Summary
Multiphoton mikroskopi av hele mus organer er mulig ved optisk fjerne organ før bildebehandling, men ikke alle protokoller bevare den fluorescerende signal av fluorescerende proteiner. Bruke en optisk clearing metoden med etanol-basert dehydrering og benzylalkohol: benzylbenzoat clearing, viser vi høyoppløselige multiphoton bilder av hele mus hjernen uttrykker YFP.
Abstract
Multiphoton mikroskopi av iboende fluorescens og andre harmonisk generering (SHG) av hele mus organer er gjort mulig av optisk tømme orgelet før avbildning. 1,2 Men for organer som inneholder fluorescerende proteiner som GFP og YFP, optiske clearing protokoller som bruker metanol dehydrering og tydelig med benzylalkohol: benzylbenzoat (Babb) mens ubeskyttet mot lys 3 ikke bevare den fluorescerende signal. Protokollen som presenteres her er en ny måte i å utføre hele organet optisk clearing på musen hjernen samtidig bevare fluorescens signal YFP uttrykt i nevroner. Endring av optiske clearing protokollen slik at organet er dehydrert ved hjelp av en etanol graderte serier har blitt funnet å redusere skadene på det fluorescerende proteiner og bevare sin fluorescenssignalet for multiphoton imaging. 4 Bruke en optimalisert fremgangsmåte for optisk clearing med etanol-basert dehydrering og clearing av Babbmens skjermet mot lys, viser vi høyoppløselige multiphoton bilder av gule fluorescerende protein (YFP) uttrykk i nervecellene av en mus hjernen mer enn 2 mm under vevsoverflaten.
Protocol
1. Animal Perfusion 5 og Whole Mouse Brain Clearing
- Hele lengden av prosedyren kan variere avhengig av lengden av tid som brukes per dehydrering trinn, men totalt hele prosessen kan gjennomføres i to dager.
- Vei YFP mus og deretter dypt anesthetize med en intraperitoneal injeksjon av ketamin / xylazin (100 mg / kg: 10 mg / kg).
- Bekreft et kirurgisk plan dyp anestesi før du fortsetter til kirurgi. Sjekk dyret hver 5 min for å se om den reagerer på en fast tå eller hale klemme. Hvis dyret reagerer, en supplerende dose (1/3 av opprinnelig dose) av ketamin / xylazin kreves.
- Når dypt bedøvet, holde musen ved å følge hvert lem til en kirurgisk seng med lab tape slik at musen er i liggende stilling (dorsal recumbancy), utsette sin brystet for kirurgi. Den kirurgiske Sengen er vanligvis laget av et metall eller plast netting og plasseres i en vask eller på toppen av en lipped-pan slik at blod og fiksativavfall lett kan samles opp.
- Til å begynne, gjøre et snitt under xyphoid prosessen. Skjær langs bunnen av brystkassen med saks og pinsett og dra tilbake huden som kuttet er gjort. Lag to kutt langs hver side av musen sternum (gjennom ribbene) å opprette en klaff av vev som er holdt borte fra brysthulen bruke en hemostat forlate hjertet eksponert.
- Sett inn en 23 g nål inn i venstre ventrikkel i hjertet og gjør et lite snitt i muskel veggen av høyre atrium å gi blod for å unnslippe. Vennligst referer til Jove artikkel 2497 for en video av denne prosedyren. 5
- Umiddelbart etter høyre atrium er kuttet, begynne en perfusjon med 4 ° C fosfatbuffret saltvann, PBS, (pH 7,2) til blodet ikke lenger observert drenering fra høyre atrium av hjertet (30 - 40 ml ved en hastighet på omtrent 5 ml / min).
- Når alt blodet er tappet (væske ut av høyre atrium er klar), slå perfusjon medium til et kjølt 4%PFA løsning. Perfuse inntil musen kropp blir merkbart rigid og kaldt å ta (ca. 30-40 ml ved en hastighet på ca 5 ml / min). (Konsentrert 16% PFA fortynnes i henhold til produsentens instruksjoner og NaOH tilsatt inntil pH 7,2 er nådd. Bruk hansker og en laboratoriefrakk og håndtere og blande kjemikalier inne en avtrekkshette.)
- Etter perfusjon, fjern musen fra operasjonsfeltet sengen og halshogge å begynne excision av hjernen.
- Bruke pinsett og iris sakser, fjerner skallen i små seksjoner med start fra baksiden av skallen og fremover. Lag små kutt hver 2-4 mm med saksen over skallen mens du bruker tang til trekk benet vekk fra hjernen i små seksjoner. Gjør dette til hele overflaten av hjernen er utsatt.
