Summary
Vi presenterer en microfluidic tilnærming for uttrykket av protein arrays. Enheten består av tusenvis av reaksjonskamrene som er kontrollert av mikro-mekaniske ventiler. Microfluidic enheten er koblet til en microarray-trykt genet bibliotek. Disse genene er deretter transkribert og oversatt on-chip, som resulterer i et protein matrise klar for eksperimentell bruk.
Abstract
Raskt økende felt, for eksempel systembiologi, kreve utvikling og implementering av ny teknologi, slik at høy gjennomstrømming og hi-fi målinger av store systemer. MicroFluidics lover å oppfylle mange av disse kravene, for eksempel utføre høy gjennomstrømming screening eksperimenter on-chip, som omfatter biokjemiske, biofysiske og celle-baserte analyser 1. Siden de tidlige dagene av MicroFluidics enheter, har dette feltet drastisk utviklet seg, noe som fører til utvikling av microfluidic storskala integrasjon 2,3. Denne teknologien gjør det mulig for integrering av tusenvis av mikromekaniske ventiler på en enkelt enhet med en porto-sized fotavtrykk (figur 1). Vi har utviklet en high-throughput microfluidic plattform for å generere in vitro uttrykk for protein arrays (figur 2) heter PING (Protein Interaction Network Generator). Disse matriser kan tjene som en mal for mange eksperimenterslik som protein-protein 4, protein-RNA 5 eller protein-DNA 6 interaksjoner.
Enheten består av tusener av reaksjonskamrene som er individuelt programmert ved hjelp av en microarrayer. Samkjøre disse trykte microarrays til MicroFluidics enheter programmer hvert kammer med et enkelt sted å eliminere potensiell forurensning eller kryss-reaktivitet Videre genererer microarrays med standard microarray fange teknikker er også svært modulær, noe som åpner for oppstillingsanordningen av proteiner 7, 8 DNA, små molekyler, og selv kolloidale suspensjoner. Den potensielle effekten av MicroFluidics på biologiske vitenskaper er betydelig. En rekke MicroFluidics baserte analyser har allerede gitt ny innsikt i struktur og funksjon av biologiske systemer, og feltet av MicroFluidics vil fortsette å påvirke biologi.
Protocol
1. Enhet Fabrication
- Kjøpt DTPA-D SU-8 kontroll mold og SPR220-7 flyt mold fra Stanford MicroFluidics Foundry ( www.stanford.edu / gruppe / støperi ).
- Avdekke silikon formene til klortrimetylsilan (TMCs) damp i 10 minutter for å fremme elastomer utgivelse etter baking trinn 9.
- Lag en blanding av silikon elastomer og herder (bland godt) i to forskjellige forhold 5:01 og 20:01 for kontroll og flyt molds, henholdsvis. De forskjellige forhold er nødvendige for riktig binding av flere lag.
- Hell 05:01 PDMS på kontroll lag (ca. 5 mm høyde). Degas kontroll laget og bake den i 30 minutter ved 80 ° C. Spin frakk (Laurell, USA) den 20:01 PDMS blandingen på flyten laget på 2600 opm i 60 sek og deretter bake det ved 80 ° C i 30 min. Spin belegningsinnretning hastigheten er optimalisert for ventilaktivering ved et trykkav 15 psi. Raskere spinnende vil resultere i et tynnere lag med lavere aktivering trykk og omvendt. Enhetene vi bruker har en grense på 25 psi i kontrollgruppen og 10 psi i flyten, over hvilket løsgjøring fra substratet kan forekomme.
- Separer styrelaget fra formen. Gjør det langsomt og være forsiktig for ikke å skrelle Su8 mønster. Deretter kuttet enheten rundt omkretsen og hullene å få tilgang til kontroll kanaler.
