Summary
हम प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए एक microfluidic दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं. इस उपकरण में सूक्ष्म यांत्रिक वाल्व द्वारा नियंत्रित प्रतिक्रिया कक्षों के हजारों के होते हैं. microfluidic डिवाइस एक जीन माइक्रोएरे मुद्रित पुस्तकालय के लिए mated है. इन जीनों और फिर लिखित चिप पर अनुवाद कर रहे हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक प्रोटीन सरणी में प्रयोगात्मक उपयोग के लिए तैयार है.
Abstract
सिस्टम जीव विज्ञान के रूप में तेजी से बढ़ क्षेत्रों, और नई प्रौद्योगिकियों के विकास और कार्यान्वयन की आवश्यकता होती है, बड़े सिस्टम के उच्च throughput और उच्च विश्वस्तता माप सक्षम. Microfluidics इन आवश्यकताओं के कई को पूरा करने का वादा किया है, चिप पर उच्च throughput स्क्रीनिंग प्रयोग प्रदर्शन के रूप में, जैव रासायनिक, biophysical, और सेल आधारित assays को शामिल 1. Microfluidics उपकरणों के शुरुआती दिनों के बाद से इस क्षेत्र में काफी विकसित किया गया है, microfluidic बड़े पैमाने पर 2,3 एकीकरण के विकास के लिए अग्रणी. यह प्रौद्योगिकी एक पदचिह्न डाक आकार (1 चित्रा) के साथ एक डिवाइस पर micromechanical वाल्व के हजारों के एकीकरण के लिए अनुमति देता है. हम प्रोटीन (2 चित्रा) arrays पिंग (प्रोटीन बातचीत नेटवर्क जेनरेटर) नाम के इन विट्रो अभिव्यक्ति में पैदा करने के लिए एक उच्च throughput microfluidic मंच विकसित किया है. इन arrays कई प्रयोगों के लिए एक टेम्पलेट के रूप में सेवा कर सकते हैंइस तरह के रूप में 4 प्रोटीन, प्रोटीन, 5 प्रोटीन शाही सेना या प्रोटीन डीएनए 6 बातचीत.
युक्ति कक्षों की प्रतिक्रिया हजारों है, जो व्यक्तिगत रूप एक microarrayer का उपयोग कर रहे हैं क्रमादेशित से मिलकर बनता है. एक एकल जगह संभावित संक्रमण या पार जेट इसके अलावा को नष्ट करने, मानक माइक्रोएरे खोलना तकनीक का उपयोग प्रोटीन पैदा microfluidics उपकरणों कार्यक्रमों के लिए इन मुद्रित प्रोटीन के साथ प्रत्येक कक्ष Aligning भी बहुत मॉड्यूलर, 7 प्रोटीन, 8 डीएनए, छोटे अणुओं के प्रोटीन के लिए अनुमति देता है, और यहां तक कि कोलाइडयन निलंबन. जैविक विज्ञान पर microfluidics के संभावित प्रभाव महत्वपूर्ण है. Microfluidics आधारित assays की संख्या पहले से ही और जैविक प्रणालियों की संरचना और समारोह में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान की है, और microfluidics क्षेत्र के लिए जीव विज्ञान का प्रभाव जारी रहेगा.
Protocol
1. डिवाइस फेब्रिकेशन
- SU DTPA-D-8 नियंत्रण और स्टैनफोर्ड Microfluidics फाउंड्री (से SPR220-7 ढालना प्रवाह मोल्ड खरीदा www.stanford.edu / / समूह फाउंड्री ).
- Chlorotrimethylsilane वाष्प (TMCS) पकाना 9 कदम के बाद elastomer रिलीज को बढ़ावा देने के लिए 10 मिनट के लिए सिलिकॉन molds बेनकाब.
- सिलिकॉन आधारित और दो अलग अलग 05:01 और 20:01, नियंत्रण और प्रवाह molds के लिए क्रमशः अनुपात में इलाज एजेंट elastomer (अच्छी तरह से मिश्रण) का एक मिश्रण तैयार है. अलग अनुपात कई परतों की उचित संबंधों के लिए आवश्यक हैं.
