Summary
전체 마우스 기관의 Multiphoton 현미경은 광학 이미징 전에 장기를 삭제하면 가능하지만, 모든 프로토콜은 형광 단백질의 형광 신호를 보존 할 수 있습니다. 에탄올 기반의 탈수 및 벤질 알코올 광학 개간 방법 사용 : 벤질 벤조산의 개간을, 우리는 전체 마우스 두뇌가 YFP을 표현의 고해상도 multiphoton 이미지를 보여줍니다.
Abstract
전체 마우스 기관의 고유 형광와 두 번째 고조파 세대 (SHG)의 Multiphoton 현미경은 광학 이미징 전에 장기를 삭제하여 가능하게됩니다. 1,2 그러나, GFP 및 YFP 등의 형광 단백질을 포함 기관, 메탄올을 사용하는 광학 소요되는 프로토콜 벤질 알코올 사용 탈수와 투명 : 빛 3에서 보호하면서 벤질 벤조산 (BABB)는 형광 신호를 보존하지 않습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 뉴런으로 표현 YFP의 형광 신호를 유지하면서 마우스 뇌에 전체 기관이 광학 개간을 수행 할 수있는 새로운 방법입니다. 기관은 형광 단백질에 손상을 줄이고 multiphoton 이미징 대한 형광 신호를 보존하는 것으로 확인되었습니다 에탄올 등급 시리즈를 사용하여 건조하다고 등의 광학 소요되는 프로토콜을 변경. 4 에탄올 기반의 탈수와 광학 소요의 최적화 방법을 사용하고 BABB에 의해 삭제빛으로부터 차폐하는 동안, 우리는 조직의 표면 아래 2mm 이상 마우스 뇌의 뉴런에 노란색 형광 단백질 (YFP) 표현의 고해상도 multiphoton 이미지를 보여줍니다.
Protocol
1. 동물 재관류 5 전체 마우스 뇌 정산
- 프로 시저의 전체 길이는 탈수 단계 당 사용 시간의 길이에 따라 달라질 수 있지만, 총 전체 과정은 두 개의 일 실시 할 수 있습니다.
- YFP 마우스 무게 그리고 깊이 케타민 / xylazine (100 밀리그램 / kg : 10 밀리그램 / kg)의 intraperitoneal 주사로 마취.
- 수술하기 전에 깊은 마취의 수술 비행기를 확인합니다. 동물에게이 회사의 발가락이나 꼬리 핀치에 반응하는지 확인하기 위해 매 5 분을 확인합니다. 동물이 반응하면 케타민 / xylazine의 보충 복용 (원본 용량의 1 / 3)가 필요합니다.
- 일단 깊이 anesthetized, 마우스가 수술의 가슴 노출, 위로 향한 위치 (등쪽 recumbancy)에 있도록 실험실 테이프를 사용하여 수술 침대에 각 다리를 준수하여 마우스를 억제. 수술 침대는 보통 금속이나 플라스틱 메쉬 만든 및 세면대로 또는 입술 - 팬의 상단에 배치됩니다 있도록 혈액 및 정착액폐기물은 쉽게 수집 할 수 있습니다.
- 시작하려면 xyphoid 과정 아래 절개를합니다. 가위와 핀셋을 사용하여 갈비의 기본을 따라 잘라 컷이 완료로 피부를 뒤로 빼는거야. 마우스 가슴의 양쪽 두명 인하 (갈비까지) 심장이 노출 떠날 hemostat를 사용하여 흉강에서 떨어져 개최되는 조직의 플랩을 만들 할 수 있습니다.
- 심장의 왼쪽 심실에 23g 바늘을 삽입하고 혈액이 탈출 할 수 있도록 오른쪽 심방의 근육 벽의 작은 절개를합니다. 이 절차의 동영상 기사 2497을 주피터를 참조하십시오 5.
- 오른쪽 심방이 절단 후 즉시, 4 재관류를 시작 ° C 피가 더 이상 심장의 우심방 (30에서 에너지가 관찰되지 때까지 인산염은 PBS (산도 7.2) 생리 버퍼 - 약 5의 비율로 40 ML ML / 분).
