Summary
我々は、タンパク質配列の発現のためのマイクロ流体アプローチを提示する。デバイスは、マイクロメカニカルバルブで制御される反応室の数千から構成されています。マイクロ流体デバイスは、マイクロアレイプリント遺伝子ライブラリーに釣り合わせられる。これらの遺伝子は、その後、実験的な使用のための準備ができたタンパク質配列で、その結果、チップ上に転写され、翻訳されています。
Abstract
そのようなシステム生物学など急速に増加フィールドは、大規模なシステムの高スループット、および高忠実度の測定を可能にし、新技術の開発と実装が必要です。マイクロフルイディクスは、生化学生物物理学、およびセルベースアッセイ1を包含する 、このようなオンチップハイスループットスクリーニング実験を行うと、これらの要件の多くを満たすことを約束します。マイクロ流体デバイスの初期の頃から、このフィールドには、抜本的にマイクロ流体大規模集積回路2,3の開発につながる、進化してきました。この技術は、切手サイズのフットプリント（ 図1）を持つ単一のデバイス上のマイクロメカニカルバルブの数千人の統合が可能になります。我々は、タンパク質配列のin vitro発現（ 図2）という名前のPING（タンパク質相互作用ネットワークジェネレータ） で生成するためのハイスループットマイクロ流体プラットフォームを開発しました。これらの配列には、多くの実験のためのテンプレートとして使用できますなどのタンパク質-タンパク質4、タンパク質-RNA 5またはタンパク質-DNA相互作用6。
デバイスは個別にマイクロアレイを使用してプログラムされた反応チャンバー、数千から構成されています。標準マイクロアレイスポッティング技術を使用してマイクロアレイを生成し、また潜在的な汚染や交差反応性を排除し、単一のスポットでマイクロ流体デバイスのプログラムにこれらの印刷されたマイクロアレイの各チャンバを調整することで、タンパク質7、DNAの8、小分子のアレイ化が可能になり、また、非常にモジュール化されさらにコロイド懸濁液。生物科学上のマイクロフルイディクスの潜在的な影響は非常に重要です。マイクロ流体ベースのアッセイの数は、すでに生物学的システムの構造と機能に新たな洞察を提供しており、マイクロ流体工学の分野は、生物学に影響を与えていきます。
Protocol
1。デバイス製造
- スタンフォードマイクロフルイディクスファウンドリー（339 DTPA-D SU-8の制御カビやSPR220-7フロー金型購入www.stanford.edu /グループ/ファウンドリ ）。
- ベーキング手順9の後のエラストマー放出を促進するために10分間クロロトリメチルシラン（TMCS）蒸気にシリコーン型を公開します。
- それぞれ二つの異なる比制御とフロー型では5:1と20:1のシリコーン系エラストマー及び硬化剤（ミックスウェル）の混合物を準備します。異なる比率は、複数の層の適切な接合のために必要である。
- 制御層（約5ミリメートルの高さ）に5時01 PDMSを注ぐ。ドガ制御層と80℃で30分間焼く℃にその後、スピンコート（Laurell、米国）60秒2600 rpmで流動層の上に20時01 PDMSの混合物とは、30分間80℃でそれを焼く。スピンコーター速度は圧力でバルブ駆動に最適化されています15psiの。速い回転は低い活性化圧力とその逆の薄い層になります。我々が使用するデバイスは、基板からの剥離が発生する可能性がありその上に、フロー内のコントロールで25 psiと10 psiの制限があります。
- 金型から制御層を分離する。それはゆっくりとではないにSU8パターンピールように注意してください。その後、制御チャネルにアクセスするために、その周囲とパンチ穴の周り装置を切った。
- ステレオスコープの下に手動でフローと制御層の位置を合わせます。左上隅を合わせてスタート;ボタンバルブ（制御層）が反応室（フロー層）の真ん中にある必要があります。次に、最初の行の位置を合わせて静かに行ごとに制御層の行を解放します。すべてのボタンのバルブは反応室の真ん中に、アドレスと入力バルブが正しい位置に流路を横切ることであることを確認します。すべての行が整列するまでのプロセスは、ローカルに繰り返すことができます。終わりには、PDMS bのいずれかの緊張を解放yが辺や角から慎重に持ち上げ。あまり持ち上げないでください、または位置ずれが発生することがあります。
- 80℃で2時間のためにそれを焼く℃に
- 装置の周囲にカットし、フロー金型から2層デバイス（チップ）をはがします。流路を（ 図1）にアクセスするために穴を開ける。
2。 DNAのアレイ化とデバイスのアライメント
