Summary
Multifoton microscopie van hele muis organen is mogelijk door de clearing optisch orgaan voor beeldvorming, maar niet alle protocollen behouden het fluorescerende signaal van fluorescerende eiwitten. Met behulp van een optische clearing methode met ethanol op basis van uitdroging en benzylalcohol: benzylbenzoaat clearing, tonen we een hoge resolutie multifoton beelden van de hele hersenen van muizen uiten YFP.
Abstract
Multifoton microscopie van intrinsieke fluorescentie en tweede harmonische generatie (SHG) volle muis organen wordt mogelijk gemaakt door de clearing optisch orgaan voor imaging. 1,2 Voor organen die fluorescerende eiwitten zoals GFP en YFP bevatten, optische clearing protocollen die gebruikt methanol uitdroging en duidelijk met behulp van benzylalcohol: benzylbenzoaat (BABB) terwijl onbeschermd tegen het licht 3 niet het behoud van de fluorescerende signaal. Het protocol hier gepresenteerde is een nieuwe manier om gehele orgel optische clearing op de hersenen van muizen uit te voeren met behoud van de fluorescentie signaal van YFP uitgedrukt in neuronen. Wijziging van de optische clearing protocol zodanig dat het orgaan is met een gedehydrateerde ethanol graded serie is gevonden om de schade aan de fluorescerende eiwitten te verminderen en hun fluorescent signaal multifoton imaging behouden. 4 gebruik van een geoptimaliseerde methode van optische clearing met ethanol gebaseerde uitdroging en clearing door BABBterwijl het licht afgeschermde tonen wij hoge resolutie multifoton beelden van geel fluorescent eiwit (YFP) expressie in de neuronen van de hersenen van muizen meer dan 2 mm onder het weefseloppervlak.
Protocol
1. Animal Perfusie 5 en Whole Brain Mouse Clearing
- De volledige lengte van de procedure is afhankelijk van de tijd gebruikt per dehydratatiestap, maar in totaal het gehele proces kan worden uitgevoerd in twee dagen.
- Weeg YFP muizen en diep verdoven met een intraperitoneale injectie van ketamine / xylazine (100 mg / kg: 10 mg / kg).
- Bevestig een chirurgische vlak van anesthesie diepe alvorens over te gaan tot een operatie. Controleer het dier om de 5 minuten om te zien of het reageert op een stevige teen of staart knijpen. Als het dier reageert, wordt een aanvullende dosis (1/3 van de oorspronkelijke dosis) van ketamine / xylazine vereist.
- Eenmaal diep verdoofd, beperken de muis door vast te houden elk ledemaat aan een chirurgische bed met behulp van lab tape, zodat de muis zich in een liggende positie (dorsale recumbancy), het blootstellen van de borst voor een operatie. De chirurgische bed bestaat meestal uit een metalen of plastic gaas en in een gootsteen of op een lipped-pan zodat bloed en fixeermiddelafval kan worden ontvangen.
- Om te beginnen, maken een incisie onder de xyphoid proces. Snijd langs de voet van de ribbenkast met een schaar en pincet en trek de huid als de snede wordt gemaakt. Dan in twee fasen ter weerszijden van de muis sternum (door de ribben) om een flap van weefsel dat verwijderd gehouden van de borstholte met een hemostaat verlaten het hart bloot te maken.
- Plaats een 23 g naald in de linker ventrikel van het hart en een kleine insnijding in de spierwand van de rechter atrium om bloed te ontsnappen. Zie hiervoor artikel 2497 Jove voor een video van deze procedure. 5
- Onmiddellijk na het atrium wordt gesneden, begint een perfusie met 4 ° C fosfaat gebufferde zoutoplossing, PBS (pH 7,2) tot het bloed niet meer waargenomen drainage van het rechter atrium van het hart (30 - 40 ml met een snelheid van ongeveer 5 ml / min).