- 일단 모든 혈액 (오른쪽 아트리움을 종료 유체가 분명하다) 배수되었습니다 차가운 4 % 재관류 매체를 전환PFA 솔루션입니다. 마우스의 몸 터치 (- 5 ML / 분의 속도로 40 ML 약 30)에 띄게 강성과 차가운 될 때까지 Perfuse. (농축 16% PFA 솔루션은 제조업체의 지침 및 산도 7.2에 도달 할 때까지 NaOH를 추가에 따라 희석된다. 장갑과 실험실 코트를 입고 연기 후드 내부의 화학 물질을 처리하고 섞는다.)
- 재관류 후 수술 침대에서 마우스를 제거하고 뇌의 절단을 시작하는 목을 베다.
- 포셉 및 홍채 가위 사용하여 두개골의 뒷면에서 시작하여 앞으로 이동 작은 섹션에 두개골을 제거합니다. 조심스럽게 작은 부분에 뇌에서 떨어져 뼈를 뽑아 포셉를 사용하는 동안 머리에서 가위로 4mm - 작은 상처 매 2을 만듭니다. 뇌의 전체 상단 표면이 노출 될 때까지이 작업을 수행합니다.
- 소비세 유리관에 5 폭 mm, 평면 주걱과 장소를 사용하여 두개골에서 뇌. 포스트 고정 4 6 시간에 4% PFA ° C에서 잠수.
- 게시 한 후고정, 유리 약병의 PFA를 주입하고 PBS로 교체하여 방 온도 PBS에 두 번 뇌를 씻어. 쏟아 및 제 세척을 위해 PBS로 교체하기 전에 PBS 솔루션의 소용돌이 뇌합니다.
- 등급 부화 당 2 시간의 에탄올 incubations의 시리즈 (한 번에 50 %, 70 %, 95 %, 그리고 두 번이나 100 %), 후 두 번째 100 % 에탄올 보육 12 시간으로 실온에서 뇌를 탈수,에 고정 조직에서 물을 압축을 풉니 다. 각 부화를 들어, 유리관에서 이전 에탄올 솔루션을 쏟아과 뇌가 완전히 침수 될 때까지 이후의 솔루션으로 대체.
- 100 % 에탄올에서 두 번째로 부화 후 솔루션을 쏟아과 같은 부품 에탄올과 벤질 알코올 및 벤질 벤조산을 (1시 2분 권 : 권 비율)이 포함 된 개간 솔루션으로 교체하십시오. 부화, 가만히 따르다이 솔루션의 2 시간 후와 벤질 알코올 및 벤질 벤조산 (1시 2분 권 : 권 비율)의 100 % 솔루션으로 교체하십시오. refra개간 솔루션의 ctive 인덱스는 N = 1.54입니다.
- 일단 BABB에, 뇌는 4 안에 현저하게 투명한 될 것입니다 - 5 시간. 가장 소요되는 결과를 얻으려면 밝은 빛으로부터 차폐하는 동안 뇌는 실온에서 6 일간을 취소 둡니다.
2. 현미경 설정
- 뇌 이미징을 허가 준비되면, 페트리 접시의 바닥에 부착은 시아 노 아세틸렌 사용합니다. 접착제 계속하기 전에 건조하도록 허용합니다.
- 건조 후, 잠수함 BABB의 뇌를 및 이미징을위한 현미경 대물 아래의 페트리 접시를 놓습니다.
- 우리는 990 나노 미터 여기 파장에 대한 710 nm의 사이에 조절 마이 타이 티타늄 사파이어 레이저를 통합 multiphoton 현미경을 사용합니다. 우리가 YFP 신호를 생성 할 때 사용하는 여기 파장은 886 nm의 것입니다. 레이저 전력은 30 일부터 다릅니다 - 100 MW는 영상의 깊이에 따라 다릅니다.
- 대형을 허용 니콘 5 배 목표 (NA, 0.5)를 사용하여 반사 형광 신호를 캡처뷰 필드 영상 (2 X 2mm).
- 50분의 535 대역 통과 필터를 사용하여 반사 형광 신호를 필터링하고 GaAsP PMT (H7422PA-40, 하마 마츠, 브리지 워터, 뉴저지)를 사용하여 수집합니다.