- アセンブリPCRによって合成遺伝子を作り出す。合成遺伝子は、T7プロモーター、リボソーム結合部位（RBS）、2つのエピトープタグ付きORF（両端に1つずつ）、およびT7ターミネーター4の構成されています。遺伝子は5000 bpで、少なくとも、最大100 bpから長さが変化することができます。
- アレーするために合成遺伝子の準備：ポリエチレンオキシドglycole（1.25％）とD-トレハロース二水和物（125 mg / ml）での混合物を準備し、384ウェルプレートに反応あたり2μlを分注する。このソリューションでは、アライメント10の間に可視化のためだけでなく、ガラスへのDNAの不可逆的結合を減らすことができます。 384ウェルプレートに合成遺伝子を転送します。通常DNA濃度は、10〜ng /μLの100 ng /μlに最終濃度の範囲で指定できます。 20μlの（マイクロアレイとピンタイプに依存します）の最終容量にdH 2 Oを追加します。
- マイクロアレイを用いたエポキシコーティングされたガラス基板上に合成一連の遺伝子を発見。我々は、SMT-S75シリコーンピン（パラレル合成、USA）を用いてマイクログリッド610（バイオロボティクス）を使用します。 、これらの特定のピンで、ガラス表面上に約100μmの直径を持つスポットで結果をDNAの印刷にお問い合わせください。各端子の負荷は、約100のスポットで十分です。列と行ピッチが使用される特定のデバイスに対応していることを確認します。我々が使用するデバイスは、16列とそれぞれ320μmで、バイ680μmのピッチで40行が含まれています。
- 手動でステレオスコープ下にある遺伝子の配列にマイクロ流体デバイスの位置を合わせます。 DNAスポットは、DNA室の真ん中にあるべきである。スポットBの最初の行を配置することにより、アライメントを開始DNA室の最初の行をelow。次に、行の残りの部分は、装置全体の微調整でフィニッシュラインに持ち込む。配列が整列されたら注意が局所的にそれを持ち上げることによって、PDMS内の任意のストレスを軽減するために取られるべきである。それはマイクロアレイにうまく結合しないことがあり、PDMSに残って緊張がある場合。
- 最後に、80℃のホットプレート上で一晩インキュベートすることによりスライドガラスに接着する装置を℃に
3。プライミングとデバイスの有効化
- 制御層のバルブは、LabVIEWを使用するコンピュータから作動される。 LabVIEWのスクリプトは、電子制御ボックス（スタンフォードマイクロフルイディクスのFoundry社より購入）を介してソレノイドマイクロ一連の弁を制御します。マニホールド電磁弁には、デバイス上の制御弁への空気の流れや圧力を制御する圧縮空気に接続されている。
- （タイゴン "0.02の内径との柔軟なプラスチック製のチューブを使用して電磁弁マニホールドにデバイスを接続します）とステンレスピン（ニューイングランド小さな管株式会社）。
- DDWで管を埋めると制御層のアクセスホールにピンを挿入します。各チューブは、それに対応する制御チャネルに接続されていることを確認してください。
- 制御チャネルをアクティブにするためにコンピュータ上でLabVIEWアプリケーションを実行します。 LabVIEWのスクリプトからバルブを作動させることによって、私たちは、順番に、PDMS制御チャネルに水をプッシュする空気の圧力を適用する。空気圧5 psiに設定します。これは、欠陥のある機器の制御チャネル間のクロストークを識別するために、最初の 'サンドイッチ'と住所バルブを埋めることをお勧めします。クロストークの場合は、 'サンドイッチ'制御ラインの作動は、首やボタンの制御線のいずれかの作動につながる。これは、電気回路の短絡に似ています。クロストークを持つデバイスが故障していると使用できません。
- すべての制御チャネルとバルブはDDW、バルブがプライミングされるとの理由がいっぱいになった後その下の流路を遮断するDY。 15 psiの空気の圧力を増加させる。バルブの活性化は個々の電磁弁に接続されているオン/オフスイッチのセットを介してLabVIEWプログラムから制御されます。各スイッチは、その対応する電磁弁を介して特定の制御線を制御します。スイッチボタン（スクリプト内の）オンにすると、対応するチューブ内の空気の圧力を適用します。空気圧は、コントロールラインにDDWをプッシュすると、下にチャネルをブロックして、マイクロ流体バルブの拡大になります。コントロールバルブをオフにする、空気の圧力を解放し、その後それぞれの流路の閉塞をリリースする予定です。
- すべてのバルブが開いていることを保証するために、フローの入力と4-5 psiでデバイスに流れ込む空気のいずれかにチューブを接続します。これは、スライドガラスから任意のスティッキバルブをリリースする予定です。
