Summary
Vi præsenterer en mikrofluid fremgangsmåde til ekspression af protein arrays. Anordningen består af tusinder af reaktionskamre kontrolleres af mikromekaniske ventiler. Den mikrofluid enhed er parret til en microarray-trykte genbibliotek. Disse gener er dernæst transkriberet og translateret on-chip, hvilket resulterer i et protein-array klar til eksperimentel anvendelse.
Abstract
Hastigt stigende områder, såsom systembiologi, kræver udviklingen og gennemførelsen af nye teknologier, så high-throughput og high-fidelity målinger af store systemer. Microfluidics lover at opfylde mange af disse krav, såsom at udføre high-throughput screening eksperimenter på chippen, som omfatter biokemiske, biofysiske og cellebaserede assays 1. Eftersom de tidlige dage af mikrofluidik enheder, har dette felt drastisk udviklet, hvilket fører til udviklingen af mikrofluid stor skala integration 2,3. Denne teknologi giver mulighed for integration af tusindvis af mikromekaniske ventiler på en enkelt enhed med en porto-størrelse fodaftryk (figur 1). Vi har udviklet en high-throughput mikrofluid platform til frembringelse af in vitro-ekspression af protein arrays (fig. 2) navngivne PING (Protein Interaction Network Generator). Disse arrays kan tjene som en skabelon for mange eksperimentersåsom protein-protein-4, protein-RNA 5 eller protein-DNA 6 interaktioner.
Anordningen består af tusinder af reaktionskamre, som er individuelt programmerede under anvendelse af en microarrayer. Justering af disse trykte microarrays til MicroFluidics enheder programmer hvert kammer med en enkelt plet eliminere potentiel kontaminering eller krydsreaktivitet Endvidere genererer microarrays under anvendelse af standard microarray spotting teknikker er også meget modulær, hvilket tillader opstillingsindretningen af proteiner 7, DNA 8, små molekyler, og endda kolloide suspensioner. De potentielle virkninger af mikrofluidik på biologiske videnskaber er betydelig. En række MicroFluidics baserede assays har allerede tilvejebragt hidtil ukendte indsigt i strukturen og funktionen af biologiske systemer, og inden for mikrofluidik vil fortsætte med at påvirke biologi.
Protocol
1. Device Fabrication
- Købt DTPA-D SU-8 kontrol skimmel og SPR220-7 flow mug fra Stanford Microfluidics Foundry ( www.stanford.edu / group / støberi ).
- Udsætte silikoneforme til chlortrimethylsilan (TMCS) damp i 10 minutter til fremme af elastomer frigivelse efter bagetrin 9.
- Der fremstilles en blanding af siliconebaseret elastomer og hærdningsmiddel (bland godt) i to forskellige forhold 5:01 og 20:1 for kontrol og flow forme hhv. De forskellige forhold er nødvendige for korrekt binding af flere lag.
- Hæld 05:01 PDMS om kontrol lag (ca. 5 mm højde). Afgasse kontrollag og bag den i 30 minutter ved 80 ° C. Spin coating (Laurell, USA) i 20:01 PDMS blandingen på strømmen lag ved 2600 rpm i 60 sekunder og derefter bage det ved 80 ° C i 30 minutter. Spin coater hastighed er optimeret til ventilaktivering ved et tryk15 psi. Hurtigere spinding resulterer i et tyndere lag med lavere aktiveringstryk og omvendt. De enheder, vi bruger har en grænse på 25 psi i kontrol og 10 psi i strømmen, over hvilken adskillelse fra underlaget kan forekomme.
- Adskille kontrolområdet laget fra støbeformen. Gør det langsomt og være omhyggelig med ikke at skrælle SU8 mønster. Derefter skæres indretningen langs sin omkreds og hulle at få adgang til styrekanaler.