- Nadat al het bloed afgetapt (fluïdum dat het rechteratrium blijkt), schakelt de perfusie medium naar een gekoelde 4%PFA oplossing. Perfuseren totdat de muis lichaam merkbaar stijf en koud aanvoelt (ca. 30 - 40 ml met een snelheid van ongeveer 5 ml / min). (Geconcentreerde 16% PFA oplossing wordt verdund volgens de instructies van de fabrikant en NaOH wordt toegevoegd tot pH 7,2 is bereikt. Draag handschoenen en een laboratoriumjas en en meng hanteren chemicaliën in een zuurkast.)
- Na perfusie, verwijdert u de muis van de chirurgische bed en onthoofden de excisie van de hersenen beginnen.
- Behulp van een tang en iris schaar, verwijdert de schedel in kleine secties vanaf de achterkant van de schedel en vooruit. Maak kleine inkepingen om de 2 - 4 mm met de schaar de overkant van de schedel tijdens het gebruik van de tang voorzichtig weg te trekken van het bot van de hersenen in kleine secties. Doe dit totdat het gehele bovenste oppervlak van de hersenen wordt blootgesteld.
- Accijnzen de hersenen uit de schedel met een 5 mm brede, platte spatel en breng het in een glazen flacon. Dompelen in 4% PFA gedurende 6 uur bij 4 ° C voor fixatie plaats.
- Na berichtfixatie, twee keer wassen in de hersenen van de kamertemperatuur PBS door het gieten van de PFA van de glazen flacon en te vervangen door PBS. Swirl de hersenen in PBS-oplossing voor het storten van en het vervangen met PBS voor een tweede wasbeurt.
- Drogen de hersenen bij kamertemperatuur door een gegradeerde serie incubaties ethanol (eenmaal in 50%, 70%, 95%, en tweemaal in 100%) bij 2 uur per incubatie en 12 uur voor de tweede incubatie 100% ethanol, aan pak het water van de vaste weefsel. Voor elke incubatie, giet de vorige ethanol oplossing uit de glazen flacon en vervang deze door de volgende oplossing tot de hersenen volledig ondergedompeld zijn.
- Na de tweede incubatie in 100% ethanol, giet de oplossing en vervangen door gelijke delen ethanol en clearing oplossing die benzylalcohol en benzylbenzoaat (1:2 vol: vol ratio). Na 2 uur incubatie, giet deze oplossing vervangen door een oplossing van 100% benzylalcohol en benzylbenzoaat (1:2 vol: vol ratio). De REFRActive index van de clearing oplossing is n = 1,54.
- Eenmaal in BABB, de hersenen merkbaar transparante, binnen 4 - 5 uur. Voor de beste clearing resultaten, laat de hersenen gedurende 6 dagen duidelijk bij kamertemperatuur, terwijl afgeschermd van fel licht.
2. Microscoop Setup
- Zodra de hersenen verwijderd en klaar voor beeldvorming, plak het op de bodem van een petrischaal met cyanoacrylaat. Laat de lijm drogen alvorens verder te gaan.
- Na het drogen, dompel de hersenen in Babb en plaats de petrischaal onder de microscoop doelstelling voor beeldvorming.
- We gebruiken een multifoton microscoop die een Mai Tai titanium saffier-laser instelbaar is tussen een 710 nm tot 990 nm excitatie golflengte bevat. De excitatiegolflengte we gebruiken YFP te genereren is 886 nm. Laservermogen varieert van 30 - 100 mW, afhankelijk van beeldvorming diepte.
- Leg het gereflecteerde fluorescerende signaal met een Nikon 5x doelstelling (NA, 0,5) die het mogelijk maakt voor grotebeeldveld beeldvorming (2 x 2 mm).
- Filter de gereflecteerde fluorescentiesignaal met een 535/50 banddoorlaatfilter en afhalen met een GaAsP PMT (H7422PA-40, Hamamatsu, Bridgewater, New Jersey).