- 最後に、デバイスがプライミングされ、準備されています。表面化学反応を開始するために、すべての入力および '首'バルブを閉じます。
- 表面上のタンパク質配列の自己組織化を促進し、マイクロ流体デバイス内の非特異的吸着を防ぐために、表面が化学修飾されている：
- デバイスを介してコンポーネントを流すためには、装置内流路のいずれかに必要なソリューションを使用して新しいチューブを接続します。手動マニホールドにチューブの自由側を接続して、空気圧の流れ（5 psi）を開きます。
- デバイスを介して20分間、それの約半分を新しいチューブとフローにビオチン化-BSAを40μlの（1μg/μLの）をロードし、BSAはエポキシ表面に結合するであろう。
- 異なる表面化学の各ステップ間の未反応の基質を洗浄するためのHepes（50 mm）を使用。
- ビオチン化-BSAの上に20分間流れ、25μlのストレプトアビジン（0.5μg/μLの）。
- 5分間のHepesで洗ってください。
- 'ボタンバルブを閉じて、ビオチン化-BSAの残りを（descriとして流れるボタンを囲む表面を不動態化する上記のベッド）。
- 5分間のHepesで洗ってください。
- 20分間ペンタのHis-ビオチンの 'ボタン'バルブと流量30μL（0.16μg/μLの）を解放します。抗体は、露出したストレプトアビジンに結合するであろう、具体的には、抗Hisタグ配列を作成する 'ボタンの下の領域に。
5。タンパク質の発現
- ウサギ網状赤血球クイック結合転写と翻訳反応を使用して、デバイス上のタンパク質を発現している。デバイス上の斑点のある合成遺伝子からのタンパク質発現を使用する準備ができたタンパク質の配列を作成します。例えば、一つのそのような使用は、タンパク質結合画面用です。
- DNAのチャンバーにデバイスを介して '首'バルブとフローウサギ網状赤血球クイック結合転写と翻訳反応を開きます。次に、 'サンドイッチ'バルブを閉じて、その環境から各遺伝子を分離します。 30℃で2.5時間、ホットプレート上でデバイスをインキュベート℃に表明PRoteinsはDNA室から反応室自発的に（首のバルブが開いている）とそのC末端タグを介してタンパク質を固定化する 'ボタンバルブ下抗His抗体にバインドするために拡散する。
- c-MycのCy3を抗体でタンパク質を標識。抗体は、タンパク質のN-末端に位置する、その対応するエピトープに結合するであろう。
- 532 nmのレーザー、575 nmの発光フィルターを用いたマイクロアレイスキャナ（LSはリローデッド、テカン）とタンパク質発現レベルを決定します。
6。代表的な結果
1。デバイス製造
デバイスのグラフィックデザインは、我々の実験のニーズに基づいてAutoCADで作成されました。デザインは、高解像度のイメージセッターでOHPフィルムに印刷した。この透明度は、コンタクトフォトリソグラフィにおけるフォトマスクとして機能します。表面マイクロマシニング技術をtに刻まれたパターンによって決まり、シリコンウエハ上に3次元のテンプレートを作成するために使用された彼のマスクは使用しました。
マイクロ流体デバイスは、シリコーンモールド鋳造、シリコーンエラストマー、ポリジメチルシロキサン（PDMS、SYLGARD 184、Dow Corning社、米国）（ 図1）を作製した。各デバイスは、2つの整列PDMS層、フローと制御層から構成されています。金型は、最初のステップの後にベーキングエラストマー放出を促進するために10分間クロロトリメチルシラン（TMCS、Aldrich）を蒸気にさらされていた。シリコーン系エラストマーと硬化剤との混合物は、それぞれ、制御、フロー型の2つの異なる比5:1および20:1にして調製した。制御層は、80℃で脱気して、30分間焼成した。流動層は、最初に60秒間2600 rpmで（Laurell、USA）をスピンコートし、℃で30分間、80℃で焼成した。制御層は、その金型から分離し、制御チャネルアクセス穴が打ち抜いた。次に、フローと制御層は、ステレオスコープの下に手動で整列し、80℃で2時間焼成した℃の2層デバイスは、fをむいたROMフロー金型と流路アクセス穴が打ち抜いた。
2。デバイスの説明