- नियंत्रण परत (लगभग 5 मिमी ऊंचाई) पर 05:01 PDMS डालो. Degas नियंत्रण परत और 80 पर 30 मिनट के लिए सेंकना डिग्री सेल्सियस स्पिन (Laurell, संयुक्त राज्य अमरीका) 20:01 2600 आरपीएम पर 60 सेकंड के लिए प्रवाह परत पर PDMS मिश्रण कोट और फिर 30 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस से कम यह सेंकना. स्पिन coater वेग वाल्व actuation के लिए एक दबाव में अनुकूलित है15 साई. तेज़ कताई कम सक्रियण दबाव और इसके विपरीत के साथ एक पतली परत में परिणाम देगा. उपकरणों का उपयोग हम नियंत्रण में 25 साई और 10 साई के प्रवाह में एक सीमा होती है, जिसके ऊपर सब्सट्रेट से अलगाव होने पर हो सकती है.
- आचारण से अलग नियंत्रण परत. यह धीरे धीरे और नहीं SU8 पैटर्न छील करने सावधान रहना. तो इसकी परिधि और पंच छेद के आसपास डिवाइस में कटौती करने के लिए नियंत्रण चैनलों का उपयोग.
- मैन्युअल एक त्रिविमदर्शी तहत प्रवाह और नियंत्रण परतों संरेखित करें. ऊपरी बाएँ कोने aligning से शुरू करें, बटन वाल्व (नियंत्रण परत) प्रतिक्रिया कक्ष (प्रवाह परत) के बीच में होना चाहिए. अगला, पहली पंक्ति पंक्ति में है और धीरे पंक्ति द्वारा नियंत्रण परत पंक्ति जारी. सुनिश्चित करें कि सभी बटन वाल्व प्रतिक्रिया कक्षों के बीच में हैं और पता और इनपुट वाल्व सही स्थिति में प्रवाह चैनल पार कि. प्रक्रिया स्थानीय स्तर पर दोहराया जा सकता है जब तक सभी पंक्तियों गठबंधन कर रहे हैं. अंत में, PDMS ख में किसी भी तनाव जारीy इसे ध्यान उठाने किनारों और कोनों से. लिफ्ट या बहुत ज्यादा नहीं misalignment होने पर हो सकती है.
- 2 घंटे के लिए यह 80 पर बनाओ डिग्री सेल्सियस
- डिवाइस की परिधि के आसपास और दो प्रवाह सांचे से परत डिवाइस (चिप) छील काटें. छेद पंच प्रवाह चैनल (1 चित्रा) का उपयोग करने के लिए.
2. डीएनए arraying और डिवाइस संरेखण
- विधानसभा पीसीआर द्वारा कृत्रिम जीन का उत्पादन. कृत्रिम जीन T7 प्रमोटर, ribosome बाध्यकारी साइट (आरबीएस), दो मिलान टैग के साथ ओआरएफ (प्रत्येक के अंत में एक), और T7 4 टर्मिनेटर की रचना कर रहे हैं. जीन लंबाई में 100 बीपी से भिन्न हो सकता है, कम से कम, 5000 बीपी.
- प्रोटीन के लिए कृत्रिम जीन तैयार: पाली ethylene (1.25%) glycole और D-trehalose dihydrate (125 मिलीग्राम / एमएल) के एक मिश्रण तैयार और 384 कुओं थाली में प्रति प्रतिक्रिया 2 μl बांटना. यह समाधान 10 संरेखण के दौरान डीएनए के अपरिवर्तनीय दृश्य के लिए कांच के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बाध्यकारी कम हो जाएगा. 384 कुओं की थाली के लिए कृत्रिम जीन स्थानांतरण. आम तौर पर 10 से डीएनए सांद्रता एनजी / μl 100 एनजी / μl अंतिम एकाग्रता लेकर कर सकते हैं. DH 2 हे 20 μl (microarrayer और पिन प्रकार पर निर्भर करता है) की एक अंतिम मात्रा जोड़ें.