- Juster flyt og kontroll lag manuelt under en stereoscope. Start med å rette inn øvre venstre hjørne, knappen ventilen (styrelaget) må være i midten av reaksjons-kammeret (flow layer). Deretter justerer den første raden og forsiktig slipper kontrollen lag rad for rad. Sørge for at alle knappen ventiler er i midten av reaksjons-kammer og at adressen og innspill ventiler krysser strømningskanalene ved den korrekte posisjon. Prosessen kan gjentas lokalt inntil alle radene er justert. På slutten, slipper noen spenning i PDMS by løfte den forsiktig fra sidene og hjørnene. Ikke løft for mye eller forskyvning kan forekomme.
- Bake den i 2 timer ved 80 ° C.
- Skjær rundt kanten av enheten og skall av to lag enheten (chip) fra strømmen mold. Punch hull for å få tilgang strømningskanalene (figur 1).
2. DNA oppstillingsanordningen og Device Alignment
- Produsere syntetisk gener ved montering PCR. De syntetiske gener komponere av T7 promoteren, ribosombindingssetet (RBS), ORF med to epitop tagger (en i hver ende), og T7 terminator 4. Genene kan variere i lengde fra 100 bp opp til, minst, 5000 bp.
- Klargjør syntetiske gener for oppstillingsanordningen: forberede en blanding av poly etylen glycole (1,25%) og D-trehalose dihydrat (125 mg / ml) og 2 ul dispense per reaksjon inn 384 brønner plate. Denne løsningen vil redusere irreversibel binding av DNA til glasset, samt for visualisering under innretting 10. Overfør syntetiske gener til 384 brønner plate. Sendes DNA konsentrasjoner kan variere fra 10 ng / pl til 100 ng / ul sluttkonsentrasjon. Legg dH 2 O til et endelig volum på 20 pl (avhenger microarrayer og pin-type).
- Spot en serie av syntetiske gener bort epoksybelagt glass substrater ved hjelp av en microarrayer. Vi bruker MicroGrid 610 (Bio Robotics) med SMT-S75 silikon pins (Parallel Synthesis, USA). Kontakttrykking av DNA, med disse spesifikke pins, resulterer i flekker med diameter på omtrent 100 mikrometer på glassoverflaten. Hver pin belastning er nok til ca 100 plasser. Sørg for kolonne og rad plasser samsvare med den spesifikke enheten som brukes. Enheten vi bruker inneholder 16 kolonner og 40 rader med en pitch på 680 mikrometer ved 320 mikrometer, henholdsvis.
- Manuelt justere microfluidic enheten til genet matrise under en stereoscope. DNA spot bør være i midten av de DNA kamre. Starte justeringen ved å finne den første raden av flekker below den første raden av DNA kamre. Deretter bringer inn linje resten av radene etterbehandling med fininnstilling av hele enheten. Når matrisen er justert forsiktighet bør tas for å lindre eventuelle stress i PDMS, ved å løfte den lokalt. Hvis det er spenning igjen i PDMS kan det ikke bindingen godt til microarray.
- Endelig binde enheten til glass lysbilde ved inkubering over natten på en kokeplate ved 80 ° C.
3. Grunning og Aktivering av Device
- Ventilene i kontrollgruppen laget aktiveres fra datamaskinen ved hjelp av LabVIEW. LabVIEW script styrer en rekke magnetventiler mikro ventiler via en elektronisk kontroll boks (kjøpt fra Stanford MicroFluidics Foundry). Magnetventil manifolden er koblet til trykkluft, som kontrollerer luftstrømmen og trykk til reguleringsventilene på enheten.
- Koble enheten til magnetventilene manifold med et fleksibelt plastrør med innvendig diameter på 0,02 "(Tygon) Og rustfritt stål pin (New England Lie Tubes Corporation).
- Fyll rørene med DDW og sett pinnen inn i tilgangshullene av kontroll laget. Kontroller at hvert rør er koblet til den tilsvarende styrekanal.