- 높은 해상도, YFP 이미지를 생성하는 2 밀리 초 당 라인의 스캔 속도를 사용하여 2048 X 2048 픽셀의 해상도로 ScanImage 소프트웨어 6을 사용하여 프로세스 이미지를 표시합니다.
- 일단 이미지가 완료되면 미래의 이미징을위한 빛으로부터 차폐 포셉 및 BABB에 저장을 사용하여 페트리 접시에서 뇌를 제거합니다. 접착 샘플의 경우, 30도보다 더 큰 각도로 접착제와 페트리 접시 사이에 면도날을 실행하여 조직을 제거합니다. 우리는 눈에 띄는 저하와 함께 1 년에 BABB에서 샘플을 저장합니다.
3. 대표 결과
여기에 표시 대표 이미지 및 동영상은 광학 삭제하여 가능하게 고해상도 multiphoton 이미징 기능을 보여줍니다. 전체 뇌 영상이 있습니다YFP - 표시 해마와 피질의 다른 레이어의 뉴런이 조직 표면 아래 2mm로 깊이로 명확하게 볼 수 있습니다. 그림 1의 해마의 해부학 적 기능에 해당하는 코로나보기의 대표 이미지 꼬리 2.92 mm에서 보여줍니다 bregma 7. 예제에서 이미지의 깊이가 1.94 mm이었다. 이 차이의 일부는 뇌의 꼬리 끝에있는 소뇌의 제거로 인해이고 잔액은 탈수 과정에서 수축으로 인해했다. 스택에서 다른 이미지는 조직 표면 (그림 2) 아래에 YFP 2mm을 표현 네크로의 레이어 V / VI 피라미드 뉴런을 보여줍니다. 모든 이미지는 니콘 5 배 객관적이고 배율이 ScanImage 소프트웨어에서 이미지 수집을 위해 디지털 줌 기능을 사용하여 이루어졌다 이용하여 획득 하였다.
네크로의 확대함으로써, 네크로의 레이어 V의 피라미드 뉴런의 개별 axons과 신경 세포 기관은 명확하다지적인 조직의 표면 아래에 1.02 mm (그림 3)까지 구별. 그림 3에서 이미지 스택을 사용하여 뉴런 지역의 3D 복원이 ImageJ 소프트웨어 8 (그림 4)를 사용하여 만들어졌습니다.
MPM의 고해상도 기능은 우리 전체, 개별 뉴런의 이미지를 제공 할 수 있습니다. 여기 개별 수지상 프로세스가 명확하게 볼 수 있습니다하는 네크로 (그림 5)의 레이어 V 피라미드의 신경 세포의 재건을 보여줍니다.
그림 1 1.2 mm 이미지 스택에서 대표 이미지 (0.8 - 조직의 표면 아래 2mm). 네크로와 해마의 다른 층을 보여주는 전체 마우스 뇌의. 해마의 특징은 조직의 표면 아래에 1.1 mm 볼 수 있으며 후속를 사용하여 라벨이되었습니다ING 번호 :. DG = 이가있는 이랑, DG의 = 세분화 된 계층을 GrDG, Lmol = lacunosum moleculare 층, 몰 = 분자 층 DG, 또는 = oriens 층, PoDG = polymorph 층 DG, 평 = 피라미드 세포 층, RAD = 지층 radiatum 7 이미지가 1.8 X 1.8 mm의 크기, 규모 바 = 200 μm이다. 뇌의 뱃 부리 장식이있는 끝은 목표를 향해까지 직면하고있는 꼬리 끝 페트리 접시에 부착되었다. 이 코로나 비행기에 이미지를 촉진.
그림 2 1.2 mm 이미지 스택에서 대표 프레임 (0.8 - 조직의 표면 아래 2mm). 네크로을 강조 전체 마우스 뇌의. 피질의 레이어 V / VI에 YFP을 표현 피라미드 세포와 프로세스는 조직의 표면 아래에 보이는 2mm 있습니다. 라벨의 정도는 네크로의 희박한 라벨의 이전 보고서와 일치한다. 삽입 9 (오른쪽) B에서 확대됩니다 왼쪽에 oxed 공간이 마련되어 있습니다. 이미지 크기가 1.8 X 1.8 mm이며, 규모의 바 = 200 μm (50 μm 삽입).