- Epoxy लेपित गिलास एक microarrayer का उपयोग substrates पर कृत्रिम जीन की एक श्रृंखला स्पॉट. हम microgrid 610 (जैव रोबोटिक) श्रीमती S75 सिलिकॉन पिन (समानांतर संश्लेषण, यूएसए) के साथ उपयोग करें. डीएनए के मुद्रण इन विशिष्ट पिन के साथ संपर्क, कांच की सतह पर के बारे में 100 मीटर के व्यास के साथ स्थानों में परिणाम है. प्रत्येक पिन भार लगभग 100 स्थानों के लिए पर्याप्त है. स्तंभ और पंक्ति पिचों विशिष्ट इस्तेमाल किया युक्ति के अनुरूप सुनिश्चित. डिवाइस का उपयोग हम 16 कॉलम और 320 सुक्ष्ममापी, क्रमशः 680 सुक्ष्ममापी की पिच के साथ 40 पंक्तियों शामिल हैं.
- मैन्युअल रूप से एक स्टिरियोस्कोप के तहत जीन सरणी युक्ति microfluidic align. डीएनए जगह डीएनए कक्षों के बीच में होना चाहिए. कनक मूल्य पर बेची हुई वस्तुऐँ ख की पहली पंक्ति का पता लगाने के द्वारा शुरू संरेखणडीएनए कक्षों की पहली पंक्ति elow. फिर लाइन में लाने के लिए पंक्तियों के बाकी पूरे डिवाइस के ठीक ट्यूनिंग के साथ खत्म. एक बार सरणी गठबंधन किया है देखभाल PDMS में यह स्थानीय स्तर पर उठाने के द्वारा किसी भी तनाव को कम करने के लिए लिया जाना चाहिए. अगर वहाँ तनाव PDMS यह बंधन माइक्रोएरे के लिए अच्छी तरह से नहीं हो सकता है में छोड़ दिया है.
- अंत में, एक गर्म थाली पर रातोंरात ऊष्मायन द्वारा गिलास स्लाइड 80 पर डिवाइस बंधन ° सी.
3. भड़काना और डिवाइस सक्रिय कर रहा है
- नियंत्रण परत में वाल्व LabVIEW का उपयोग कर कंप्यूटर से प्रेरित कर रहे हैं. LabVIEW स्क्रिप्ट एक इलेक्ट्रॉनिक नियंत्रण बॉक्स (स्टैनफोर्ड Microfluidics ढलाई से खरीदा) के माध्यम से सूक्ष्म solenoid वाल्व की एक श्रृंखला को नियंत्रित करता है. solenoid वाल्व कई गुना संपीड़ित हवा, जो हवा और डिवाइस पर नियंत्रण वाल्व में प्रवाह के दबाव को नियंत्रित करने के लिए जुड़ा हुआ है.
- Solenoid वाल्व कई गुना 0.02 की आंतरिक व्यास के साथ एक लचीला प्लास्टिक टयूबिंग का उपयोग करने के लिए डिवाइस (Tygon कनेक्ट ") और स्टेनलेस स्टील पिन (न्यू इंग्लैंड छोटी ट्यूब निगम).
- DDW ट्यूबों के साथ भरें और नियंत्रण परत के छेद में उपयोग पिन डालने. यह सुनिश्चित करें कि प्रत्येक ट्यूब अपनी इसी नियंत्रण चैनल से जुड़ा है.
- नियंत्रण चैनलों को सक्रिय करने के लिए कंप्यूटर पर LabVIEW अनुप्रयोग चलाएँ. LabVIEW स्क्रिप्ट से वाल्व सक्रिय करके, हम हवा के दबाव, जो बारी में PDMS नियंत्रण चैनलों में पानी धक्का होगा लागू होते हैं. हवा के दबाव को 5 साई सेट. यह 'सैंडविच' और पता वाल्व 1 भरने के क्रम में पार दोषपूर्ण उपकरणों के नियंत्रण चैनलों के बीच वार्ता की पहचान करने के लिए सिफारिश की है. पार वार्ता के मामले में, 'सैंडविच' नियंत्रण रेखा के actuation या तो गर्दन या बटन नियंत्रण रेखा के actuation के लिए नेतृत्व करेंगे. यह एक बिजली के सर्किट में एक कम करने के लिए समान है. क्रॉस - टॉक के साथ एक डिवाइस दोषपूर्ण है और नहीं किया जा सकता.