- Juster flow og kontrolinstanser manuelt under et stereoskop. Starte ved at justere det øverste venstre hjørne, knappen ventilen (kontrollag) skal være i midten af reaktionskammeret (flow lag). Derefter justere den første række og forsigtigt slippe kontrollen lag række for række. Sørge for, at alle de knapper ventiler i midten af reaktionskamrene, og at adresse og input ventiler krydser strømningskanalerne i den korrekte position. Processen kan gentages lokalt, indtil alle rækkerne er tilpasset. Ved udgangen, frigive noget spændinger i PDMS by løfte den forsigtigt fra siderne og hjørner. Må ikke løfte for meget eller forskydning må forekomme.
- Bage det i 2 timer ved 80 ° C.
- Klipning langs kanten af indretningen og skræl de to lag enhed (chip) fra strømmen formen. Hulle at få adgang til strømningskanalerne (figur 1).
2. DNA opstillingsindretningen og Device Alignment
- Fremstilling af syntetiske gener ved montering PCR. De syntetiske gener komponere af T7-promotor, ribosombindingssted (RBS), ORF med to epitopmærker (en i hver ende), og T7-terminator 4. Generne kan variere i længde fra 100 bp op til i det mindste 5000 bp.
- Fremstille de syntetiske gener for opstillingsindretningen: fremstilling af en blanding af polyethylen glycole (1,25%) og D-trehalose-dihydrat (125 mg / ml) og dispensere 2 ul per reaktion i 384 brønde plade. Denne løsning reducerer irreversibel binding af DNA'et til glasset såvel som til visualisering under opretning 10. Overfør syntetiske gener til 384 brønde pladen. Normalt DNA-koncentrationer kan variere fra 10 ng / pi til 100 ng / ul slutkoncentration. Tilføj dH2O til et slutvolumen på 20 ul (afhængig microarrayer og stifter).
- Spotte en række syntetiske gener på epoxy overtrukne glassubstrater anvendelse af en microarrayer. Vi bruger MicroGrid 610 (Bio Robotics) med SMT-S75 silikone stifter (parallel syntese, USA). Kontakt trykning af DNA'et, med disse specifikke stifter, resulterer i pletter med diameter på ca 100 um på glasoverfladen. Hver stift belastning er tilstrækkelig til omkring 100 pletter. Sørg for, kolonne og række pladser svarer til den specifikke anvendte enhed. Enheden vi bruger indeholder 16 kolonner og 40 rækker med en pitch på 680 um ved 320 um, hhv.
- Manuelt tilpasse mikrofluid enhed til gen-array under et stereoskop. Den DNA-del skal være i midten af DNA-kamre. Begynde på tilpasningen ved at placere den første række af spots below den første række af DNA-kamre. Derefter, på tilnærmelse til resten af rækkerne efterbehandling med finjustering af hele indretningen. Når arrayet er justeret skal sørges for at opveje en eventuel stress i PDMS, ved at løfte den lokalt. Hvis der er spænding tilbage i PDMS det kan ikke binde godt til mikroarrayet.
- Endelig binding enheden til objektglasset ved inkubation natten over på en varm plade ved 80 ° C.
3. Priming og Aktivering af Device
- Ventilerne i kontrol laget aktiveres fra computeren ved hjælp LabVIEW. The LabVIEW script styrer en serie af magnetventiler mikro ventiler via en elektronisk styring (købt fra Stanford Microfluidics Foundry). Magnetventilen manifold er forbundet med trykluft, som styrer luftstrømmen og trykket ind reguleringsventilerne på enheden.
- Slut enheden til magnetventiler manifold med en fleksibel plastslange med indvendig diameter på 0,02 "(Tygon) Og rustfrit stål pin (New England Small Tubes Corporation).
- Fylde rørene med DDW og indsætte stiften i for adgang huller kontrollag. Sørge for, at hvert rør er forbundet til den tilsvarende styrekanal.