- Avgiftsdirektoratet hjernen fra skallen med en 5 mm bred, flat spatel og fyll i et hetteglass. Senk den i 4% PFA i 6 timer ved 4 ° C for post fiksering.
- Etter innleggetfiksering vaskes hjernen to ganger i romtemperatur PBS ved å helle ut av PFA glassampullen og erstatte den med PBS. Virvel hjernen i PBS løsning før strømme ut og erstatte med PBS for en ny vask.
- Dehydrere hjernen ved romtemperatur ved en gradert serie av etanol inkubasjoner (en gang i 50%, 70%, 95%, og to ganger i 100%) ved 2 timers per inkubering, og deretter 12 timer etter den andre 100% etanol inkubasjon, til trekke ut vann fra den faste vev. For hver inkubering hell ut forrige etanolløsning fra glassampullen og erstatte den med den etterfølgende løsning inntil hjernen er helt under vann.
- Etter den andre inkubasjon i 100% etanol, helle ut løsningen og erstatte med like deler etanol og clearing oppløsningen inneholdende benzylalkohol og benzylbenzoat (1:2 vol: vol ratio). Etter 2 timers inkubasjon, dekanter denne løsningen og erstatte med en 100% oppløsning av benzylalkohol og benzylbenzoat (1:2 vol: vol ratio). Den refractive indeks av clearing løsningen er n = 1,54.
- En gang i Babb, vil hjernen bli merkbart transparent, innen 4-5 timer. For best clearing resultater, la hjernen for å fjerne for 6 dager ved romtemperatur, mens skjermet fra sterkt lys.
2. Mikroskop Setup
- Når hjernen er ryddet og klar for avbildning, påføre det til bunnen av en petriskål med cyanoakrylat. La limet tørke før du fortsetter.
- Etter tørking, senk hjernen i Babb og plassere petriskålen under mikroskop målet for avbilding.
- Vi bruker en multiphoton mikroskop som inneholder en Mai Tai titan safir laser justerbar mellom 710 nm til 990 nm eksitasjon bølgelengde. Den eksitasjonsbølgelengde vi bruker for å generere YFP signaler er 886 nm. Laser kraft varierer 30-100 mW avhengig bildebehandling dybde.
- Fange det reflekterte fluorescerende signal ved hjelp av en Nikon 5X objektiv (NA, 0,5) som gjør det mulig for storefelt-of-view avbildning (2 x 2 mm).
- Filtrere det reflekterte fluorescerende signal ved hjelp av en 535/50 båndpassfilter og samle den med en Gaasp PMT (H7422PA-40, Hamamatsu, Bridgewater, New Jersey).
- Redigering av bilder ved hjelp ScanImage programvare 6 med en oppløsning på 2048 x 2048 piksler med en scan rate på 2 ms per linje for å generere høy oppløsning, YFP bilder.
- Når bildebehandling er fullført, fjerner hjernen fra petriskål med pinsett og lagre i Babb skjermet mot lys for fremtidig bildebehandling. For limte prøvene, fjerner vevet ved å kjøre et barberblad mellom limet og petriskål i en vinkel ikke større enn 30 grader. Vi har lagret prøver i Babb i opptil 1 år uten synlig degradering.
3. Representant Resultater
Representative bilder og videoer her viser høy oppløsning multiphoton imaging evne gjort mulig ved optisk clearing. Hele avbildning av hjernen gjørfor YFP-merket nevroner i de forskjellige lag av hippocampus og cortex å være klart synlig som dypt som 2 mm under vevsoverflaten. Fig. 1 viser et representativt bilde av en koronale riss tilsvarende de anatomiske trekk av hippocampus ved 2,92 mm Caudal til bregma 7. Dybden bildebehandling i prøven var 1,94 mm. Noe av denne forskjellen skyldes fjerning av lillehjernen ved caudale enden av hjernen og balansen skyldtes krymping fra dehydrering prosessen. Et annet bilde fra stabelen viser laget V / VI pyramidale nevroner av neocortex uttrykker YFP 2 mm under vevsoverflaten (Figur 2). Alle bildene ble kjøpt med Nikon 5X objektiv og forstørrelse ble gjort ved hjelp av digital zoom-funksjonen for bildeopptak i ScanImage programvare.
Ved å zoome inn på neocortex, de enkelte axoner og Nevron celle organer pyramidale nevroner i lag V i neocortex er klarely skjelnes opptil 1,02 mm under vevsoverflaten (Figur 3). Bruke bildestakk fra figur 3, ble en 3D rekonstruksjon av neuron regionen gjorde hjelp ImageJ programvare 8 (figur 4).
