Summary
Larva ve pupa da chordotonal organları immunostain ve görselleştirmek için bir yöntem
Abstract
Propriyoseptör bünyesinde doğan uyaranlara yanıt vererek vücut parçalarının hareket, ya da pozisyon, hissedebilme yeteneğidir. Fruitflies ve diğer böcekler ise propriosepsiyon chordotonal organlar (ChOs) 2 olarak adlandırılan özel bir duyu organları tarafından sağlanır. Drosophila birçok diğer organları gibi, ChOs sineğin ömrü boyunca iki kez geliştirmek. İlk olarak, larva ChOs embriyogenez sırasında gelişebilir. Sonra yetişkin ChOs larva hayali disklerde geliştirmek ve Başkalaşım sırasında ayırt devam başlar.
Embriyogenez sırasında larva ChOs gelişimi yoğun 10,11,13,15,16 çalışılmıştır. Her bir CHO, merkez Bir nöron ve bir scolopale hücre oluşan bir duyu birimidir. Duyumsal ünitesi 1,9,14 özel epidermal ek hücreler yoluyla kütikül eklemek aksesuar hücrelerinin iki tür arasında gerilir. Bir sinek larva hamle, e göreceli ötelemepidermal eki hücreleri duyusal ünitesi ve dendrit 8,12 dış segmentinde belirli geçici reseptör potansiyeli vanilloid (TRPV) kanallarının açılması sonucu uzanan yol açar. Elicited sinyal daha sonra, merkezi sinir sisteminde, merkezi lokomotor şekli oluşturucu devresine aktarılır.
Çoklu ChOs yetişkin sinek 7'de tarif edilmiştir. Bunlar erişkin sinek uzantıları (bacak, kanat ve halters) ve eklemlere yakın ve toraks ve batın bulunmaktadır. Buna ek olarak, ChOs birkaç yüz topluca mekanik enerji 3,5,17,4 bu iletiminde de akustik yetişkin anteni Johnston organ oluştururlar.
Embriyonik aşamalarında ChOs gelişimi hakkında geniş bilgi aksine, çok az larva dönemlerinde bu organların morfolojisi hakkında bilinmektedir. Ayrıca, femur ChOs hariç 18 ve Johnston organ olan, bizim knowlederişkin sinek ChOs gelişimi ve yapısı hakkında ge çok bölük pörçük olduğunu.
Burada Üçüncü dönem larva ve pupa da ChOs boyama ve görselleştirme için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, iyi karakterize morfoloji ve uçucu çeşitli ChOs gelişimini anlamak için genetik araçları ile birlikte de uygulanabilir.
Protocol
Başlamadan önce
- İstediğiniz sinek kültürleri büyütün. (50 ml flakon başına yaklaşık 30 sinekler) bulursunuz şişeleri tutun. Sinekler Her flakon yalnızca bir gün için yumurtalarını edelim. Bu larvalar yeterli gıda kaynağı sağlamak ve onlara gıda dışında tarama öncesi maksimal büyüklüğe ulaşmak sağlayacaktır. Üçüncü dönem larvalar flakon duvara dolaşmaya başlar kadar uygun sıcaklık şişeleri tutun.
- Fosfat taze bir stok (PBS) ve PBT (PBS içinde% 0.1 Tween) tamponlu hazırlayın. Buz üzerinde 10 ml PBS tutmak.
- Taze sabitleştirici 1-5 ml (PBT% 4 Formaldehit) hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Biz bir stok çözüm olarak şişelenmiş 37-38% formaldehit kullanın.
1. Üçüncü Larvalar diseksiyonu ve Fiksasyon
- Flakon duvardan bir gezgin Üçüncü dönem larva alın ve bir Sylgard diseksiyon plaka (bir de Sylgard 184 silikon elastomer kiti, Dow Corning Corporation yapılan buz gibi soğuk PBS bir 50 ul damlasının içine yerleştirdiğinizdedoku kültürü çanak).