デバイスの容量は、最大500〜10,000単位セル（ 図2）の範囲で指定できます。流動層（灰色）と制御層（カラー）、デバイスは2層から成ります。制御層は、異なる機能を持つバルブの様々が含まれています。流動層内の各単位セルは、一つのDNAと1反応室から構成され、マイクロメカニカルバルブの3つのタイプによって制御されます; '首'、 'ボタン'、および'サンドイッチ'（ 図2A）。 DNAのチャンバー内に堆積斑点 '合成遺伝子は'首 'バルブ（緑）によって、反応室からブロックされています。反応室の表面に結合したタンパク質の捕捉および機械洗浄は 'ボタンバルブ（青色）によって実行されます。 'サンドイッチ'バルブは、独自のユニットセル（赤）で発生するそれぞれの反応を可能にします。アドレス弁はdiffereのために、最大8つの独立したセクションにデバイスを分割することができますntの条件検定。また、制御層は、フロー層に選択の流体の流れを可能にする入力バルブが含まれています。 PDMSの制御チャネルは、DDWでいっぱいです。 PDMSの膨張弁は圧力上昇を作動させる（15 psi）の結果。膜が十分に薄い場所では（つまり、コントロールと流線の交差）これは完全に流線を遮断するのに十分である。平均単位セルの高さは10μmであり、平均単位格子体積は1 NL未満です。
3。タンパク質の発現と検出
タンパク質は、ウサギ網状赤血球クイック結合転写と翻訳反応（Promega）を用いてデバイス上で発現させた。タンパク質の発現は、結合画面で使用できます（ 図3）の準備ができたタンパク質の配列を作成しました。表現ミックス（12.5μl）をデバイスにロードされ、次に '首'バルブを開くことによって、DNA室に殺到した。次に、 'サンドイッチ'バルブがあったその隣接セルやデバイスから分離し、それぞれのユニットセルを30℃2.5時間、ホットプレート上で培養したままに℃に閉店そのC-末端Hisタグが表面にタンパク質を固定化する 'ボタンバルブの下に局在する抗His抗体（Qiagen）を結合することができる反応室に遺伝子室を通って拡散し、発現されたタンパク質、。タンパク質は、タンパク質のN-末端に位置し、それに対応するエピトープに結合し、それをラベル付きのc-MycのCy3（シグマ）で標識した。タンパク質の発現レベルは、532 nmのレーザー、575 nmのフィルターを用いてマイクロアレイスキャナー（LSはリローデッド、Tecan）を用いて測定した。得られたタンパク質配列は、タンパク質の発現レベルを変化させることで構成されています。通常、遺伝子ライブラリーの約20％が検出可能なレベルに発現できない。タンパク質の大きさとの相関は、3を見られなかった。バックグラウンドレベルは、DNAをスポットしていなかったチャンバーを用いて決定した。したがって、対応するタンパク質室からの信号はnのどちらかに起因しているオワーズまたは標識抗体の非特異的吸着。
図1。チップ製造（A）金型は10分間TMCS蒸気で処理した。 （B）は、PDMSは制御およびフローシリコン型にキャストされます。 （C）の制御とフロー型の両方が80℃で30分間で焼いています。 （D）は、金型の剥離制御層は、大きさにカットし、制御口はパンチされます。 （E）の制御層は、ステレオスコープの下に流れ層に整列した後、80で焼い℃で2時間、Cされています。 PDMS装置の製造と並行して、合成遺伝子のシリーズはエポキシコーティングされたガラス基板（CELアソシエイツ）にmicroarrayedされています。 （F）のデバイスは、その後のDNAチャンバー内の "合成遺伝子を"トラッピングDNAマイクロアレイに整列されます。
図2。 ping用装置の写真（A）装置consi2つの整列PDMS層（制御とフロー）のセント。流動層は、制御層でマイクロメカニカルバルブ（ "ボタン"、 "サンドイッチ"と "首"）によって制御並列DNAと反応チャンバー（グレー）が含まれています。 （B）の層がプリントマイクロアレイ、単一のスポットを持つ各DNA室プログラムに整列されます。これは、任意の潜在的な汚染を排除します。
図3。マイクロ流体チップで作成されたタンパク質アレイの蛍光画像。プリントスポット遺伝子は、デバイス内のタンパク質（DNAのチャンバー内）に発現させ、彼らの通って（反応チャンバー内の"ボタン"バルブ下）表面にプルダウンされていたC末端にHisタグ。タンパク質の発現は、それらのc-Myc、N末端タグと特異的な蛍光抗体を用いて検出した。異なる信号強度が異なるタンパク質発現レベルを示す。アン斑点チャンバーは背景LEの対照としてベルス。
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Discussion
本稿では、マイクロ流体プラットフォームを用いた高スループットの世代タンパク質アレイのための方法を提示します。配列の生成は、DNAテンプレートのマイクロアレイ印刷に、マイクロ流体デバイス内でDNAからin vitroでのタンパク質発現に基づいています。