- Kjør LabVIEW programmet på datamaskinen for å aktivere kontroll kanaler. Ved å aktivere ventilen fra LabVIEW script, bruker vi lufttrykk, som igjen vil presse vannet inn i PDMS kontroll kanaler. Still lufttrykket til 5 psi. Det anbefales å fylle 'sandwich "og adresselinjene ventilene først, for å identifisere kryss-samtaler mellom styrekanaler av defekte enheter. Ved kryss-samtaler, vil aktuering av 'sandwich styreledning føre til aktivering av enten halsen eller knapp styreledninger. Dette ligner på en kort i en elektrisk krets. En enhet med krysstale er defekt og kan ikke brukes.
- Etter alle styrekanaler og ventiler er fulle av DDW, er ventilene primet og ready å blokkere strømningskanalene under dem. Øk lufttrykket til 15 psi. Ventil aktivering styres fra en LabVIEW programmet gjennom et sett av av / på brytere som er koblet til den enkelte magnetventiler. Hver bryter styrer en bestemt kontroll linje gjennom den tilhørende magnetventil. Slå på bryteren knappen (i skriptet) vil gjelde lufttrykket i tilsvarende rør. Lufttrykket vil presse DDW i styreledningen og vil resultere i utvidelse av microfluidic ventiler, blokkerer kanalen under. Slå av en reguleringsventil, vil frigi lufttrykket og senere frigjøre blokkering av den respektive strømningskanal.
- For å sikre at alle ventiler er åpne, kobler et rør til en av strømnings innganger og Strøm Luft i enheten når 4-5 psi. Dette vil frigjøre noen klebrige ventiler fra glass-slide.
- Endelig er anordningen primet og klar. Lukke hele inngangen og 'hals' ventiler, for å starte overflatekjemi.
- For å lette den selv-montering av et protein matrise på overflaten og å hindre ikke-spesifikk adsorpsjon i microfluidic enheten, overflaten kjemisk modifisert:
- Å strømme en komponent gjennom enheten, kobler et nytt rør med den nødvendige oppløsning til en av strømningskanalene i enheten. Koble fri siden av røret til den manuelle manifolden og åpne lufttrykket flyt (5 psi).
- Last 40 ul biotinylert-BSA (1 ug / ul) i et nytt rør og strøm ca halvparten av det i 20 minutter gjennom enheten, vil binde seg til BSA epoxy overflaten.
- Bruk Hepes (50 mM) for vasking ureagert substrat mellom hver av de ulike overflatekjemi trinn.
- Flow 25 pl Strepavidin (0,5 ug / ul) i 20 minutter på toppen av biotinylert-BSA.
- Vask med Hepes i 5 min.
- Lukk-knappen "ventilen og strømme resten av biotinylert-BSA (som beskrevetseng ovenfor), passiverende overflaten omgir knappen.
- Vask med Hepes i 5 min.
- Slipp-knappen "ventilen og flyt 30 pl av penta-His-biotin (0,16 ug / ul) i 20 min. Antistoffet vil binde seg til den eksponerte strepavidin; spesifikt til området under 'knappen' skape en anti His-tag array.
5. Protein Expression
- Uttrykke proteiner på enheten ved hjelp av kanin retikulocytt rask kombinert transkripsjon og oversettelse reaksjon. Protein uttrykk fra den flekkete syntetiske gener på enheten oppretter en rekke proteiner klar til bruk. For eksempel, er en slik bruk for en proteinbinding skjerm.
- Åpne 'nakke' ventiler og flyt kanin reticulocyte rask kombinert transkripsjon og oversettelse reaksjon gjennom enheten i DNA kammeret. Deretter lukker de 'sandwich' ventiler og skille hvert gen fra sitt miljø. Inkuber enheten på en kokeplate for 2,5 timer ved 30 ° C. Uttrykt proteins sprer fra DNA kammer til reaksjonskammeret spontant (nakke ventilen er åpen) og binder seg til anti-His antistoff under 'knappen' ventilen immobilisering av den protein gjennom sin C-terminus tag.
- Merke proteiner med C-myc Cy3 antistoff. Antistoffet vil binde seg til sitt tilsvarende epitop lokalisert ved proteinets N-terminus.
