Summary
Tüm fare organların Multiphoton mikroskobu optik görüntüleme öncesi organı temizleyerek mümkün değil, tüm protokolleri floresan proteinlerin floresan sinyal korumak. Etanol bazlı dehidratasyon ve benzil alkol ile optik temizleme yöntemi: benzil benzoat takas, biz bütün fare beyin YFP ifade yüksek çözünürlüklü multiphoton görüntüleri göstermek.
Abstract
Tüm fare organlarının içsel floresans ve ikinci harmonik üretimi (SHG) arasında Multiphoton mikroskobu optik görüntüleme öncesi organı temizleyerek mümkün olmaktadır. 1,2 Ancak, GFP ve YFP olarak floresan proteinleri içeren organlar, metanol kullanan optik temizleme protokollerinin benzil alkol kullanarak dehidratasyon ve net: ışık 3 korumasız ise benzil benzoat (Babb) floresan sinyal korumak yok. Burada sunulan protokol nöronlarda eksprese YFP floresan sinyal koruyarak fare beyni üzerindeki tüm organ optik temizleme gerçekleştirmek için hangi yeni bir yoludur. Org floresan protein için hasarı azaltmak ve multiphoton görüntüleme için onların floresan sinyalini korumak için yararlı olan bir dizi dereceli etanol kullanılarak susuz olduğu bu tür optik açıklığa protokol değiştirilmesi. 4 etanol-tabanlı dehidrasyon ile optik açıklığın iyileştirilmiş bir yöntem ile Babb ile takasışıktan korumalı ise, biz doku yüzeyinin altında 2 mm'den daha fazla bir fare beyin nöronları sarı floresan proteini (YFP) İfade yüksek çözünürlüklü multiphoton görüntüleri göstermek.
Protocol
1. Hayvan Perfüzyon 5 ve Whole Fare Beyin Takas
- Işlemin tüm uzunluğu boyunca kurutma aşaması için kullanılan süre uzunluğuna bağlı olarak değişebilir, fakat toplam tüm süreç iki gün içinde gerçekleştirilebilmektedir.
- YFP fareler tartılır ve daha sonra derin bir ketamin / ksilazin (100 mg / kg: 10 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyon ile anestetize.
- Ameliyat öncesinde derin anestezi cerrahi bir düzlem onaylayın. Hayvan bir firma parmak veya kuyruk tutam tepki olmadığını görmek için her 5 dakikada kontrol edin. Hayvan tepki vermiyorsa, ketamin / xylazine bir ek doz (orijinal dozun 1/3) gereklidir.
- Sonra derin anestezi, fare ameliyat için onun göğüs teşhir, bir yatar pozisyonda (dorsal recumbancy) olduğunu böylece laboratuar bandı kullanarak cerrahi yatağa her uzuv kalarak fare kısıtlamaktadır. Cerrahi yatak genellikle metal veya plastik örgü yapılmış ve bir lavaboya veya bir dudaklı-pan üstüne yerleştirilir, böylece kan ve fiksatifatık kolaylıkla toplanabilir.
- Başlamak için, xyphoid süreç altında bir kesi yapmak. Makas ve cımbız kullanarak göğüs kafesinin tabanı boyunca kesin ve kesim yapıldığı gibi cilt geri çekin. Fare sternumun her iki tarafı boyunca iki kesim (kaburgaları) kalp maruz bırakmak bir hemostat kullanarak göğüs boşluğuna uzak tutulan bir doku flep oluşturmak için yapın.
- Kalbin sol ventrikül içine 23 gr iğne takın ve kan kaçmasına izin vermek için sağ atrium kas duvarında küçük bir kesi yapmak. Bu prosedürün bir video için makale 2497 Jove bakın. 5
- Sağ atriyum kesilir hemen sonra, 4 ile perfüzyon başlamak ° C'de kan artık kalbin sağ atriyum (30 süzülen gözleninceye kadar fosfat, PBS (pH 7.2) tamponlu salin - yaklaşık 5 arasında bir oranda 40 mL ml / dak.)