- Proces beelden met behulp van scanimage software 6 met een resolutie van 2048 x 2048 pixels met een scansnelheid van 2 ms per lijn met een hoge resolutie, YFP beelden te genereren.
- Zodra beeldvorming is voltooid, verwijdert u de hersenen van de petrischaal behulp van een tang en op te slaan in Babb afgeschermd van licht voor de toekomst beeldvorming. Voor gelijmde monsters, het weefsel verwijderen door met een scheermesje tussen de lijm en de petrischaal onder een hoek niet groter dan 30 graden. We hebben opgeslagen monsters in BABB tot 1 jaar zonder zichtbare aantasting.
3. Representatieve resultaten
De vertegenwoordiger afbeeldingen en video's hier tonen de hoge-resolutie multifoton imaging mogelijkheid wordt mogelijk gemaakt door optische clearing. Hele beeldvorming van de hersenen mogelijk maaktvoor YFP-gelabelde neuronen in de verschillende lagen van de hippocampus en cortex duidelijk zichtbaar zo diep 2 mm onder het weefseloppervlak. Figuur 1 geeft een voorbeeld van een coronale overeenkomend aanzicht de anatomische kenmerken van de hippocampus bij 2,92 mm caudaal tot bregma 7. De diepte van beeldvorming in de steekproef was 1,94 mm. Sommige van dit verschil door verwijdering van het cerebellum aan het caudale einde van de hersenen en de balans was krimp van het droogproces. Een beeld van de stapel toont laag V / VI piramidale neuronen van de neocortex expressie YFP 2 mm onder het weefsel (figuur 2). Alle beelden werden verkregen met behulp van de Nikon 5x doelstelling en vergroting werd gedaan met behulp van de digitale zoomfunctie voor het imago van overname in scanimage software.
Door in te zoomen op de neocortex, de individuele axonen en neuron cellichamen van piramidale neuronen in laag V van de neocortex zijn duidelijkly onderscheiden tot 1,02 mm onder het weefsel (figuur 3). Met het beeld stapel uit figuur 3 is een 3D-reconstructie van het neuron regio gemaakt met ImageJ software 8 (fig. 4).
De hoge resolutie capaciteit van MPM laat ons ook presenteren beelden van hele, individuele neuronen. Hier laten we een reconstructie van een Layer V piramidale neuron van de neocortex waarin afzonderlijke dendritische processen duidelijk zichtbaar (Figuur 5).
Figuur 1 Representatieve beeld van een 1,2 mm beeld stack (0,8 - 2 mm onder het weefseloppervlak). Volle muizenhersenen met neocortex en de verschillende lagen van de hippocampus. Kenmerken van de hippocampus zichtbaar 1,1 mm onder het weefseloppervlak en zijn gelabeld met de volgendelende code:. DG = dentate gyrus, GrDG = granulaire laag van DG, Lmol = lacunosum moleculare laag, Mol = moleculaire laag DG, Of = Oriens laag, PoDG = polymorf laag DG, Py = piramidale cellaag, Rad = stratum radiatum 7 bestand is 1,8 x 1,8 mm groot, schaal bar = 200 urn. De rostrale einde van de hersenen werd aangebracht op een petrischaal met het caudale uiteinde naar boven naar het doel. Dit vergemakkelijkte beeldvorming in het frontale vlak.
Figuur 2 Representatieve frame van de 1,2 mm beeld stack (0,8 - 2 mm onder het weefsel oppervlak). Van de hele hersenen van muizen wijzen op de neocortex. Piramidecellen en processen expressie YFP in laag V / VI van cortex zichtbaar 2 mm onder het weefseloppervlak. De mate van etikettering is in overeenstemming met eerdere rapporten van de schaarse etikettering in de neocortex. 9 Inzet (rechts) wordt vergroot van b oxed, op de linkeroever. Bestand is 1,8 x 1,8 mm groot, schaal bar = 200 urn (50 urn inzet).