- Bestem protein expression nivåer med en microarray scanner (LS Reloaded, Tecan) med en 532 nm laser og 575 nm utslipp filter.
6. Representant Resultater
1. Enhet Fabrication
En grafisk design for enheten ble opprettet av AutoCAD basert på våre eksperimentelle behov. Utformingen ble trykt på en transparent film av en høyoppløselig bilde setter. Denne transparens fungerer som en fotomaske i kontakt fotolitografi. En overflate mikromaskinering teknikken ble brukt til å lage 3-D maler på en silisiumskive bestemmes av mønstrene innskrevet på than masker brukt.
Microfluidic enheten ble fabrikkert på silikon mold casting silikonelastomer polydimetylsiloksan (PDMS, 184 SYLGARD, Dow Corning, USA) (figur 1). Hver enhet består av to innrettede PDMS lag, flyten og kontrollgruppen laget. Støpeformen ble først utsatt for klortrimetylsilan (TMCs, Aldrich) damp i 10 minutter for å fremme elastomer versjon Etter baking trinnene. En blanding av silikon-basert elastomer og herdemiddel ble fremstilt i to forskjellige 5:1 og 20:1 for kontrollen og strømningsverdier muggsopp, henholdsvis. Kontrollen laget ble avgasset og bakt i 30 minutter ved 80 ° C. Flyten laget ble opprinnelig spinne belagt (Laurell, USA) ved 2600 rpm i 60 sek og bakt ved 80 ° C i 30 min. Kontrollen ble separert fra mold sin og styrekanal tilgangshullene ble hulles. Deretter ble strømnings og kontroll lag justert manuelt under en stereoskop og bakt i 2 timer ved 80 ° C. De to lag enhet ble skrelt from flyten mugg og flyt tilgang til kanaler hull ble stanset.
2. Device Description
Enheten kapasitet kan variere fra 500 til 10 000 enheter celler (figur 2). Enheten består av to lag; flyt lag (grå) og kontroll lag (farge). Kontrollen laget inneholder en rekke ventiler med forskjellig funksjon. Hver enhet celle, i flyten laget, er sammensatt av en DNA og en reaksjonskammer og er kontrollert av tre typer mikromekaniske ventiler; 'hals', 'knappen', og 'sandwich' (Figur 2A). En flekket 'syntetisk gen' avsatt innenfor DNA kammeret blokkert fra reaksjonskammeret av 'halsen' ventil (grønn). Overtrykk og mekanisk vasking av overflaten bundne proteinene i reaksjonskammeret blir utført ved 'knappen' ventil (blå). Den 'sandwich "ventilen muliggjør hver reaksjon oppstår i sin egen enhetscellen (rød). Adresseformatene ventiler kan splitte enheten opp til 8 uavhengige seksjoner, for different tilstand analysen. I tillegg styrelaget inneholde inndata ventiler som tillater drenering av valgte fluid inn flyten laget. De PDMS kontroll kanaler er fulle med DDW. Når en ventil betjenes trykkøkningen (15 psi) resulterer i utvidelse av PDMS. På steder hvor membranen er tynn nok (dvs. krysset av kontroll og strømningsledninger) dette er tilstrekkelig til å fullstendig blokkere turledningen. Gjennomsnitt enhetscellen høyde er 10 um, og gjennomsnittlig enhetscellen volumet er mindre enn 1 nl.