- के बाद सभी नियंत्रण चैनलों और वाल्व DDW का पूरा कर रहे हैं, वाल्व primed रहे हैं और इसकी वजहउन्हें नीचे प्रवाह चैनलों ब्लॉक वि. 15 साई के लिए हवा के दबाव बढ़ाएँ. वाल्व सक्रियण एक LabVIEW कार्यक्रम से / बंद व्यक्तिगत solenoid वाल्व के लिए जुड़ा स्विच का एक सेट के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है. प्रत्येक स्विच अपनी इसी solenoid वाल्व के माध्यम से एक विशेष नियंत्रण रेखा को नियंत्रित करता है. स्विच बटन (लिपि में) की ओर मुड़ते इसी ट्यूब में हवा के दबाव लागू होगी. हवा के दबाव नियंत्रण रेखा में DDW धक्का और microfluidic वाल्व के विस्तार में परिणाम होगा नीचे चैनल अवरुद्ध जाएगा. बंद एक नियंत्रण वाल्व टर्निंग, हवा का दबाव जारी है और बाद में संबंधित प्रवाह चैनल के अवरुद्ध जारी करेंगे.
- यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी वाल्व खुले हैं, एक प्रवाह जानकारी और 4-5 साई पर डिवाइस में प्रवाह हवा के लिए एक ट्यूब कनेक्ट. यह गिलास स्लाइड से किसी भी चिपचिपा वाल्व जारी करेंगे.
- अंत में, इस डिवाइस primed है और तैयार है. सभी इनपुट और 'गर्दन' वाल्व, सतह के रसायन शास्त्र शुरू बंद.
- सतह पर एक प्रोटीन सरणी के आदेश में आत्म विधानसभा की सुविधा के लिए और microfluidic युक्ति भीतर गैर विशिष्ट सोखना रोकने, सतह रासायनिक संशोधित किया गया है:
- डिवाइस के माध्यम से एक घटक प्रवाह, एक डिवाइस में प्रवाह चैनलों के लिए आवश्यक समाधान के साथ एक नया ट्यूब कनेक्ट. मैनुअल कई गुना करने के लिए ट्यूब के मुक्त पक्ष कनेक्ट और हवा के दबाव प्रवाह (5 साई) खुला.
- एक नया ट्यूब और लगभग डिवाइस के माध्यम से 20 मिनट के लिए इसका आधा प्रवाह में Biotinylated BSA (1 ग्राम / μl) के 40 μl लोड, BSA epoxy सतह के लिए बाध्य होगा.
- HEPES अलग सतह के रसायन शास्त्र कदम के प्रत्येक के बीच unreacted सब्सट्रेट धोने के लिए (50 मिमी) का प्रयोग करें.
- फ्लो शीर्ष पर biotinylated BSA के 20 मिनट के लिए 25 μl Strepavidin (0.5 ग्राम / μl).
- 5 मिनट के लिए HEPES साथ धो लें.
- 'बटन' वाल्व और biotinylated BSA के बाकी (descri रूप प्रवाहऊपर बिस्तर), बटन आसपास सतह passivating.
- 5 मिनट के लिए HEPES साथ धो लें.
- 20 मिनट के लिए 'बटन' वाल्व और प्रवाह penta उसकी बायोटिन की 30 μl (0.16 ग्राम / μl) रिलीज. 'बटन एक विरोधी सरणी उनकी टैग बनाने के तहत क्षेत्र के लिए विशेष रूप से उजागर strepavidin एंटीबॉडी के लिए बाध्य होगा.
5. प्रोटीन अभिव्यक्ति
- डिवाइस पर प्रोटीन व्यक्त खरगोश reticulocyte त्वरित युग्मित प्रतिलेखन और अनुवाद प्रतिक्रिया का उपयोग. डिवाइस पर देखा कृत्रिम जीन से प्रोटीन की अभिव्यक्ति का उपयोग करने के लिए तैयार प्रोटीन की एक सरणी बनाता है. उदाहरण के लिए, एक प्रोटीन बाध्यकारी स्क्रीन के लिए ऐसा ही एक प्रयोग है.