그림 3. 대표 프레임 뇌의 네크로의 레이어 V 피라미드 뉴런의 이미지 스택에서 조직의 표면 아래에 774 μm를 취. 스택 700 μm에서 조직의 표면 아래 1,020 μm로 이동합니다. 8X 디지털 줌은 이러한 고급 프로세스와 같은 세부 정보를 캡처하는 데 사용되었다. 이미지의 크기는 225 x 225 크기 μm, 스케일 바 = 20 μm이다.
그림 4. 그림 3에서 이미지 스택의 3D 재건의 대표 이미지 (225 x 225 크기 X 320 μm). 이미지의 크기는 225 x 225 크기 μm, 스케일 바 = 28 μm이다.
그림 5. 10X 디지털 줌을 사용하여 네크로의 레이어 V 피라미드의 신경 세포의 고해상도 복원 이미지입니다. 뉴런의 길이, 스케일 바 = 25 μm에서 485 μm를 측정합니다. 각 이미지 타일에 대한 시야는 180 μm X 180 μm이다. 각 타일은 서로 다른 깊이 (Z-레벨)에 있습니다. 대뇌 피질의 꼭대기 수석이 일반적으로 명시 적 YFP뿐만 아니라 소마에서하지 않습니다. 여기에 도시 된 바와 같이, 전원이 소마의 채도를 최소화하기 위해었다,보기 같은 분야에서 모두가한다이 미세 공정 모양의 주차를합니다. 여기에 우리의 강조보다는 세부 사항보다 뷰 필드를 시연 있었다. 미세한 세부 정보를 공개하려면, 소마없이 지역에 초점을, 디지털 줌을 사용하고, 레이저 파워를 향상시킬 수 있습니다.
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Discussion
표준 유기 염료는 유기 용제의 범위와 호환되는, 따라서 프로토콜을 삭제하기위한 특정 과제를 포즈를하지 않는 반면, 형광 단백질은 용매에 자주 변화를 덜 관대합니다. 현재 작업의 4 목표는의 심각한 한계를 극복하는 것이 었습니다 XFPs의 형광이 분실 또는 심각하게 저하 된 이전 광학 소요되는 프로토콜. 여기에 표시되는 이미지가 YFP의 형광을 보존되었다고 보여줍니다. 여기에 설명 된 광학 소요되는 기술은 조직의 표면 아래 2mm로 전체 마우스 뇌 YFP - 분류 뉴런까지의 고해상도 이미징 할 수 있습니다. 이전에 보여준 것처럼, 에탄올 탈수를 사용하여도 녹색과 빨간색 형광 단백질 신호를 유지합니다. 여기에 광학 소요되는 기술은 이러한 해마 나 네크로 그 표현 형광 단백질로 전체 기관이 지역을 공부하고 적용 할 수있는 방법을 보여줍니다를 보여 4 이미지. 고multiphoton 현미경의 해상도 기능도 장기 지역 내 관심의 특정 셀 또는 지역의 맑은 확대 할 수 있습니다. 단백질 형광을 유지하기위한 핵심 포인트는 탈수에 대한 에탄올보다는 메탄올을 사용하려면, 정착액 및 모든 솔루션은 가까운 중성 산도에에서 유지되는 돌봐 줄, 오버 고정을 방지하고, 어둠 속에서 샘플을 저장하는 것입니다.
우리가 마우스 뇌의 이미징을위한 광학 개간의 사용을 보여줍니다 만,이 기술은 일반적으로 대부분의 장기에 적용됩니다. 이 연구에서 우리는 고해상도의 전체 마우스 뇌 영역의 이미지 (네크로와 해마)와 네크로의 레이어 V (해마와 띄엄 띄엄 네크로의 Thy1-YFPH 마우스 라인 라벨 피라미드 세포를, 9 다른 지역 내의 특정 뉴런을 보여 주었다 어두운 나타납니다.). 레이어 V 피라미드의 뉴런의 이미지 스택을 사용하여 뉴런의 3D 복원 볼륨이 생성되었습니다. whic있는 용이성광학 개간이 neuroanatomy을 공부위한 강력한 도구합니다 후 H는 이러한 이미지는 높은 해상도로 마우스의 뇌에서 깊은 촬영했다. 그러나, 뇌의 회백질이 매우 잘 지워 반면, 영상의 깊이는 궁극적으로 뇌의 중심에서 가까운 조밀 흰색 물질 책자가 완전히 삭제하여 제한되었습니다. 이는 다른 장기의 문제가 아닙니다.