我々の新規マイクロ流体プラットフォームは、プロテオミクスのための有望な、一般的なツールとなっています現在使用されている方法に比べていくつかの重要な利点を持っています。一つの利点は、膜結合タンパク質である。ミクロソーム膜11の存在下で哺乳類の網状赤血球溶解物を用いたin vitroタンパク質合成では 、膜タンパク質を使用するために必要な条件"のような自然"を提供しています。さらに、マイクロフルイディクスは、非常に低いボリュームでタンパク質の発現を可能にし、タンパク質精製の必要はありません。これらは、従来の方法論の中で最も一般的なボトルネックです。実際には、タンパク質のさらなる最適化を in vitro CEL にマッチングすることによって達成することができる例えばタンパク質へリットルライセート、 大腸菌大腸菌は細菌のタンパク質をライセート。
マイクロフルイディクスは、非常に低量のタンパク質の発現を可能にする。私たちの具体的な例では室容積は1 NLです。低いボリュームへの2つの利点があります。明白なものは、下の試薬の消費量や珍しい材料（すなわち膜タンパク質）を操作する機能です。もう1つの重要な利点は、そのような小音量で抗体と表面上のタンパク質を濃縮することは、私たちは、アッセイの感度を増加させる作用アッセイのためのタンパク質の比較的高濃度を達成することができるということです。
ボタンバルブは二重の役割を持っています。まず、彼らは、各チャンバー内のボタンの下に抗体パターニングのために使用されます。これは、チャンバの残りの部分は不動態化されている間、私たちは、唯一のボタンの下にタンパク質をプルダウンすることができます。第二に、ボタンは機械式の液体の体積を変位させて洗浄し、タンパク質の捕捉を可能に作動時に下に。この洗浄とトラップは、プラットフォーム全体の感度が向上し、弱いと一時的な分子間相互作用4の検出を可能にする。
最後に、マイクロ流体デバイスを簡単に自動化し、多くの並列測定を行うことが可能であることができます。それによってコストだけでなく、時間を節約できます。当社の見積もりには、pingを使用してタンパク質実験当たりのコストはデバイスあたり4万の実験までの範囲の現在のデバイスで、タンパク質あたり約2セントであるということです。この見積もりは、製造および資料が含まれています。したがって、PINGは、膜タンパク質のような特定の利点を持つ一般のタンパク質アレイのための強力なツールになる可能性を持っています。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、マリー·キュリー国際社会復帰の助成金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | ESSEX-DC | |
| Chlorotrimethylsilane (TMCS | Sigma-Aldrich | C72854 | |
| Epoxy coated glass substrates | CEL Associates USA | VEPO-25C | |
| Poly ethylene glycole (PEG) | Sigma-Aldrich | 81260 | |
| D-trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531 | |
| Biotinylated-BSA | Pierce, Thermo Scientific | PIR-29130 | |
| Neutravidin | Pierce, Thermo Scientific | 31050 | |
| penta-His-biotin | Qiagen | 34440 | |
| Hepes |  Biological Industries |
03-025-1B | |
| TNT-T7 | Promega Corp. | L5540 | |
| C-myc Cy3 antibody | Sigma-Aldrich | ||
| Control box | Stanford Microfluidics Foundry | ||
| Mold | Stanford Microfluidics Foundry | ||
| Pin | New England Small Tubes Corporation | ||
| Tygon microbore tubing | Tygon | S-54-HL | |
| Microarrayer | Bio Robotics | MicroGrid 610 | |
| Silicone pins | Parallel Synthesis | SMT-S75 |
References
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