- Ince forseps (Dumont # 5 forseps) kullanarak, ağız kancalar yakınında, larva, dorsal yüzü yukarı tutun ve larva beyninde bir böcek pin (minutien, 0,1 mm, paslanmaz çelik) sopa.
- Forseps ile larva posterior ucundan tut, hafifçe çekin ve yavaşça boyuna larva germek. Iki posterior spiracles arasındaki bir başka böcek pin sopa.
- Kullanımı bahar makas anterior ve posterior iğne yakın vücut duvarı iki yatay insizyon (dik ön-arka eksen), kesti.
- Yay makas kullanılarak posterior insizyon anterior gelen dorsal orta hat boyunca larva vücut duvarı kesti.
- Ince forseps kullanılarak iç organlar (bağırsak, tükürük bezleri, Malpighi tüpleri tübüller vb) ve trakea çıkarın. PBS ile bir veya iki kez yıkayın.
- Onları germek ve her tarafı için iki böcek pimleri kullanarak tabagina pin, forseps ile iki gövde duvarı flep tut.
- P çıkarınBS ve sabitleme solüsyonu (PBT% 4 formaldehit) 50 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir.
- Sabitleştirici çıkarın. PBS ile iki kez yıkayın. Böcek pimleri çekin. Kullanımı bahar makas dikdörtgen köşe bırakarak larva baş ve kuyruk kesilir. PBS ile soğutulmuş Eppendorf tüpüne sabit doku aktarın.
- Larvalar yeterli sayıda sabitlenir sonra, bir antikor boyama doğrudan devam edebilir. Derhal boyama arzu edilmediği takdirde, sabit bir larva% 95 etanol ile 3 defa, 5 dakika, her biri yıkanmış ve -20 ° C'de% 95 etanol içinde saklanmalıdır
2. Diseksiyon ve Pupalar Fiksasyonu
Bölüm I
- Üçüncü dönem larva pupariate alıncaya kadar, larva fiksasyon gibi şişelere katılın. Şişeleri pupariated var her saat ve işareti larva inceleyin. İşaretli pupa 29 at 24 ° C veya 24-27 saat sonra 30-40 saat geliştirmek için izin ° C.
- Ince forseps kullanma th 20-30 pupa almake uygun yaş ve karanlık bir porselen çok iyi diseksiyon tabağına koyun. Ilgi dokulara zarar vermemek için dikkatli olun.
- Pupa halinde gelen pupa ayıklayın. Operculum'un soyulmuştu başlayın ve pupa serbest kalıncaya kadar devam eder. Iyi PBT dolu içine pupa koyun. Tüm pupa ayıklanması devam edin. Adımlar 2,4-2,6 bir seferde beş pupa küçük gruplar halinde yapılmalıdır.
- Diseksiyon çanağı kuyuları arasındaki düz bir yüzey üzerine beş pupa yerleştirin. Bir mikro diseksiyon bıçak kullanarak baş ucu kesilir ve karın arka ucu (alternatif olarak, pupa her iki ucunda delik gözyaşı forseps iki çift kullanmak mümkündür).
- Ince forseps kullanılarak yerinde pupa tutun ve ön delikten PBT enjekte edilerek, pupa ve iç organları dışarı yıkamak için 1 ml şırınga kullanın.
- Bir de PBS ile dolu onu batırarak disseke pupa kısaca yıkayın ve buz üzerinde tutulmalıdır bir Eppendorf tüp soğuk fiksatif içine taşıyın.
- 4 de (ON) gece inkübe ° C
Bölüm II
- Sabitleştirici atın ve PBT ile pupa üç kez, 5 dakika, her biri yıkayın. Buz üzerinde yıkanmış pupa tutun.
- PBT ile diseksiyon çanağı iki kuyu doldurun. Kuyu birine bir polietilen Pasteur pipeti transferi birkaç pupa kullanma.
