
- Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila. J. Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).
- Egoz-Matia, N., Nachman, A., Halachmi, N., Toder, M., Klein, Y., Salzberg, A. Spatial regulation of cell adhesion in the Drosophila wing is mediated by Delilah, a potent activator of βPS integrin expression. Dev Biol. 351, 99-109 (2011).
- Field, L. H., Matheson, T. Chordotonal organs of insects. Advances in Insect Physiology. 27, 1-228 (1998).
- Gong, Z., Son, W., Chung, Y. D., Kim, J., Shin, D. W., McClung, C. A., Lee, Y., Lee, H. W., Chang, D. J., Kaang, B. K. Two interdependent TRPV channel subunits, inactive and Nanchung, mediate hearing in Drosophila. J. Neurosci. 24, 9059-9066 (2004).
- Inbal, A., Volk, T., Salzberg, A. Recruitment of ectodermal attachment cells via an EGFR-dependent mechanism during the organogenesis of Drosophila proprioceptors. Dev. Cell. 7, 241-250 (2004).
- Jarman, A. P., Grau, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. atonal is a proneural gene that directs chordotonal organ formation in the Drosophila peripheral nervous system. Cell. 73, 1307-1321 (1993).
- Jarman, A. P., Sun, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Role of the proneural gene, atonal, in formation of Drosophila chordotonal organs and photoreceptors. Development. 121, 2019-2030 (1995).
- Kim, J., Chung, Y. D., Park, D. Y., Choi, S., Shin, D. W., Soh, H., Lee, H. W., Son, W., Yim, J., Park, C. S. A TRPV family ion channel required for hearing in Drosophila. Nature. 424, 81-84 (2003).
- Klein, Y., Halachmi, N., Egoz-Matia, N., Toder, M., Salzberg, A. The proprioceptive and contractile systems in Drosophila are both patterned by the EGR family transcription factor Stripe. Dev. Biol. 337, 458-470 (2010).
- Matthews, K. A., Miller, D. F., Kaufman, T. C. Functional implications of the unusual spatial distribution of a minor alpha-tubulin isotype in Drosophila: a common thread among chordotonal ligaments, developing muscle, and testis cyst cells. Dev. Biol. 137, 171-183 (1990).
- Okabe, M., Okano, H. Two-step induction of chordotonal organ precursors in Drosophila embryogenesis. Development. 124, 1045-1053 (1997).
- Rusten, T. E., Cantera, R., Urban, J., Technau, G., Kafatos, F. C., Barrio, R. Spalt modifies EGFR-mediated induction of chordotonal precursors in the embryonic PNS of Drosophila promoting the development of oenocytes. Development. 128, 711-722 (2001).
- Todi, S. V., Sharma, Y., Eberl, D. F. Anatomical and molecular design of the Drosophila antenna as a flagellar auditory organ. Microsc. Res. Tech. 63, 388-399 (2004).
- zur Lage, P., Jarman, A. P. Antagonism of EGFR and notch signalling in the reiterative recruitment of Drosophila adult chordotonal sense organ precursors. Development. 126, 3149-3159 (1999).