- 'गर्दन' वाल्व और प्रवाह खरगोश reticulocyte त्वरित युग्मित प्रतिलेखन और अनुवाद प्रतिक्रिया डिवाइस के माध्यम से डीएनए के चेंबर में खोलें. अगला, 'सैंडविच' वाल्व बंद करो और अपने वातावरण से प्रत्येक जीन अलग. 30 में 2.5 घंटे के लिए एक गर्म थाली पर डिवाइस सेते डिग्री सेल्सियस एक्सप्रेस्ड किए जाते हैं जनसंपर्कoteins डीएनए कक्ष से कक्ष प्रतिक्रिया (गर्दन वाल्व खुला है) अनायास और बाँध 'बटन' अपनी सी टर्मिनस टैग के माध्यम से प्रोटीन immobilizing वाल्व के तहत विरोधी उनकी एंटीबॉडी के लिए फैलाना होगा.
- सी Myc Cy3 एंटीबॉडी के साथ प्रोटीन लेबल. एंटीबॉडी अपनी इसी एन टर्मिनस प्रोटीन पर स्थित मिलान करने के लिए बाध्य होगा.
- एक माइक्रोएरे (लोकसभा रीलोडेड, Tecan) स्कैनर एक 532 एनएम लेजर और 575 एनएम उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग करने के साथ प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर का निर्धारण करते हैं.
6. प्रतिनिधि परिणाम
1. डिवाइस फेब्रिकेशन
डिवाइस के लिए एक ग्राफिक डिजाइन AutoCAD द्वारा हमारे प्रयोगात्मक जरूरतों के आधार पर बनाया गया था. डिजाइन एक पारदर्शिता फिल्म पर एक उच्च संकल्प छवि सेटर द्वारा मुद्रित किया गया था. यह पारदर्शिता संपर्क photolithography में एक photomask के रूप में कार्य करता है. एक सतह micromachining तकनीक टी पर खुदा पैटर्न द्वारा निर्धारित एक सिलिकॉन वफ़र पर 3-D टेम्पलेट्स बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया थावह मास्क इस्तेमाल किया.
microfluidic युक्ति सिलिकॉन मोल्ड पर निर्मित किया गया था कास्टिंग सिलिकॉन elastomer polydimethylsiloxane (PDMS, 184 SYLGARD, डॉव Corning, संयुक्त राज्य अमरीका) (चित्रा 1). प्रत्येक डिवाइस दो गठबंधन PDMS परतों, प्रवाह और नियंत्रण परत के होते हैं. मोल्ड पहले पकाना कदम के बाद elastomer रिलीज को बढ़ावा देने के लिए 10 मिनट के लिए किया गया था chlorotrimethylsilane वाष्प (TMCS, Aldrich) उजागर करने के लिए. सिलिकॉन आधारित elastomer और इलाज के एजेंट का एक मिश्रण दो अलग अनुपात 05:01 और 20:01, नियंत्रण और प्रवाह molds के लिए क्रमशः में तैयार किया गया था. नियंत्रण परत degassed किया गया था और 80 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पकाया प्रवाह परत शुरू लेपित स्पिन (Laurell, संयुक्त राज्य अमरीका) छब्बीस सौ rpm पर 60 सेकंड के लिए और 80 पर पकाया ° C 30 मिनट के लिए. नियंत्रण परत अपने आचारण से अलग हो गया था और नियंत्रण चैनल का उपयोग छेद मुक्का मारा गया. अगला, प्रवाह और नियंत्रण परतों मैन्युअल एक त्रिविमदर्शी के तहत गठबंधन किया गया और 80 में 2 घंटे के लिए पकाया डिग्री सेल्सियस दो परत डिवाइस च खुली किया गया थारॉम प्रवाह ढालना और प्रवाह चैनल का उपयोग छेद मुक्का मारा गया.