- Kør LabVIEW applikation på computeren for at aktivere styrekanaler. Ved at aktivere ventilen fra LabVIEW script, anvender vi lufttryk, hvilket vil skubbe vandet i PDMS styrekanaler. Indstille lufttrykket til 5 psi. Det anbefales at fylde den "sandwich" og adressen ventilerne først, for at identificere gensidige forhandlingerne mellem styrekanaler af defekte enheder. I tilfælde af cross-samtaler, vil aktivering af "sandwich" styreledningen føre til aktivering af enten nakken eller knap styreledninger. Dette svarer til et kort i et elektrisk kredsløb. En enhed med krydstale er defekt og kan ikke bruges.
- Efter alle styrekanaler og ventiler er fyldt med DDW, er ventilerne primet og ready at blokere strømningskanalerne nedenunder dem. Øges lufttrykket til 15 psi. Ventil aktivering styres fra et LabVIEW program gennem et sæt on / off kontakter tilsluttet de enkelte magnetventiler. Hver omskifter styrer en specifik styreledning via dens tilsvarende magnetventil. Tænd på kontakten knappen (i scriptet) finder anvendelse lufttrykket i det tilsvarende rør. Lufttrykket vil skubbe DDW i styreledningen og vil resultere i udvidelse af mikrofluide ventiler, blokerer kanalen nedenunder. Slukke en styreventil, vil frigive lufttrykket og efterfølgende frigive blokering af den respektive strømningskanal.
- For at sikre, at alle ventiler er åbne, skal du tilslutte et rør til en af flow input og flow luft ind i enheden på 4-5 psi. Dette vil frigøre eventuelle klæbende ventiler fra objektglasset.
- Endelig er indretningen primet og klar. Lukke alle input og "halsen" ventiler, for at starte overfladekemi.
- For at lette selvsamling af et protein-array på overfladen og forhindre ikke-specifik adsorption i mikrofluid anordning er overfladen kemisk modificerede:
- At strømme en komponent gennem indretningen, tilsluttes et nyt rør med den nødvendige opløsning til en af strømningskanalerne i indretningen. Forbind den frie side af røret til den manuelle manifold og åbne lufttryk flow (5 psi).
- Load 40 pi af biotinyleret-BSA (1 pg / pl) i et nyt rør og strømmer omtrent halvdelen af den i 20 minutter gennem indretningen, vil BSA binde til epoxyoverflade.
- Brug Hepes (50 mM) til vask uomsat substrat mellem hver af de forskellige overfladekemi trin.
- Flow 25 pi Strepavidin (0,5 pg / pl) i 20 minutter på toppen af biotinyleret-BSA.
- Vask med Hepes i 5 min.
- Lukke "knap" ventil og strømme resten af biotinyleret-BSA (som beskreseng ovenfor), passivering af overfladen omkring knappen.
- Vask med Hepes i 5 min.
- Slip "knap" ventil og flow 30 fil af penta-His-biotin (0,16 pg / pl) i 20 min. Antistoffet vil binde til den frilagte strepavidin, specifikt til området under "knap" skabe en anti His-tag array.
5. Proteinekspression
- Udtrykke proteinerne på enheden under anvendelse af kanin-reticulocyt praktiske koblet transkriptions-og translationsreaktion. Proteinekspression fra de plettede syntetiske gener på enheden skaber en række proteiner, klar til brug. For eksempel er en sådan anvendelse for en proteinbindende skærm.
- Åbn "halsen" ventiler og flow kaninreticulocyt hurtig koblet transkription og translation reaktion gennem indretningen i DNA kammeret. Dernæst lukke "sandwich" ventiler og adskille hvert gen fra sine omgivelser. Inkuber enheden på en varmeplade i 2,5 timer ved 30 ° C. Udtrykt proteins vil diffundere fra DNA kammeret til reaktionskammeret spontant (hals ventilen er åben), og binder til anti-His-antistof under "knap" ventil immobilisering af proteinet gennem sin C-terminal tag.
- Mærke de proteiner med C-myc Cy3 antistof. Antistoffet vil binde til dets tilsvarende epitop placeret på protein N-terminus.