Den høyoppløselige evnen MPM lar oss også presentere bilder av hele, individuelle nerveceller. Her viser vi en rekonstruksjon av et lag V pyramideformet nervecellen av neocortex der enkelte dendrittiske prosesser er godt synlig (figur 5).
Figur 1 Representant bilde fra en 1,2 mm bildestakk (0,8 - 2 mm under vevsoverflaten). Av hel mus hjernen viser neocortex og de forskjellige lag av hippocampus. Funksjoner av hippocampus er synlige 1,1 mm under vevsoverflaten og har blitt merket ved hjelp av følgendeing kode:. DG = dentate gyrus, GrDG = granulær lag av DG, Lmol = lacunosum moleculare lag, Mol = molekylær lag DG, eller = Oriens lag, PoDG = polymorf lag DG, Py = pyramidal celle laget, Rad = stratum radiatum 7 Bildet er 1,8 x 1,8 mm i størrelse, skala bar = 200 mikrometer. Rostral enden av hjernen ble festet til en petriskål med caudal enden vendt opp mot målet. Dette la til rette bildebehandling i koronale flyet.
Figur 2 Representant ramme fra 1,2 mm bildestakk (0,8 - 2 mm under vevsoverflaten). Av hele mus hjernen fremhever neocortex. Pyramidale celler og prosesser uttrykker YFP i lag V / VI cortex er synlige 2 mm under vevsoverflaten. Graden av merking er i samsvar med tidligere rapporter om sparsom merking i neocortex. 9 Inset (til høyre) er utvidet fra b oxed område på venstre. Bildet er 1,8 x 1,8 mm i størrelse, skala bar = 200 mikrometer (50 mikrometer innfelt).
Figur 3. Representant ramme tatt 774 mikrometer under vevsoverflaten fra bildet stabel av lag V pyramidale nevroner i neocortex av hjernen. Stack går fra 700 mikrometer til 1020 mikrometer under vevsoverflaten. En 8X digital zoom ble brukt til å fange detaljer som fine prosesser. Bildet er 225 x 225 mikrometer i størrelse, skala bar = 20 mikrometer.
Figur 4. Representant bilde 3D rekonstruksjon (225 x 225 x 320 um) av bildet stabelen i figur 3.. Bildet er 225 x 225 mikrometer i størrelse, skala bar = 28 mikrometer.
Figur 5. Høy oppløsning rekonstruert bilde av et lag V pyramideformet nervecellen av neocortex med en 10X digital zoom. Neuron måler 485 mikrometer i lengde, skala bar = 25 mikrometer. Synsfeltet for hvert bilde flis er 180 mikrometer x 180 mikrometer. Hver flis er på en annen dybde (z-nivå). Hjernebark apikale dendritter ikke, generelt, ekspress YFP samt soma. Å ha begge i samme synsfelt, som vist her, ble strømmen senket for å minimere metning av soma, dette gjør den fine prosessen ser dimmer. Vårt fokus her var på å vise felt-of-view snarere enn fine detaljer. Å avsløre finere detaljer, bruk en digital zoom, fokus på et område uten soma, og øke laser makt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens standard organiske fargestoffer er kompatibel med en rekke av organiske løsemidler, og derfor ikke utgjør en særlig utfordring for clearing protokoller, fluorescerende proteiner er ofte mindre tolerante overfor endringer i løsemiddel. 4 Målet med dette arbeidet var å overvinne en alvorlig begrensning av tidligere optiske clearing protokoller hvor fluorescens av xfps gikk tapt eller sterkt forringet. Bildene som presenteres her viser at fluorescens fra YFP ble bevart. Den optiske Skrapeteknikken beskrevet her gir høy oppløsning avbildning av YFP-merket nevroner i hele mus hjernen opp til 2 mm under vevsoverflaten. Med etanol dehydrering, som demonstrert tidligere, vil også bevare grønne og røde fluorescerende protein signaler. 4 Bildene vist her vise hvordan dette optiske clearing teknikken kan brukes til å studere hele organet regioner, som hippocampus eller neocortex som uttrykker fluorescerende proteiner. Den høyeOppløsning evne multiphoton mikroskopi tillater også klart forstørrelse av bestemte celler eller områder av interesse innenfor orgelet regionen. De viktigste punktene for å bevare protein fluorescens er å unngå over-fiksering, å ta vare på at fiksativ og alle løsninger er opprettholdt på nær nøytral pH, for å bruke etanol i stedet for metanol for dehydrering, og lagre prøvene i mørket.