삭제에 대한 BABB를 사용 하나 단점은 종래 찍어 목적과 호환되지 않는 것입니다. 광학 aberrations에서 삭제 결과를 가능하게하고, 용매는 목적의 장소에 렌즈를 보유하고있는 접착제를 용해 할 수있는 용매의 높은 굴절률. 따라서 매크로 렌즈, ~ 400 nm의 측면 해상도 (1 / E 반경)와 ~ 4.9의 축 해상도 ~ 2 mm 뷰 필드를 결합 니콘 AZ PlanFluor 5 배 0.5NA WD 15mm를 사용 μm (1 / E 반경). 렌즈도 구형 aberrations을 보완 할 수있는 보정 칼라가 있습니다. 그러나,이 렌즈22 mm 다시 구멍을 가지고 있으며 따라서 쉽게 표준 상용 시스템에 적응되지 않을 수 있습니다. 하나는 컴퓨터의 표준 현미경에 렌즈를 장착 가능하도록하지만, 치료는 여기 빔 프로파일 가능한 수치 개구의 최대 이용을 최대한 뒤로 조리개를 채 웁니다 수 있도록주의해야한다 사용자 정의 목록 어댑터를 수. 이 렌즈 BABB 솔루션에 집중하지 않고 비교적 큰 깊이 (~ 2 ㎜)를 통해 집중할 수있을 때, 그 0.5 NA는 영상 수지상의 쪽 충분한 해상도를 제공하지 않습니다. 적어도 0.6와 ~ 40X 배율의 높은 NA있는 렌즈는 수지상 쪽을 해결 할 수 있습니다. 그러나, BABB 솔루션에 집중을 방지하기에 충분한 작동 거리가 있어야합니다. 이 거리를 유지 가능성에 잘 개간을 통해 사용할 수있는 2 mm 깊이 아래에있는 Z-스택 이미지의 깊이를 제한합니다.
그것은 고정하고 개간이 끝에서 신호를 증가시킬 수 있다는 것을 알아야한다형광 ogenous 소스. 이것은 가장 오래 파장 여기 (> 800 nm 정도)와 잘 표시기 염료의 형광 스펙트럼과 일치하도록 방출 필터의주의 선택을 선택하여 피할 수 있습니다.
BABB에 몇 시간에 비해 샘플을 취소하기 위해 6 개월 - 최근 스케일로 지칭 새로운 요소 - 기본 소요 에이전트가 형광 단백질을 10 일부터 신호를 보존하기 위해 증명되었습니다 그러나 2 주 정도 소요됩니다. 스케일은 또한 조직 확장의 대량으로 매우 약한 조직을 떠난, 많은 단백질을 denatures 우레아,의 사용은 immunohistochemistry를 사용하여 후속 연구에 대한 문제가 될 수 있습니다. 반면, 개간 과정은 BABB을 삭제 일부 균일 한 조직 수축 (~ 20 %), 될 수 있지만은 표준 조직 학적 처리 1,2와 호환되도록 표시되었습니다.
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Disclosures
동물 실험은 예일 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
Acknowledgments
우리는 비디오 편집에서 자신의 도움을 야곱이 솔리스 감사드립니다.
이 작품은 MJ Levene에 NSF 경력 수상 DBI-0953902이 부분에 자금을 지원했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Inc. | D8537 | 500 ml, pH 7.2 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde |
| Ethyl alcohol | American Bioanalytical | AB00515-00500 | 500 ml, 200 proof |
| Ethyl alcohol | Pharmco Products, Inc. | 111000190 | 1 gal., 190 proof |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich, Inc. | 402834 | 500 ml, 99+% |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich, Inc. | B6630-IL | 500 ml, ≥ 99% |
| 5X/0.5 NA objective | Nikon | AZ Plan Flour 5X | 15 WD |
References
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