2. डिवाइस विवरण
500 से ऊपर डिवाइस क्षमता 10,000 इकाई कोशिकाओं (2 चित्रा) को लेकर कर सकते हैं. इस उपकरण में दो परतों के होते हैं, प्रवाह परत (ग्रे) और नियंत्रण परत (रंग). नियंत्रण परत विभिन्न समारोह के साथ वाल्व की एक किस्म के होते हैं. प्रवाह परत में प्रत्येक इकाई सेल, एक डीएनए और एक प्रतिक्रिया कक्ष से बना है और micromechanical वाल्व के तीन प्रकार के द्वारा नियंत्रित है, 'गर्दन', 'बटन', और 'सैंडविच' (2A चित्रा). एक दाग्री करना 'कृत्रिम जीन डीएनए कक्ष के भीतर जमा प्रतिक्रिया कक्ष से' गर्दन 'वाल्व (हरा) द्वारा अवरुद्ध है. प्रतिक्रिया कक्ष में सतह बाध्य प्रोटीन फँसाने और यांत्रिक धोने 'बटन' वाल्व (नीला) द्वारा किया जाता है. 'सैंडविच' वाल्व प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए अपने स्वयं के इकाई सेल (लाल) में होने के लिए सक्षम बनाता है. पते वाल्व डिवाइस विभाजित 8 स्वतंत्र वर्गों के लिए विभिन्न के लिए कर सकते हैं,NT के हालत परख. इसके अलावा, नियंत्रण परत इनपुट वाल्व कि प्रवाह परत में चयनित द्रव का प्रवाह सक्षम होते हैं. PDMS नियंत्रण चैनलों DDW साथ पूरा कर रहे हैं. जब एक वाल्व दबाव वृद्धि actuated PDMS के विस्तार में (15 साई) का परिणाम है. स्थानों पर जहां काफी पतली झिल्ली है (यानी नियंत्रण और प्रवाह लाइनों के पार) यह पूरी तरह से प्रवाह लाइन ब्लॉक करने के लिए पर्याप्त है. औसत इकाई सेल ऊंचाई 10 मीटर है, और औसत इकाई सेल की मात्रा कम से कम 1 nl है.
3. प्रोटीन अभिव्यक्ति और जांच
प्रोटीन खरगोश reticulocyte त्वरित युग्मित प्रतिलेखन और अनुवाद प्रतिक्रिया (PROMEGA) का उपयोग डिवाइस पर व्यक्त किया गया. प्रोटीन की अभिव्यक्ति एक बाध्यकारी स्क्रीन में उपयोग के लिए तैयार प्रोटीन (3 चित्रा) की एक सरणी बनाया. एक अभिव्यक्ति मिश्रण (12.5 μl) डिवाइस में लोड किया गया था और फिर 'गर्दन' वाल्व खोलने से डीएनए कक्षों में पानी भर गया. अगला, 'सैंडविच' वाल्व थेप्रत्येक इकाई अपने पड़ोसी की कोशिकाओं और डिवाइस से अलग सेल 2.5 घंटे के लिए एक गर्म थाली पर 30 में incubated जा ° सी. बंद कर दिया जीन कक्ष के माध्यम से व्यक्त प्रतिक्रिया कक्ष है, जहां उनके सी टर्मिनस उनकी टैग बाँध सकता विरोधी उनकी एंटीबॉडी (Qiagen) 'बटन की सतह के लिए प्रोटीन immobilizing वाल्व के तहत स्थानीय में दूर तक फैला हुआ प्रोटीन. प्रोटीन सी Myc (सिग्मा) Cy3, जो अपनी इसी एन टर्मिनस प्रोटीन पर स्थित का मिलान करने के लिए बाध्य है और यह लेबल के साथ लेबल रहे थे. प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर एक माइक्रोएरे (लोकसभा रीलोडेड, Tecan) स्कैनर एक 532 एनएम लेजर और 575 फिल्टर एनएम का उपयोग के साथ निर्धारित किया गया है. परिणामस्वरूप प्रोटीन सरणी प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर पर अलग होते हैं. आमतौर पर, एक जीन पुस्तकालय के बारे में 20% detectable स्तर व्यक्त करने के असफल. प्रोटीन के आकार के साथ कोई संबंध 3 मनाया गया. पृष्ठभूमि स्तर कक्षों कि डीएनए के साथ नहीं देखा गया था का उपयोग कर निर्धारित किया गया है. इस प्रकार, इसी प्रोटीन कक्षों से संकेतों की वजह से या तो पता कर रहे हैंOise या गैर विशिष्ट लेबलिंग एंटीबॉडी के सोखना.