- Bestemme proteinekspressionsniveauer med en microarray scanner (LS Reloaded, Tecan) under anvendelse af en 532 nm laser og 575 nm emissionsfilter.
6. Repræsentative resultater
1. Device Fabrication
Et grafisk design til enheden blev oprettet af AutoCAD baseret på vores eksperimentelle behov. Designet blev trykt på en transparent film med en høj opløsning billede setter. Denne transparens tjener som en fotomaske i kontakt fotolitografi. En overflade micromachining teknik blev brugt til at skabe 3-D skabeloner på en siliciumskive bestemt af de mønstre optaget på than masker anvendes.
Den mikrofluid anordning blev fremstillet på silikone formstøbning silikoneelastomer polydimethylsiloxan (PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, USA) (figur 1). Hver anordning består af to tilpassede PDMS lag, strømmen og kontrollag. Formen blev først udsat for chlortrimethylsilan (TMCS, Aldrich) damp i 10 minutter til fremme af elastomer frigivelse efter bagetrin. En blanding af silikone elastomer og hærdningsmiddel blev fremstillet i to forskellige forhold 5:1 og 20:1 til styring og flow forme hhv. Kontrol lag blev afgasset og bages i 30 minutter ved 80 ° C. Strømmen lag blev begynde spinde coated (Laurell, USA) ved 2600 rpm i 60 sekunder og bagt ved 80 ° C i 30 min. Kontrol lag skilles fra sin støbeform og styrekanal adgang huller blev udstanset. Dernæst blev de flow og kontrol lag justeret manuelt under et stereoskop og bagt i 2 timer ved 80 ° C. De to lag enhed blev skrællet from strømmen mug og strømningskanaler adgang huller blev udstanset.
2. Device Description
Enhedens kapacitet kan variere fra 500 op til 10.000 enhedsceller (figur 2). Anordningen består af to lag, flow lag (grå) og kontrollag (farve). Kontrol lag indeholde en række forskellige ventiler med forskellig funktion. Hver enhedscelledel i strømmen lag, består af et DNA og en reaktionskammer og styres af tre typer af mikromekaniske ventiler, "halsen", "knap", og "sandwich" (figur 2A). En plettet "syntetisk gen" deponeret i DNA kammeret er blokeret fra reaktionskammeret ved "halsen" ventil (grøn). Trapping og mekanisk vask af overfladen bundne proteiner i reaktionskammeret udføres ved at knappen ventil (blå). Den "sandwich"-ventil muliggør hver reaktion at forekomme i sin egen enhedscelle (rød). Adressen ventiler kan opdele enheden op til 8 uafhængige sektioner, for Forskelnt tilstand assay. Desuden indeholder den kontrollag input ventiler, der muliggør strømningen af valgte fluidum ind i strømmen lag. PDMS styrekanaler er fyldt med DDW. Når en ventil aktiveres trykstigningen (15 psi) resulterer i udvidelse af PDMS. På steder, hvor membranen er tilstrækkeligt tyndt (dvs. passage af kontrol-og flydelinier) er dette tilstrækkeligt til helt at blokere strømningsledningen. Gennemsnitlig enhed celle højde er 10 um, og den gennemsnitlige enhed celle volumen er mindre end 1 nl.