- Bir kez tüm kan (sağ atrium çıkarken sıvı açıktır) drene edilmiş, soğutulmuş% 4 perfüzyon orta geçişPFA çözüm. Farenin vücut dokunma (- yaklaşık 5 ml / dk 'lık bir oranda 40 mL olarak yaklaşık 30) belirgin ve katı haline gelene kadar soğuk serpmek. (Konsantre% 16 PFA çözeltisi üreticisinin talimatlarına ve pH 7,2 ulaşılana kadar NaOH eklenir göre seyreltilir. Eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin ve davlumbaz içine kimyasallar işlemek ve karıştırın.)
- Perfüzyon sonra, cerrahi yatağından fare kaldırmak ve beynin eksizyonu başlamak için başını kesmek.
- Forseps ve iris makas kullanarak, kafatasının arka başlayan ve ilerlemeye küçük bölümlerde kafatası çıkarın. Dikkatle küçük bölümlerde beyin uzak kemik çekmek için forseps kullanırken kafatası üzerinde makas ile 4 mm - küçük kesikler her 2 olun. Beynin tüm üst yüzey ortaya çıkıncaya kadar bunu yapın.
- Tüketim bir cam şişenin içine 5 mm genişliğinde, düz spatula ve yer kullanarak kafatasından beyin. Sonrası fiksasyon için 4 az 6 saat süreyle% 4 PFA ° C daldırın.
- Mesaj Sonrasıfiksasyon, cam flakon PFA dökülen ve PBS ile değiştirerek oda sıcaklığında PBS içinde iki kez beyin yıkamak. Dökülen ve ikinci bir yıkama için PBS ile değiştirmeden önce PBS çözüm Swirl beyin.
- Derecelendirilmiş bir inkübasyon başına 2 saat etanol inkübasyonlar serisi (bir kez,% 50,% 70,% 95, ve iki kez% 100), ve daha sonra da ikinci% 100 etanol inkübasyonu ile 12 saat oda sıcaklığında beyin kurutmak için Sabit doku su çıkarmak. Her inkübasyon için, cam tüpten önceki etanol çözeltisi dökünüz ve beynin tamamen daldırılmış kadar sonraki çözümü ile değiştirin.
- % 100 etanol içinde ikinci bir inkübasyondan sonra, çözelti dökmek ve eşit parça etanol ve benzil alkol ve benzil benzoat (1:2 lik hacim: hacim oranında) ihtiva eden temizleme çözeltisi ile değiştirin. İnkübasyondan sonra, süzün bu çözelti 2 saat sonra ve benzil alkol ve benzil benzoat (1:2 lik hacim: hacim oranında) arasında bir% 100 çözeltisi ile değiştirin. Refratakas çözüm ctive indeksi n = 1.54 olduğunu.
- Bir kez Babb, beyin 4 içinde, fark şeffaf olacak - 5 saat. En iyi temizleme sonuçları elde etmek için, parlak ışık korumalı sırasında beyin, oda sıcaklığında 6 gün boyunca açık bırakılır.
2. Mikroskop Kurulumu
- Beyin görüntüleme için temizlenir ve hazır hale geldiğinde, bir Petri kabı altına yapıştırmayın bunu siyanoakrilat kullanarak. Yapıştırıcı devam etmeden önce kurumasını bekleyin.
- Kuruduktan sonra, batığın Babb beyin ve görüntüleme için mikroskop objektif altında Petri kabı yerleştirin.
- Biz 990 nm dalgaboyu için 710 nm arasında ayarlanabilen bir Mai Tai titanyum safir lazer birleştiren multiphoton mikroskop kullanmak. Biz YFP sinyallerini üretmek için kullanabileceğiniz dalgaboyu 886 nm. Lazer gücü 30 arasında değişir - 100 mW görüntüleme derinliğine bağlı.
- Büyük sağlayan bir Nikon 5X objektif (NA, 0.5) kullanılarak yansıyan floresan sinyali yakalamakalan-of-view görüntüleme (2 x 2 mm).
- Bir 535/50 bandpass kullanarak yansıyan floresan sinyal filtreleme ve GaAsP PMT (H7422PA-40, Hamamatsu, Bridgewater, New Jersey) kullanarak toplamak.
- Yüksek çözünürlüklü, YFP görüntüleri oluşturmak için 2 ms başına satır tarama oranı ile 2048 x 2048 piksel çözünürlükte ScanImage yazılımını 6 kullanarak Süreci görüntüler.