चित्रा 1. चिप निर्माण (ए) Molds 10 मिनट के लिए TMCS वाष्प से इलाज किया गया. (बी) PDMS नियंत्रण और प्रवाह सिलिकॉन molds पर casted है. (सी) दोनों नियंत्रण और प्रवाह molds में 80 डिग्री 30 मिनट के लिए सी पकाया जाता है. (D) नियंत्रण मोल्ड के खुली परत, आकार में कटौती और नियंत्रण inlets छिद्रित हैं. (ई) नियंत्रण परत एक त्रिविमदर्शी के तहत प्रवाह परत करने के लिए गठबंधन किया है और फिर 80 में पकाया ° सी 2 घंटे के लिए. PDMS उपकरण निर्माण के लिए समानांतर में, कृत्रिम जीन की एक श्रृंखला epoxy लेपित ग्लास substrates (सीईएल एसोसिएट्स) पर microarrayed हैं. (एफ) डिवाइस तो डीएनए माइक्रोएरे डीएनए कक्षों के भीतर 'कृत्रिम जीन' को फँसाने के लिए गठबंधन किया है.
चित्रा 2. पिंग डिवाइस की एक फोटो (ए) डिवाइस consi.दो गठबंधन PDMS परतों (नियंत्रण और प्रवाह) के सेंट. प्रवाह परत समानांतर डीएनए और प्रतिक्रिया (ग्रे) कक्षों नियंत्रण परत में micromechanical वाल्व ("बटन", "सैंडविच" और "गर्दन") द्वारा नियंत्रित होता है. (बी) परतें एक मुद्रित माइक्रोएरे प्रोग्राम है जो एक ही स्थान के साथ प्रत्येक डीएनए के चेंबर के लिए गठबंधन कर रहे हैं. यह किसी भी संभावित संक्रमण समाप्त.
चित्रा 3. एक microfluidic चिप के साथ बनाया गया एक प्रोटीन सरणी प्रतिदीप्त छवियाँ मुद्रित हाजिर जीन प्रोटीन (कक्ष में डीएनए) उपकरण के भीतर व्यक्त किया गया और सतह के लिए उनके (प्रतिक्रिया कक्ष में "बटन" वाल्व के नीचे) के माध्यम से नीचे खींच लिया सी टर्मिनस उनकी टैग. प्रोटीन अभिव्यक्ति उनके N-टर्मिनस सी myc टैग और एक विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रतिरक्षी का उपयोग का पता चला था. अलग संकेत तीव्रता अलग प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर का संकेत मिलता है. संयुक्त राष्ट्र धब्बेदार कक्षों पृष्ठभूमि ले लिए नियंत्रण के रूप में सेवावी इ एल एस.
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Discussion
इस पत्र में हम पीढ़ी उच्च throughput में प्रोटीन microfluidic एक मंच का उपयोग करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. सरणी पीढ़ी के मुद्रण माइक्रोएरे डीएनए टेम्पलेट्स पर आधारित है और इन विट्रो microfluidic युक्ति भीतर डीएनए से प्रोटीन अभिव्यक्ति में.
हमारे उपन्यास मंच microfluidic वर्तमान में इस्तेमाल किया तरीकों पर कई महत्वपूर्ण लाभ, जो प्रोटिओमिक्स के लिए एक आशाजनक और सामान्य उपकरण बनाने है. एक लाभ यह झिल्ली बाध्य प्रोटीन के साथ इन विट्रो प्रोटीन संश्लेषण माइक्रोसोमल 11 झिल्ली की उपस्थिति में स्तनधारी reticulocyte lysates का उपयोग है. "जैसी प्राकृतिक" झिल्ली प्रोटीन के लिए आवश्यक शर्तों प्रदान करता है. इसके अलावा, microfluidics बहुत कम मात्रा में प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है और प्रोटीन शुद्धि के लिए आवश्यक नहीं है. पारंपरिक तरीकों में सबसे आम बाधाओं रहे हैं. वास्तव में, प्रोटीन के आगे अनुकूलन इन विट्रो cel में मेल द्वारा प्राप्त किया जा सकता हैमैं उदाहरण के लिए प्रोटीन के लिए, lysate ई. कोलाई जीवाणु प्रोटीन के लिए lysate.