Figuur 3. Representatieve lijst taken 774 urn onder het weefseloppervlak van het beeld stapel laag V piramidale neuronen in de neocortex van de hersenen. Stack gaat van 700 pm tot 1020 pm onder het weefseloppervlak. Een 8x digitale zoom is gebruikt om details zoals fijne processen vast te leggen. Het beeld is 225 x 225 um in grootte, schaal bar = 20 urn.
Figuur 4. Representatief beeld van 3D reconstructie (225 x 225 x 320 urn) van het beeld stack in figuur 3. Het beeld is 225 x 225 um in grootte, schaal bar = 28 micrometer.
Figuur 5. Hoge resolutie gereconstrueerd beeld van een laag V piramidale neuron van de neocortex met een 10x digitale zoom. Neuron meet 485 micrometer in lengte, schaal bar = 25 pm. Het gezichtsveld voor elk beeld tegel is 180 micrometer x 180 micrometer. Elke tegel is op een andere diepte (z-niveau). De corticale apicale dendrieten niet, in het algemeen, express YFP evenals de soma. Om beide in hetzelfde gezichtsveld, zoals hier getoond, de macht werd verlaagd tot verzadiging van soma te minimaliseren, dit maakt de fijne proces blik dimmer. Onze nadruk ligt hier was op het aantonen van field-of-view in plaats van fijne details. Om fijnere details onthullen, gebruik maken van een digitale zoom, focus op een regio zonder soma, en verhoging van het laservermogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Terwijl de standaard organische kleurstoffen zijn compatibel met een groot aantal organische oplosmiddelen, en dus ook een bijzondere uitdaging geen gevaar voor het opruimen van protocollen, fluorescente eiwitten zijn vaak minder tolerant ten opzichte van veranderingen in oplosmiddel. 4 Het doel van dit werk was om een ernstige beperking van de te overwinnen vorige optische clearing protocollen waar fluorescentie van XFPs verloren is gegaan of zeer veel hinder. De beelden die hier worden gepresenteerd laten zien dat de fluorescentie van YFP bewaard is gebleven. De optische schraaptechniek beschreven maakt hoge-resolutie afbeelding van YFP-gelabelde neuronen geheel muizenhersenen tot 2 mm onder het weefseloppervlak. Met ethanol uitdroging, zoals eerder aangetoond, zal behouden groene en rode fluorescente eiwit signalen. 4 De hier getoonde afbeeldingen tonen hoe deze optische clearing techniek kan worden toegepast op gebieden geheel orgaan, zoals de hippocampus of neocortex dat express fluorescerende eiwitten te bestuderen. De hogeResolutie vermogen van multifoton microscopie maakt het ook mogelijk voor een duidelijke vergroting van specifieke cellen of gebieden van belang in het orgel regio. De belangrijkste punten voor het behoud eiwit fluorescentie te over-fixatie voorkomen, te zorgen dat het fixeermiddel en alle oplossingen worden gehandhaafd op nagenoeg neutrale pH, met ethanol in plaats van methanol gebruikt voor uitdroging en de monsters slaan in het donker.
Hoewel we hier demonstreren het gebruik van optische clearing voor beeldvorming van muizenhersenen de techniek is algemeen toepasbaar op de meeste organen. In deze studie toonden we beelden met hoge resolutie van hele muizenhersenen regio's (neocortex en de hippocampus) en specifieke neuronen in laag V van de neocortex (De Thy1-YFPH muis lijn labels piramidale cellen in de hippocampus en dun in de neocortex, 9 andere regio's ziet er donker uit.). Met behulp van de afbeelding stapel Layer V piramidale neuronen, werd een 3D gereconstrueerde volume van de neuronen gemaakt. Het gemak which deze beelden werden diep gevangen in de hersenen van muizen met hoge-resolutie na optische clearing maakt dit een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van neuroanatomie. Er werd echter tijdens het grijze stof wist zeer goed, beeldvorming diepte in de hersenen uiteindelijk beperkt door onvolledige clearing van dichte witte stof traktaten nabij het centrum van de hersenen. Dit is niet een probleem in andere organen.