- Bir kez görüntüleme tamamlandığında, gelecekte görüntüleme için ışıktan korumalı forseps ve Babb mağaza kullanarak Petri çanak beyin çıkarın. Yapıştırılmış numuneler için, 30 dereceden daha fazla bir açıyla ve tutkal Petri kabı arasında bir jilet çalıştırarak doku kaldırmak. Biz hiçbir görünür bozulması ile 1 yıl için Babb örneklerin depolamış.
3. Temsilcisi Sonuçlar
Burada gösterilen temsili görüntüler ve videolar optik takas mümkün kılan yüksek çözünürlüklü multiphoton görüntüleme özelliği göstermektedir. Tüm beyin görüntüleme sağlarYFP-etiketli hipokampus ve korteks farklı katmanlardaki nöronlar doku yüzeyinin altında 2 mm kadar derin biçimde görülebilir. Şekil 1 için hipokampus anatomik özelliklere karşılık gelen bir koronal görüşün bir temsilcisi görüntü kaudal 2.92 mm gösterir bregma 7. Örnek görüntüleme derinliği 1.94 mm idi. Bu farkın bazı beyin kaudal sonunda serebellumun kaldırılması nedeniyle ve denge dehidratasyon sürecinden büzülme nedeniyle oldu. Yığın bir başka görüntü doku yüzeyi (Şekil 2) altında YFP 2 mm ifade neokorteks tabaka V / VI piramidal nöronlar göstermektedir. Tüm görüntüler Nikon 5X objektif ve büyütme ScanImage yazılım görüntü elde etmek için dijital zoom özelliğini kullanarak yapıldı kullanılarak elde edildi.
Neokorteks üzerinde yakınlaştırma tarafından, neokorteks Katman V piramidal nöronların tek tek akson ve nöron hücre gövdeleri açıkly doku yüzeyinin altında 1.02 mm (Şekil 3) kadar ayırt. Şekil 3, ikinci görüntü yığını kullanarak, nöron bölge bir 3D yeniden ImageJ yazılım 8 (Şekil 4) kullanılarak yapılmıştır.
MPM yüksek çözünürlük özelliği de bize tüm bireysel nöronların görüntüleri sunmaya olanak sağlar. Burada bireysel dendritik süreçleri açıkça görünür olduğu neokorteks (Şekil 5) Layer V piramidal nöron bir rekonstrüksiyon göstermektedir.
Şekil 1, bir 1.2 mm Görüntü yığını Temsilcisi görüntü (0,8 - doku yüzeyinin altında 2 mm). Neokorteks ve hipokampus farklı katmanları gösteren tüm fare beyin. Hipokampus Özellikleri doku yüzeyinin altında 1.1 mm görebilir ve takip kullanılarak etiketlenir oylandıing kodu:. DG = dentat girus, DG = granüler tabaka GrDG, Lmol = lacunosum moleculare tabakası, Mol = moleküler tabaka DG, Ya = Oriens tabakası, PoDG = polimorf tabakası DG, Py = piramidal hücre tabakası, Rad = stratum radiatum 7 Resim 1.8 x 1.8 mm boyutunda, ölçek çubuğu = 200 mikron. Beynin rostral sonunda hedefi doğru yukarı bakacak kaudal ucu ile bir Petri kabı üzerine oturtulmuştur. Bu koronal düzlemde görüntüleme kolaylaştırdı.
Şekil 2. 1.2 mm Görüntü yığını Temsilcisi çerçevesi (0.8 - doku yüzeyinin altında 2 mm). Neokorteks vurgulayarak tüm fare beyin. Korteks tabakası V / VI YFP ifade Piramidal hücre ve süreçleri doku yüzeyinin altında görünür 2 mm. Etiketleme derecesi neokortekste seyrek etiketleme önceki çalışmalarla uyumludur. ANKASTRE 9 (sağ) b büyütülür Soldaki oxed alanı. Görüntü boyutu 1.8 x 1.8 mm, ölçek çubuğu = 200 mikron (50 mikron inset).