- Ikinci kuyuya bir defada bir pupa taşıyın. Kanat şeffaf pupa kütikül soyulabilir, mükemmel sıralanmış uçları sivri forseps iki çift Kullanımı: forseps iyi kullanan bir çift altına pupa güvenli ve yavaşça forseps, ikinci çifti kullanılarak kütikül gözyaşı. Bir kez manikür soyulması kanat kapalı, yırtılıyor. Pupa gelen kanat kesmek için dikkatli olun. Kanat bıçaklı kütikül soyulmuştu sonra, kanat menteşe (burada kanat ChOs bulunmaktadır) kütikül soyulması devam ediyor.
- Kanat kütikül soyulmuştu sonra, benzer bir şekilde bacak kütikül soyulmuştu girişiminde bulunabilir.Birçok bacak sürecinde kayıp olması muhtemeldir, ama büyük ölçüde bacak ChOs ve boyama geliştirir yana düşük verim rağmen, bu adımı şiddetle tavsiye edilir. Haltere ve karın ChOs daha kütikül soyulmuştu kalmadan görüntülenebilmekte.
- Metanol ile dolu bir Eppendorf tüp içinde 'soyulmuş' pupa yerleştirin ve oda sıcaklığında tutun. Tüm pupası kütikül soyulmuştu devam edin ve aynı tüp ekleyebilirsiniz. En az 10 güzel soyulmuş pupa Her boyama için toplanmalıdır.
- Metanol kaldırmak ve% 95 etanol ile üç kez, 5 dakika, her biri yıkanır. Sabit pupa -20 ° C'de% 95 Etanol içinde uzun süre için muhafaza edilebilir
3. Larva ve Pupa ve İmmünoboyama
- Oda sıcaklığında PBT üç kere, 30 dakika, her biri ile sabit bir doku yıkanır. Larva dönen bir plaka üzerinde hafif sarsıntı ile yıkanabilir. Pupa sallayarak olmadan yıkanır.
- Engelleme tampon ile (PBT değiştirin PBT +% 5 normal keçi serum) ve 4 ON inkübe ° C
- Engelleme tamponu çıkarın ve 4 ° C'de ON birincil antikorlar (tampon engelleme ile sulandırılmış) ile inkübe
- 3.1 adımda açıklandığı gibi PBT ile dört kez yıkayın.
- 4 ° C'de ON sekonder antikor ile PBT ve inkübe (tampon engelleme ile sulandırılmış) çıkarın
- PBT ile iki kez yıkayın ve bir kez PBS ile 3.1 adım olarak tanımlanmıştır.
- Montaj orta (Dako Floresan Montaj Orta (Dako Cytomation, Glostrup, Danimarka) ve 4 ° C'de inkübe ON PBS değiştirin.
4. Larva montajı
- Larva kendi manikür aşağı bakacak ve vücut duvarı kasları yukarı bakacak şekilde monte medya damlasının bir mikroskop lamı üzerine monte edilir. Temiz bir kapak kayma montaj orta küçük bir damla koyun ve hazırlık kapsayacak şekilde kullanabilirsiniz. Monte larvaları üzerinde herhangi bir baskı uygulamayın.
5.. Pupa montajı
- İki mikroskop slaytlar hazırlayınmontaj orta, diseksiyon için bir ve montaj için ikinci bir damla.
- Slaytların birinde birkaç pupa koyun.
- Kullanımı bahar makas baş ve karın arka kısmını kaldırın.
- Kanatları ve bacakları arasındaki kesim tarafından ventral yarısından itibaren toraks dorsal yarısını ayırın.
- Montaj çözümü bir damla ikinci mikroskop lamı üzerine pupa ve disseke vücut parçaları yerleştirin. Kanatlarını ve bacaklarını uzatmış olduğundan emin olun ve dokuların bindirilirken mümkün olduğunca en aza indirmeye çalışın.