Microfluidics बहुत कम मात्रा में प्रोटीन अभिव्यक्ति की अनुमति देता है. हमारे विशिष्ट उदाहरण में चैम्बर मात्रा 1 nl है. वहाँ दो फायदे की मात्रा कम करने के लिए कर रहे हैं. स्पष्ट एक अभिकर्मकों की कम खपत और दुर्लभ सामग्री (यानी झिल्ली प्रोटीन) के साथ काम करने की क्षमता है है. एक अन्य महत्वपूर्ण लाभ यह है कि इस तरह के एक छोटी मात्रा में एंटीबॉडी के साथ सतह पर प्रोटीन पर ध्यान केंद्रित हमें बातचीत assays के लिए प्रोटीन के अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता, जो परख संवेदनशीलता में वृद्धि होगी हासिल करने के लिए अनुमति देता है.
बटन वाल्व दोहरी भूमिका है. पहले वे patterning के लिए एक एंटीबॉडी का इस्तेमाल कर रहे हैं प्रत्येक कक्ष में बटन के तहत. यह हमें नीचे खींचने के लिए बटन के नीचे ही प्रोटीन, जबकि चैम्बर के बाकी passivated है की अनुमति देता है. दूसरा, बटन यांत्रिक धोने और तरल पदार्थ की एक मात्रा displacing द्वारा प्रोटीन के फँसाने के लिए अनुमति देते हैंजब actuated नीचे. इस धोने और फँसाने मंच की समग्र संवेदनशीलता बढ़ जाती है और कमजोर और क्षणिक आणविक 4 बातचीत का पता लगाने की अनुमति देता है.
अंत में, microfluidic डिवाइस को आसानी से स्वचालित किया जा सकता है और कई समानांतर माप बनाने में सक्षम है. जिससे लागत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से समय की बचत पर. हमारा अनुमान है कि प्रोटीन प्रयोग प्रति लागत पिंग का उपयोग कर प्रोटीन के प्रति मौजूदा 4 युक्ति प्रति 10,000 प्रयोगों को लेकर उपकरणों के साथ के बारे में 2, सेंट है. यह अनुमान निर्माण और सामग्री भी शामिल है. इस प्रकार, पिंग झिल्ली प्रोटीन के लिए जैसे विशिष्ट लाभ के साथ सामान्य रूप में प्रोटीन सरणी के लिए एक मजबूत उपकरण होने की संभावना है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम मैरी क्यूरी अंतरराष्ट्रीय reintegration अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | ESSEX-DC | |
| Chlorotrimethylsilane (TMCS | Sigma-Aldrich | C72854 | |
| Epoxy coated glass substrates | CEL Associates USA | VEPO-25C | |
| Poly ethylene glycole (PEG) | Sigma-Aldrich | 81260 | |
| D-trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531 | |
| Biotinylated-BSA | Pierce, Thermo Scientific | PIR-29130 | |
| Neutravidin | Pierce, Thermo Scientific | 31050 | |
| penta-His-biotin | Qiagen | 34440 | |
| Hepes |  Biological Industries |
03-025-1B | |
| TNT-T7 | Promega Corp. | L5540 | |
| C-myc Cy3 antibody | Sigma-Aldrich | ||
| Control box | Stanford Microfluidics Foundry | ||
| Mold | Stanford Microfluidics Foundry | ||
| Pin | New England Small Tubes Corporation | ||
| Tygon microbore tubing | Tygon | S-54-HL | |
| Microarrayer | Bio Robotics | MicroGrid 610 | |
| Silicone pins | Parallel Synthesis | SMT-S75 |
References
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