Şekil 3. Örnek çerçeve beynin neokorteks katmanı V piramidal nöronların görüntü yığınından doku yüzeyinin altında 774 mikron alınır. Yığın 700 mikron gelen doku yüzeyinin altında 1.020 mikron gider. Bir 8X dijital zoom gibi ince süreçleri gibi detayları yakalamak için kullanıldı. Görüntü boyutu 225 x 225 mikron, ölçek çubuğu = 20 mikron.
Şekil 4. Şekil 3'te görseli yığının 3D rekonstrüksiyon Temsilcisi görüntü (225 x 225 x 320 mikron). Görüntü boyutu 225 x 225 mikron, ölçek çubuğu = 28 mikron.
Şekil 5. 10X dijital zoom kullanarak neokorteks bir tabaka V piramidal nöron Yüksek çözünürlüklü yeniden görüntü. Nöron uzunluğu, ölçek çubuğu = 25 mikron 485 mikron ölçer. Her görüntü kiremit için görüş alanı 180 mikron x 180 mikron. Her kiremit farklı bir derinlik (z-seviyesinde) yer almaktadır. Kortikal apikal dendritler genel, ekspres YFP yanı sıra soma içinde yok. Burada gösterildiği gibi, güç soma doyma en aza düşürülmüştür, görüş alanında her ikisi de aynı olması için, bu ince işlem sönük görünmesine neden olmaktadır. Buradaki vurgu yerine ince ayrıntılarla daha görüş alanı görünümünde gösteren oldu. Ince ayrıntıları göstermek için, soma olmadan bölgeye odaklanmak, bir dijital zoom kullanın ve lazer gücünü artırmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Standart organik boyalar organik çözücülerin bir yelpazesi ile uyumlu ve bu nedenle protokoller temizlemek için özel bir sorun teşkil etmez iken, floresan proteinleri çözücü sıklıkla değişiklikler az hoşgörülü. Mevcut çalışma 4 hedefi ciddi bir sınırlama üstesinden oldu XFPs floresan kayıp veya ölçüde düşer Bir önceki optik temizleme protokolleri. Burada sunulan görüntüler YFP gelen floresans korunmuş olduğunu göstermektedir. Burada anlatılan optik temizleme tekniği doku yüzeyinin altında 2 mm tamamen fare beyninde YFP-etiketli nöronlar kadar yüksek çözünürlüklü görüntüleme için izin verir. Daha önce gösterildiği gibi, etanol dehidratasyon kullanma, ayrıca yeşil ve kırmızı floresan proteini sinyalleri koruyacaktır. Burada bu optik temizleme tekniği gibi hipokampus ve neokorteks olduğunu ifade floresan proteinleri gibi tüm organ bölgelerinde çalışmaya nasıl uygulanabileceğini göstermek gösterilen 4. görüntüler. YüksekMultiphoton mikroskobu çözünürlük özelliği de organ bölgede ilgi belirli hücrelerin veya alanlarında açık büyütme sağlar. Protein floresans korumak için kilit noktaları dehidratasyon etanol yerine metanol kullanımı, fiksatif ve tüm çözümleri yakın nötr pH tutulmaktadır dikkat etmek, aşırı fiksasyon önlemek için, ve karanlıkta örnekleri saklamak için vardır.
Burada fare beyin görüntülenmesi için optik temizleme kullanımını göstermektedir rağmen, teknik genel olarak en çok organ için de geçerlidir. Bu çalışmada yüksek çözünürlüklü tüm fare beyin bölgelerinin görüntüleri (neokorteks ve hipokampus) ve neokorteks Katman V (hipokampus ve seyrek neokortekste Thy1-YFPH fare satırlı etiketlerde piramidal hücrelerinde, 9 diğer bölgeler içinde belirli nöronlar gösterdi koyu görünür.). Katman V piramidal nöronların görüntü yığınını kullanarak, nöronların bir 3D yeniden birim oluşturuldu. Hangi ile kolaylığıoptik temizleme Bu nöroanatomi çalışmak için güçlü bir araç yapar, sonra saat bu görüntüler yüksek çözünürlükte fare beyin içinde derin ele geçirildi. Ancak, beyindeki gri madde son derece iyi temizler ederken, görüntüleme derinliği sonuçta beynin merkezine yakın yoğun beyaz cevher yolları eksik takas ile sınırlı kalmıştır. Bu, diğer organlarda bir sorun değildir.