3. Proteiner Expression og Detection
Proteiner ble uttrykt på enheten ved hjelp av kanin retikulocytt rask kombinert transkripsjon og oversettelse reaksjon (Promega). Uttrykket av proteinene skapte en rekke proteiner klare for bruk i en bindende (figur 3). Et uttrykk mix (12,5 ul) ble lastet inn i enheten og deretter oversvømmet i DNA kamre ved å åpne 'hals' ventiler. Neste, var 'sandwich' ventilerlukket forlate hver enhetscelle separert fra sine nabocellene og enheten ble inkubert på en varm plate for 2,5 timer ved 30 ° C. Uttrykte proteiner diffundert gjennom genet kammeret inn i reaksjonskammeret, hvor deres C-terminus Hans tag kunne binde anti-His antistoff (Qiagen) lokalisert under 'knappen' ventilen immobilisering protein til overflaten. Proteiner ble merket med en C-MYC Cy3 (Sigma), som er bundet til sitt tilsvarende epitop lokalisert ved proteinets N-terminus og merkes det. Protein uttrykk nivåer ble bestemt med en microarray scanner (LS Reloaded, Tecan) med en 532 nm laser og 575 nm filter. Den resulterende protein array består av varierende nivåer av protein uttrykk. Sendes, ca 20% av et gen-bibliotek unnlater å uttrykke til påvisbare nivåer. Ingen sammenheng med protein størrelse ble observert tre. Bakgrunnsnivå ble bestemt ved hjelp av kamre som ikke ble oppdaget med DNA. Således, kan signaler fra de tilsvarende protein kamre skyldes enten noise eller ikke-spesifikk adsorpsjon av merking antistoffer.
Figur 1. Chip Fabrication. (A) ble behandlet med Trykkmaskiner TMCs damper i 10 min. (B) PDMS er støpt på kontroll og flyt silisium muggsopp. (C) både kontroll og flyt muggsopp er bakt i 80 ° C i 30 min. (D) Den styrelaget skrelles av formen, skåret i størrelse og kontroll innløp stanses. (E) Den styrelaget er justert til flyten laget under en stereoskop og deretter bakt i 80 ° C i 2 timer. Parallelt med PDMS enheten fabrikasjon, er en serie av syntetiske gener microarrayed på epoxy belagt glass substrater (CEL Associates). (F) Enheten blir så justert til DNA microarray fangst av 'syntetiske gener' innenfor DNA kamre.
Figur 2. Et bilde av PING Device. (A) Enheten consist av to sammenstilte PDMS lag (kontroll og flyt). Flyten laget inneholder parallelle DNA og reaksjonskamrene (grå) kontrollert av mikromekaniske ventiler ("knappen", "sandwich" og "halsen") i kontrollgruppen laget. (B) De lagene er justert til en trykt mikroarray, hvilke programmer hver DNA kammer med en enkelt flekk. Dette eliminerer eventuelle forurensning.
Figur 3. Fluorescerende bilder fra en Protein Array Laget med Microfluidic chip. Den trykte flekk gener ble uttrykt til proteiner i enheten (i DNA kammeret) og ble trukket ned til overflaten (under "knapp" ventil i reaksjonskammeret) gjennom deres C-terminus Hans tag. Protein ekspresjon ble påvist ved hjelp av deres C-MYC N-terminus-kode og en spesifikk fluorescerende antistoff. Ulike signaltyper intensiteter indikerer forskjellige protein expression nivåer. Un-spotted kamre fungerte som kontroller for bakgrunnen leVels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen presenterer vi en metode for generering protein arrays i high-throughput med en microfluidic plattform. Matrisen generasjonen er basert på microarray trykkteknikker av DNA maler og in vitro protein ekspresjon fra DNA innenfor microfluidic enheten.
Vår nye microfluidic plattform har flere viktige fordeler fremfor dag brukes metoder, som gjør det til en lovende og generelt verktøy for proteomikk. En fordel er med membran-bundne proteiner. In vitro proteinsyntese hjelp pattedyr reticulocyte lysater i nærvær av mikrosomale membraner 11 gir "naturlig som" forhold som kreves for membran proteiner. Videre tillater MicroFluidics for protein ekspresjon i svært lave volumer og proteinrensing er ikke nødvendig. Dette er de vanligste flaskehalsene i konvensjonelle metoder. Faktisk, kan ytterligere optimalisering av proteiner oppnås ved å sammenholde in vitro cell lysat til proteiner, for eksempel E. coli lysatet for bakterielle proteiner.