- Bir kapak kayma monte orta bir damla koyun ve örnek üzerine yerleştirin. Monte örnek üzerinde baskı uygulamayın.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Üçüncü dönem larva immüno-lekeli ChOs bir örnek, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bu örnekte sekiz ChOs yedi açıkça görülebilir olduğu bir güzel bir şekilde gerilmiş karın segmenti gösterir. Nöronlar laboratuvarı vardırMAb22C10 (Iowa Üniversitesi'nde Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası elde 1:20,) ile eLED;. kap, ligaman, kap-eki ve bağ eki hücreleri, anti-αTub85E (1:10, Klein ve ark, etiketli 2010). Floresan boyama için İkincil antikor Cy3 veya Cy5-konjuge anti-mouse/rabbit (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories) idi. Örnekleri konfokal mikroskopi (EKK 510, Zeiss) kullanılarak görüntülendi.
Bir 35 saat eski pupa ventral radyal ven azından kanat ChOs bir küme Şekil 2 'de gösterilmiştir.
Şekil 1. Tek bir Ch organı oluşturan altı hücre tipleri (A) şematik gösterimi:. Cap eki (CA), kap (C), scolopale (S), nöron (N), bağ (L) ve ligaman eki (LA ). Beş ChOs kümelenmiş edildiği LCh5 organ, yanal enine kas grubu (LT boyunca gerilir1-4). Lateral longitudinal kas (LL1), ventral boyuna kasların (VL1-4) ve lateral oblik kas (LO1) de gösterilmiştir. Tendon hücreleri kahverengi küreler (Klein, et al., 2010 alınmıştır) olarak gösterilmiştir. (B) Üçüncü dönem larva biri karın segment 10X büyütme ile izlenebilir. Her karın segmentte Mevcut sekiz ChOs yedi belirgindir: birlikte pentascolopidial organ (LCh5), tek bir yanal organ (LCh1) ve iki ventral ChOs (VChB) haline getirilmesini, beş yanal organ. ChOs ve nöronlar (N) nöronal marker MAb 22C10 (kırmızı) ile etiketlenir. Ligaman (L), kap (C) ve eki hücreleri (LA, CA) etiketli anti-αTub-85E (mavi). Kap ve ligament hücreleri ayrıca dei lokus (Nachman ve ark., Yayınlanmamış veri) bir düzenleyici eleman barındıran bir ChO özgü GFP muhabiri ile etiketlenir.
Şekil 2. ve ark., Yayınlanmamış veriler) ile birlikte etiketlenir.
Discussion
Bu video açıklanan protokol larva ve pupa aşamalarında proprioseptif ChOs görselleştirmek için bir yol sağlar. Proprioseptif ChOs yapısı ve gelişimi hakkında şimdiye kadar yapılan çalışmalar özellikle embriyonik aşamalarında ve larva hayali diskler sınırlı olmuştur. Böylece, larva ve ergin hem ChOs gelişimi daha sonraki aşamalarında, birçok açıdan, büyük ölçüde bilinmemektedir. Drosophila ortak genetik araçları ile birlikte açıklanan protokol, yeni genlerin ve ChOs geliştirme sonraki aşamalarında rol oynayan yolları belirlemek ve incelemek için kullanılabilir. Bu protokol Cho görüntülenmesi için optimize edilmiştir, ancak bu tür pupal kanat 6 gibi diğer dokulara, bir boyanması için adapte edilebilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar bize antikorlar göndermek için Iowa Üniversitesi Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, İsrail Bilim Vakfı tarafından sağlanan hibe (No: 29/08) tarafından desteklenmiştir. AS de DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) bir araştırma bursu ile desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 (or #55) forceps, biologie tip | F.S.T. | 11252-20 or 11252-10 (or similar forceps) | |
| Austerlitz stainless steel insect pins, minutiens 0.1mm | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6083-10 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 240.4019862 | |
| Vannas micro scissors (straight, 7.5 cm, blade 3mm) | AS Mdeizintechnik GmbH | 11-590-00 | Vannas Spring Scissors with identical specifications can be purchased from Roboz Surgical Instrument Co. |
| Orbital shaker - Rotamax-120 | Heidolph | N/A | |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Dako | ||
| X10 PBS formulation | The quality of PBS is critical for the success of this protocol | 2 gr/lit KCl, 2 gr/lit KH2PO4, 80 gr/lit NaCl, 21.7 gr/lit Na2HPO4.7H2O |
|
| PBT | X1 PBS + 0.1% Tween 20 |
References
- Brewster, R., Bodmer, R. Origin and specification of type II sensory neurons in Drosophila. Development. 121, 2923-2936 (1995).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16053-16053 (2003).