Takas için Babb kullanmanın bir dezavantajı konvansiyonel daldırma hedefleri ile uyumlu olmasıdır. Optik aberasyonlarında temizleme sonuçları sağlar, ve çözücü, amaç olarak yerinde tutan lensler tutkal eritmesi ki çözücünün yüksek refraktif indeks. Bu nedenle, bir makro objektif, ~ 400 nm lateral çözünürlük (1 / e yarıçapı) ve ~ 4.9 eksenel çözünürlüğü ile ~ 2 mm görüş alanı görünümünü bir araya getiren Nikon AZ PlanFluor 5X 0.5NA WD 15 mm, ikinci mikron (1 / e yarıçapı). Lens aynı zamanda küresel sapmaları telafi etmek için bir düzeltme yaka vardır. Ancak, bu objektif22-mm arka diyafram vardır ve bu nedenle kolayca standart ticari sistemlere adapte olabilir. Bir makine standart bir mikroskop üzerine mercek montaj sağlamak için, ama bakım uyarma ışını profili mevcut sayısal diyafram maksimum yararlanmak mümkün olduğunca arka diyafram doldurur sağlamak için alınması gereken özel bir konu adaptörü olabilir. Bu lens Babb çözüm daldırma olmadan nispeten büyük bir derinlik (~ 2 mm) yoluyla odaklanmak mümkün iken, onun 0,5 NA görüntüleme dendritik dikenler için yeterli çözümü sağlamaz. En az 0,6 ve ~ 40X büyütmede, daha yüksek bir NA sahip bir lens dendritik omurga çözme kapasitesine sahiptir. Bununla birlikte, Babb çözelti içinde daldırma önlemek için yeterli bir çalışma mesafesi olması gerekir. Bu mesafeyi muhafaza olasılıkla iyi takas yoluyla kullanılabilen 2 mm derinlik altındaki z-yığını görüntünün derinliğini sınırlar.
Bu tespit ve son temizleme gelen sinyal artırabilir olduğunu belirtmek gerekirfloresans ogenous kaynakları. Bu en uzun dalga boyu uyarım (> 800 nm) ve iyi göstergesi boyanın floresans spektrumu maç için emisyon filtresi dikkatli seçim yaparak önlenir.
Babb için birkaç saat ile karşılaştırıldığında, bir numune temizlemek için 6 ay - Son zamanlarda, ölçek olarak adlandırılan yeni bir üre bazlı temizleme ajanı floresan protein 10 ile işaret korumak için gösterilmiştir, ancak, 2 hafta sürer. SCALE zamanda doku genişletilmesi büyük miktarda, çok kırılgan doku bırakır ve birçok proteinleri denatüre üre, kullanımı immünohistokimya kullanarak takip çalışmaları için sorunlu olması muhtemeldir. Buna karşılık, temizleme sürecinin Babb ile temizleyerek aynı bazı doku büzülmesi (~% 20), yol açabilir rağmen standart histolojik işleme 1,2 ile uyumlu olduğu gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Deney hayvanları üzerinde Yale Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapıldı.
Acknowledgments
Biz video düzenleme yaptığı yardım için Jacob Solis teşekkür etmek istiyorum.
Bu çalışma MJ Levene bir NSF KARİYER Ödülü DBI-0953902 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Inc. | D8537 | 500 ml, pH 7.2 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde |
| Ethyl alcohol | American Bioanalytical | AB00515-00500 | 500 ml, 200 proof |
| Ethyl alcohol | Pharmco Products, Inc. | 111000190 | 1 gal., 190 proof |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich, Inc. | 402834 | 500 ml, 99+% |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich, Inc. | B6630-IL | 500 ml, ≥ 99% |
| 5X/0.5 NA objective | Nikon | AZ Plan Flour 5X | 15 WD |
References
- Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. Multiphoton microscopy of cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).
- Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).
- Zucker, R. M. Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis. Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).
- Sakhalkar, H. S. Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing. Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).
- Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 2, (2003).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 2nd Ed, Elsevier Science. San Diego, CA, USA. (2001).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Hama, H. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).