3. Proteiner Ekspression og Detection
Proteiner blev udtrykt på enheden ved hjælp af kanin-reticulocyt praktiske koblet transkriptions-og translationsreaktion (Promega). Ekspressionen af proteinerne skabt et array af proteiner klar til brug i en bindende skærmbillede (figur 3). Et udtryk mix (12,5 ul) blev indlæst i enheden og derefter oversvømmet ind i DNA-kamre ved at åbne "halsen" ventiler. Næste, "sandwich" ventiler varlukket forlader hver enhedscelledel adskilles fra naboceller og anordningen blev inkuberet på en varmeplade i 2,5 timer ved 30 ° C. Udtrykte proteiner diffunderes gennem genet kammeret i reaktionskammeret, hvor deres C-terminal His-tag kunne binde anti-His-antistof (Qiagen) lokaliseret under "knap" ventil immobilisering af proteinet til overfladen. Proteiner blev mærket med et C-myc Cy3 (Sigma), der bundet til dens tilsvarende epitop placeret på protein N-terminus og mærket den. Proteinekspressionsniveauer blev bestemt med et microarray scanner (LS Reloaded, Tecan) under anvendelse af en 532 nm laser og 575 nm filter. Det resulterende protein-array består af varierende niveauer af proteinekspression. Sædvanligvis omkring 20% af et genbibliotek ikke udtrykker til påviselige niveauer. Ingen sammenhæng med protein størrelse blev observeret 3. Baggrundsniveauer blev bestemt ved anvendelse kamre, der ikke blev plettet med DNA. Således signaler fra det tilsvarende protein kamre skyldes enten nOise eller ikke-specifik adsorption af mærkning af antistoffer.
Figur 1. Chip Fabrication. (A) Forme blev behandlet med TMCS dampe i 10 min. (B) PDMS er støbt på kontrol og flow silicium forme. (C) Både kontrol-og flow forme bages i 80 ° C i 30 minutter. (D) kontrol laget skrællet af formen, skæres til størrelse og kontrol indløb udstanses. (E) kontrollag er tilpasset til flow lag under et stereoskop og derefter bagt i 80 ° C i 2 timer. Parallelt med PDMS enhed fabrikation, er en serie af syntetiske gener mikroarrayet på epoxy-overtrukket glas substrater (CEL Associates). (F) Den enhed bliver derefter tilpasset til DNA microarray fange de »syntetiske gener« i DNA-kamre.
Figur 2. Et Foto af PING Device. (A) Enheden consist af to tilpassede PDMS lag (kontrol og flow). Strømmen lag indeholder parallelle DNA og reaktionskamre (grå) kontrolleres af mikromekaniske ventiler ("knap", "sandwich" og "hals") i kontrollag. (B) Lagene justeret til en trykt mikroarray, hvilke programmer hver DNA-kammer med en enkelt plet. Dette eliminerer enhver potentiel forurening.
Figur 3. Fluorescerende billeder af et protein array oprettet med en mikrofluid chip. De trykte stedet gener blev udtrykt til proteiner i indretningen (i DNA-kammeret) og blev trukket ned til overfladen (under "knap" ventil i reaktionskammeret) gennem deres C-terminal His-tag. Proteinekspression blev påvist ved hjælp af deres C-myc N-terminal tag og et specifikt fluorescerende antistof. Forskellige signalintensiteter angiver forskellige proteinekspressionsniveauer. Un-spotted kamre tjente som kontroller for baggrunden leVels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne afhandling præsenterer vi en metode til generation protein arrays i high-throughput ved hjælp af en mikrofluid platform. Array generation er baseret på microarray trykning af DNA-skabeloner og in vitro protein-ekspression fra DNA i mikrofluid enhed.
Vores hidtil ukendte microfluidic platform har flere vigtige fordele i forhold til tiden anvendte metoder, som gør det lovende og generelt værktøj til proteomics. En fordel er med membranbundne proteiner. In vitro proteinsyntese ved hjælp af mammale reticulocytlysater i nærvær af mikrosomale membraner 11 tilvejebringer "naturligt lignende" betingelser for membranproteiner. Endvidere mikrofluidik tillader proteinekspression i meget små mængder og proteinoprensning er ikke nødvendig. Disse er de mest almindelige flaskehalse i konventionelle metoder. Faktisk kan yderligere optimering af proteiner opnås ved at matche in vitro cell lysat til proteinerne, for eksempel E. coli lysat for bakterielle proteiner.