- Eberl, D. F. Feeling the vibes: chordotonal mechanisms in insect hearing. Curr. Opin. Neurobiol. 9, 389-393 (1999).
- Eberl, D. F., Boekhoff-Falk, G. Development of Johnston's organ in Drosophila. Int. J. Dev. Biol. 51, 679-687 (2007).
- Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila. J. Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).
- Egoz-Matia, N., Nachman, A., Halachmi, N., Toder, M., Klein, Y., Salzberg, A. Spatial regulation of cell adhesion in the Drosophila wing is mediated by Delilah, a potent activator of βPS integrin expression. Dev Biol. 351, 99-109 (2011).
- Field, L. H., Matheson, T. Chordotonal organs of insects. Advances in Insect Physiology. 27, 1-228 (1998).
- Gong, Z., Son, W., Chung, Y. D., Kim, J., Shin, D. W., McClung, C. A., Lee, Y., Lee, H. W., Chang, D. J., Kaang, B. K. Two interdependent TRPV channel subunits, inactive and Nanchung, mediate hearing in Drosophila. J. Neurosci. 24, 9059-9066 (2004).
- Inbal, A., Volk, T., Salzberg, A. Recruitment of ectodermal attachment cells via an EGFR-dependent mechanism during the organogenesis of Drosophila proprioceptors. Dev. Cell. 7, 241-250 (2004).
- Jarman, A. P., Grau, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. atonal is a proneural gene that directs chordotonal organ formation in the Drosophila peripheral nervous system. Cell. 73, 1307-1321 (1993).
- Jarman, A. P., Sun, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Role of the proneural gene, atonal, in formation of Drosophila chordotonal organs and photoreceptors. Development. 121, 2019-2030 (1995).
- Kim, J., Chung, Y. D., Park, D. Y., Choi, S., Shin, D. W., Soh, H., Lee, H. W., Son, W., Yim, J., Park, C. S. A TRPV family ion channel required for hearing in Drosophila. Nature. 424, 81-84 (2003).
- Klein, Y., Halachmi, N., Egoz-Matia, N., Toder, M., Salzberg, A. The proprioceptive and contractile systems in Drosophila are both patterned by the EGR family transcription factor Stripe. Dev. Biol. 337, 458-470 (2010).
- Matthews, K. A., Miller, D. F., Kaufman, T. C. Functional implications of the unusual spatial distribution of a minor alpha-tubulin isotype in Drosophila: a common thread among chordotonal ligaments, developing muscle, and testis cyst cells. Dev. Biol. 137, 171-183 (1990).
- Okabe, M., Okano, H. Two-step induction of chordotonal organ precursors in Drosophila embryogenesis. Development. 124, 1045-1053 (1997).
- Rusten, T. E., Cantera, R., Urban, J., Technau, G., Kafatos, F. C., Barrio, R. Spalt modifies EGFR-mediated induction of chordotonal precursors in the embryonic PNS of Drosophila promoting the development of oenocytes. Development. 128, 711-722 (2001).
- Todi, S. V., Sharma, Y., Eberl, D. F. Anatomical and molecular design of the Drosophila antenna as a flagellar auditory organ. Microsc. Res. Tech. 63, 388-399 (2004).
- zur Lage, P., Jarman, A. P. Antagonism of EGFR and notch signalling in the reiterative recruitment of Drosophila adult chordotonal sense organ precursors. Development. 126, 3149-3159 (1999).