Selv om vi demonstrere der bruk av optisk clearing for avbildning av mus hjernen, er teknikken generelt gjelder for de fleste organer. I denne studien viste vi høyoppløselige bilder av hele mus områder av hjernen (neocortex og hippocampus) og spesifikke neuroner i lag V av neocortex (The Thy1-YFPH mus på etikettene pyramidale celler i hippocampus og tynt i neocortex, 9 andre regioner vises mørkt.). Bruke bildestakk av Layer V pyramidale nevroner ble et 3D rekonstruert volum av nevroner opprettet. Brukervennligheten hh disse bildene ble tatt dypt inne i musen hjernen på høy oppløsning etter optisk clearing gjør dette et kraftig verktøy for å studere nevroanatomi. Imidlertid ble mens grå materie klarner svært godt, bildebehandling dybde i hjernen slutt begrenset av ufullstendig clearing av tette hvite substans traktene nær sentrum av hjernen. Dette er ikke et problem i andre organer.
En ulempe med å bruke Babb for avregning er at det er ikke er kompatibel med konvensjonelle dipping mål. Den høye brytningsindeks løsningsmidlet som muliggjør clearing resulterer i optiske aberrasjoner, og oppløsningsmidlet kan oppløse limet som holder linsene på plass i målfunksjonen. Vi har derfor brukt et makroobjektiv, Nikon AZ PlanFluor 5X 0.5NA WD 15 mm, som kombinerer en ~ 2 mm felt-of-view med en lateral oppløsning på ~ 400 nm (1 / e radius) og aksial oppløsning på ~ 4,9 mikrometer (1 / e radius). Linsen har også en korreksjon krage for å kompensere for sfæriske avvik. Men dette objektivethar en 22-mm rygg blenderåpning og derfor kan ikke være lett tilpasses standard kommersielle systemer. En kunne maskinen en tilpasset gjengeadapter aktivere montering av objektivet på et standard mikroskop, men forsiktighet bør tas for å sikre at strålen eksitasjon profilen fyller baksiden blenderåpning så mye som mulig for å gjøre maksimal bruk av den tilgjengelige numerisk apertur. Mens denne linsen var i stand til å fokusere gjennom en relativt stor dybde (~ 2 mm) uten nedsenking i Babb løsningen, gjør sitt 0,5 NA ikke gi tilstrekkelig oppløsning for imaging dendrittiske pigger. Et objektiv med en høyere NA på minst 0,6 og ~ 40X forstørrelse kan løse dendritic spines. Det må imidlertid ha tilstrekkelig arbeidskapital avstand for å unngå nedsenking i Babb løsning. Opprettholde denne avstanden vil trolig begrense dybden av z-stack bilde til godt under 2 mm dyp tilgjengelig gjennom clearing.
Det bør bemerkes at fiksering og oppklaringen kan øke signalet fra utgangenogenous kilder fluorescens. Dette er best unngås ved å velge lengre bølgelengde eksitasjon (> 800 nm) og nøye utvalg av utslippsrettigheter filtre til godt matche fluorescens spekteret av indikatoren fargestoff.
Nylig har en ny urea-base clearing middel kalt SCALE vist seg å bevare signalet fra fluoriserende proteiner 10, men tar det to uker - 6 måneder å fjerne en prøve, sammenlignet med et par timer for Babb. SCALE også forlater vevet svært skjør, med store mengder vev ekspansjon, og bruk av urea, som denatures mange proteiner, vil trolig være problematisk for oppfølgingsstudier med immunhistokjemi. I motsetning til dette har selv clearing prosessen kan resultere i noen uniform vev krymping (~ 20%), med clearing Babb blitt vist å være kompatibel med standard histologisk prosessering 1,2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Eksperimenter på dyr ble utført i samsvar med de retningslinjer og forskrifter fastsatt av Yale University Institutional Animal Care & bruk Committee.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Jacob Solis for hans hjelp i videoredigering.
Dette arbeidet ble finansiert delvis av en NSF KARRIERE Award DBI-0953902 til MJ Levene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Inc. | D8537 | 500 ml, pH 7.2 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde |
| Ethyl alcohol | American Bioanalytical | AB00515-00500 | 500 ml, 200 proof |
| Ethyl alcohol | Pharmco Products, Inc. | 111000190 | 1 gal., 190 proof |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich, Inc. | 402834 | 500 ml, 99+% |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich, Inc. | B6630-IL | 500 ml, ≥ 99% |
| 5X/0.5 NA objective | Nikon | AZ Plan Flour 5X | 15 WD |
References
- Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. Multiphoton microscopy of cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).
- Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).
- Zucker, R. M. Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis. Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).
- Sakhalkar, H. S. Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing. Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).
- Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 2, (2003).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 2nd Ed, Elsevier Science. San Diego, CA, USA. (2001).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Hama, H. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).