Microfluidics tillader proteinekspression i meget små mængder. I vores konkrete eksempel kammeret volumen er 1 nl. Der er to fordele ved at de lave volumener. Det oplagte er lavere forbrug af reagenser og evne til at arbejde med sjældne materialer (dvs. membranproteiner). En anden væsentlig fordel er, at koncentrere proteinerne på overfladen med antistoffer i et så lille volumen tillader os at opnå relativt høje koncentrationer af proteiner til interaktion assays, hvilket vil forøge assayets følsomhed.
Knappen ventiler har dobbelt rolle. Først de anvendes til mønsterdannelse et antistof under knappen i hvert kammer. Dette giver os mulighed for at trække ned proteinerne kun under knapperne, mens resten af kammeret er passiveret. Dels knapperne muliggør mekanisk vask og indfangning af proteinerne ved at forskyde et væskevolumennedenunder, når de aktiveres. Denne vask og indfangning øger den samlede sensitivitet af platformen og muliggør påvisning af svage og forbigående molekylære interaktioner 4.
Endelig kan mikrofluid enhed nemt være automatiseret og er i stand til at gøre mange parallelle målinger. Hvorved der spares på omkostningerne samt tid. Vores estimat er, at omkostningerne per protein eksperiment ved hjælp PING er omkring 2 cents per protein, med det nuværende udstyr lige op til 10.000 eksperimenter pr enhed 4. Dette skøn omfatter fabrikation og materialer. Således PING har potentialet til at være et robust middel til protein-array generelt med særlige fordele såsom for membranproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Marie Curie international reintegrationsstipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | ESSEX-DC | |
| Chlorotrimethylsilane (TMCS | Sigma-Aldrich | C72854 | |
| Epoxy coated glass substrates | CEL Associates USA | VEPO-25C | |
| Poly ethylene glycole (PEG) | Sigma-Aldrich | 81260 | |
| D-trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531 | |
| Biotinylated-BSA | Pierce, Thermo Scientific | PIR-29130 | |
| Neutravidin | Pierce, Thermo Scientific | 31050 | |
| penta-His-biotin | Qiagen | 34440 | |
| Hepes |  Biological Industries |
03-025-1B | |
| TNT-T7 | Promega Corp. | L5540 | |
| C-myc Cy3 antibody | Sigma-Aldrich | ||
| Control box | Stanford Microfluidics Foundry | ||
| Mold | Stanford Microfluidics Foundry | ||
| Pin | New England Small Tubes Corporation | ||
| Tygon microbore tubing | Tygon | S-54-HL | |
| Microarrayer | Bio Robotics | MicroGrid 610 | |
| Silicone pins | Parallel Synthesis | SMT-S75 |
References
- Maerkl, S. J. Integration column: Microfluidic high-throughput screening. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 1, 19-29 (2009).
- Hong, J. W., Quake, S. R. Integrated nanoliter systems. Nature. 21, 1179-1183 (2003).
- Unger, M. A Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks. Nature. 6, 71-74 (2009).
- Einav, S. Discovery of a hepatitis C target and its pharmacological inhibitors by microfluidic affinity analysis. Nature. 26, 1019-1027 (2008).
- Fordyce, P. M. De novo identification and biophysical characterization of transcription-factor binding sites with microfluidic affinity analysis. Nature Biotechnology. 28, 962-967 (2010).
- Zhu, H. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science (New York, N.Y.). 293, 2101-2105 (2001).
- Ramachandran, N. Self-assembling protein microarrays. Science (New York, N.Y.). 305, 86-90 (2004).
- Zhong, J. F. A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells. Lab on a chip. 8, 68-74 (2008).
- Kusnezow, W., Hoheisel, J. D. Solid supports for microarray immunoassays. Journal of molecular recognition JMR. 16, 165-176 (2003).
- Lundin, M., Monne, M., Widell, A., Von Heijne, G., Persson, M. A. A. Topology of the membrane-associated hepatitis C virus protein NS4B. Journal of virology. 77, 5428 (2003).