Een nadeel van BABB voor clearing is dat het niet compatibel is met conventionele dompelen doelstellingen. De hoge brekingsindex van het oplosmiddel dat clearing resultaten kan in optische aberraties, en het oplosmiddel kan oplossen de lijm die de lenzen in het doel heeft. Daarom gebruikt een macro-objectief, de Nikon AZ PlanFluor 5X 0.5NA WD 15 mm, dat een ~ 2-mm field-of-view met een laterale resolutie van ~ 400 nm (1 / e straal) en axiale resolutie van ~ 4,9 combineert urn (1 / e radius). De lens heeft een correctie kraag te compenseren voor sferische aberraties. Echter, deze lensheeft een 22-mm back opening en kan daarom niet gemakkelijk worden aangepast aan standaard commerciële systemen. Een machine kan een aangepaste thread adapter, zodat de montage van de lens op een standaard microscoop, maar zorg moet worden gezorgd dat de excitatiebundel profiel achter opening vult zoveel mogelijk maximaal gebruik maken van de beschikbare numerieke apertuur. Hoewel deze lens kon door een relatief grote diepte (~ 2 mm) concentreren zonder onderdompeling in de BABB oplossing is, is de 0,5 NA geen adequate oplossing voor beeldvorming dendritische uitsteeksels. Een lens met een hogere NA van ten minste 0,6 en ~ 40x vergroting in staat is om het oplossen van dendritische spines. Er moet echter voldoende werkafstand om onderdompeling te vermijden in de BABB oplossing. Handhaven deze afstand zal waarschijnlijk beperkt de diepte van de z-stack beeld tot ver beneden de 2 mm diepte beschikbaar via clearing.
Opgemerkt dat fixatie en clearing het signaal van eind verhogenogenous bronnen van fluorescentie. Dit wordt best vermeden door te kiezen voor langere golflengte excitatie (> 800 nm) en zorgvuldige selectie van emissiefilters goed overeenkomen met de fluorescentie spectrum van de indicator kleurstof.
Onlangs is een nieuw ureum-base klaringsmiddel genoemd SCALE is aangetoond dat het signaal van fluorescerende eiwitten 10 bewaren, het duurt 2 weken - 6 maanden tot duidelijk een monster, in vergelijking met enkele uren BABB. SCALE laat ook het weefsel zeer fragiel, met grote hoeveelheden weefsel expansie, en het gebruik van ureum, die veel eiwitten denatureert, zal waarschijnlijk problematisch zijn voor de follow-up studies met behulp van immunohistochemie. Daarentegen is hoewel clearing proces kan resulteren in een uniform weefsel krimp (~ 20%), clearing met BABB aangetoond verenigbaar met standaard histologische processing 1,2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door Institutional Animal Care Yale University's & Use Committee in te stellen.
Acknowledgments
We willen Jacob Solis bedanken voor zijn hulp bij videobewerking.
Dit werk werd deels gefinancierd door een NSF Career Award DBI-0953902 aan MJ Levene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Inc. | D8537 | 500 ml, pH 7.2 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde |
| Ethyl alcohol | American Bioanalytical | AB00515-00500 | 500 ml, 200 proof |
| Ethyl alcohol | Pharmco Products, Inc. | 111000190 | 1 gal., 190 proof |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich, Inc. | 402834 | 500 ml, 99+% |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich, Inc. | B6630-IL | 500 ml, ≥ 99% |
| 5X/0.5 NA objective | Nikon | AZ Plan Flour 5X | 15 WD |
References
- Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. Multiphoton microscopy of cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).
- Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).
- Zucker, R. M. Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis. Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).
- Sakhalkar, H. S. Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing. Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).
- Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 2, (2003).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 2nd Ed, Elsevier Science. San Diego, CA, USA. (2001).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Hama, H. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).