MicroFluidics lar protein uttrykk i svært lave volumer. I vår konkret eksempel kammeret volumet er en nl. Det er to fordeler med de lave volumene. Den åpenbare er lavere forbruk av reagenser og evne til å arbeide med sjeldne materialer (dvs. membran proteiner). En annen vesentlig fordel er at konsentrering av proteiner på overflaten med antistoffer i et slikt lite volum tillater oss å oppnå relativt høye konsentrasjoner av proteiner for interaksjon analyser, noe som vil øke assay følsomhet.
Knappen ventiler har dual rolle. Først de brukes til mønstring et antistoff under knappen i hvert kammer. Dette gir oss muligheten til å trekke ned proteiner bare under knappene, mens resten av kammeret passiveres. Sekund, knappene tillate mekanisk vasking og fangst av proteinene ved å fortrenge et volum av væskeunder når den er aktivert. Denne vaskingen og fangst øker den generelle følsomhet av plattformen og tillater påvisning av svake og forbigående molekylære interaksjoner 4.
Endelig kan den microfluidic enhet lett være automatisert og er i stand til å lage mange parallelle målinger. Og dermed spare på kostnader samt tid. Vårt anslag er at kostnadene per protein eksperimentere med PING er ca 2 cents per protein, med dagens enheter som strekker seg opp til 10.000 eksperimenter per enhet 4. Dette anslaget omfatter fabrikasjon og materialer. Således har PING potensial til å være et robust verktøy for protein array generelt med bestemte fordeler som for membran proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Marie Curie International reintegrering stipend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | ESSEX-DC | |
| Chlorotrimethylsilane (TMCS | Sigma-Aldrich | C72854 | |
| Epoxy coated glass substrates | CEL Associates USA | VEPO-25C | |
| Poly ethylene glycole (PEG) | Sigma-Aldrich | 81260 | |
| D-trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531 | |
| Biotinylated-BSA | Pierce, Thermo Scientific | PIR-29130 | |
| Neutravidin | Pierce, Thermo Scientific | 31050 | |
| penta-His-biotin | Qiagen | 34440 | |
| Hepes |  Biological Industries |
03-025-1B | |
| TNT-T7 | Promega Corp. | L5540 | |
| C-myc Cy3 antibody | Sigma-Aldrich | ||
| Control box | Stanford Microfluidics Foundry | ||
| Mold | Stanford Microfluidics Foundry | ||
| Pin | New England Small Tubes Corporation | ||
| Tygon microbore tubing | Tygon | S-54-HL | |
| Microarrayer | Bio Robotics | MicroGrid 610 | |
| Silicone pins | Parallel Synthesis | SMT-S75 |
References
- Maerkl, S. J. Integration column: Microfluidic high-throughput screening. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 1, 19-29 (2009).
- Hong, J. W., Quake, S. R. Integrated nanoliter systems. Nature. 21, 1179-1183 (2003).
- Unger, M. A Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks. Nature. 6, 71-74 (2009).
- Einav, S. Discovery of a hepatitis C target and its pharmacological inhibitors by microfluidic affinity analysis. Nature. 26, 1019-1027 (2008).
- Fordyce, P. M. De novo identification and biophysical characterization of transcription-factor binding sites with microfluidic affinity analysis. Nature Biotechnology. 28, 962-967 (2010).
- Zhu, H. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science (New York, N.Y.). 293, 2101-2105 (2001).
- Ramachandran, N. Self-assembling protein microarrays. Science (New York, N.Y.). 305, 86-90 (2004).
- Zhong, J. F. A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells. Lab on a chip. 8, 68-74 (2008).
- Kusnezow, W., Hoheisel, J. D. Solid supports for microarray immunoassays. Journal of molecular recognition JMR. 16, 165-176 (2003).
- Lundin, M., Monne, M., Widell, A., Von Heijne, G., Persson, M. A. A. Topology of the membrane-associated hepatitis C virus protein NS4B. Journal of virology. 77, 5428 (2003).
