Summary
Um procedimento de triagem em tempo real para identificação de drogas que interagem com a proteína G-gate dentro retificador K
Abstract
Proteína G-gated para dentro do rectificador K + (GIRK) canais de funcionar como mediadores celulares de uma vasta gama de hormonas e neurotransmissores e são expressos no cérebro, coração, músculo esquelético e 1,2 tecido endócrino. Canais GIRK tornar-se activado após a ligação de ligandos (neurotransmissores, hormonas, fármacos, etc) para a sua plasma ligada à membrana, acoplados à proteína G (GPCRs receptores). Esta ligação faz com que a estimulação de proteínas G (G i e G o) que, subsequentemente, se ligar e activar o canal GIRK. Uma vez aberto o canal GIRK permite a circulação de K + para fora da célula fazendo com que a membrana em repouso potencial para se tornar mais negativo. Como conseqüência, GIRK ativação de canais em neurônios diminui a formação de potencial espontâneo de ação e inibe a liberação de neurotransmissores excitatórios. No coração, a activação do canal de GIRK inibe a actividade pacemaker assim abrandar o ritmo cardíaco.
Aqui, descrevemos um teste de triagem em tempo real para identificar novos moduladores de canais GIRK. Neste ensaio, as células neuronais AtT20, expressando canais GIRK, são carregados com potencial de membrana sensíveis corantes fluorescentes, tais como bis-(1,3-dibutylbarbituric ácido) trimethine oxonol [DiBAC 4 (3)] ou HLB 021-152 (Figura 1 ). As moléculas de corante se fortemente fluorescente absorção seguinte para dentro das células (Figura 1). Tratamentodas células com ligandos GPCR estimula os canais GIRK para abrir. A resultante de K + de efluxo para fora da célula faz com que o potencial de membrana a tornar-se mais negativa e do sinal fluorescente para diminuir (Figura 1). Assim, as drogas que modulam a K + efluxo através do canal GIRK pode ser ensaiada utilizando um leitor de placa fluorescente. Ao contrário de outros íons ensaios canal de rastreio, espectrometria de absorção atômica, tais 4 ou análise radiotraçador 5, o canal fluorescente GIRK ensaio fornece um procedimento de triagem rápida, em tempo real e barato.
Protocol
1. Preparação de Células
- Crescer pituitárias AtT20 células em meio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) suplementado com soro de cavalo a 10% e manter as culturas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2.
- Manter a cultura por repicagem as células a cada 5 a 7 dias utilizando um procedimento de tripsinização padrão.
- Revestimento dos poços de fundo, preto claro, placas de 96 poços com 50 ul de poli-L-lisina. Permitir que os poços para secar durante 30 min na incubadora.
- Placa as células nas placas de 96 poços contendo 200 uL meios de densidade de 30.000 células por poço e armazenar as células na incubadora durante 3-4 dias.
- Utilizar uma configuração de aspiração, que consiste em um frasco rolhado litros 4 ligado a um vácuo em uma extremidade e uma ponta de pipeta 200 uL na outra extremidade, para aspirar lentamente o meio de cultura a partir da monocamada de células.
- Lavar as células com 200 uL da solução tampão normal (132 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 5 mM de dextrose, 5 mM de HEPES, pH 7,4 com NaOH).
- Adicionar 200 uL de solução tampão contendo a membrana corante sensível ao potencial (MPD) DiBAC 4 (3) ou HLB 021-152 (5 mM) a cada poço e incubar as células durante 40 min a 37 ° C.
2. Preparação de Compostos de Teste e tratamento da célula
- Prepara-se uma diluição em série dos compostos de teste (stock = 10 mM em DMSO) a partir de uma biblioteca de compostos (em formato de 96 poços), utilizando um Versette (ThermoFisher) sistema de manipulação de líquido automatizado.
- Remova a placa de 96 poços, contendo os AtT20 células, a partir da incubadora e permitir que a placa para voltar à temperatura ambiente. Aspirar fora do tampão de idade e aplicar a solução de tampão fresca contendo o MPD para as células.
- Usando o sistema de manuseamento de líquidos aplicar várias concentrações (10 nM a 10 uM) dos compostos de teste (2 a 20 uL) e as soluções de controlo (0,1% DMSO) (em tampão de solução containing o MPD) com a placa de 96 poços contendo as células.
- Incubar as células durante 5 min com compostos de teste anteriores com as medições fluorescentes.
3. Ativação dos canais de GIRK, Medição e Análise Fluorescente
- Inserir a placa de 96 poços em um leitor de placas Biotek Synergy2 fluorescente e obter o sinal de fundo de fluorescência a comprimentos de onda de excitação e emissão de 520 e 560 nm, respectivamente.
- Aplicar os ligandos GPCR (somatostatina = 200 nM ou carbacol = 10 uM) ou solução de controlo (tampão sozinha) (20 uL) aos poços (volume total = 220 uL) para activar os canais GIRK usando o Synergy2 sistema injector. Recolher os pontos de dados em intervalos de 10 s durante um período de 300 s de amostragem de excitação e emissão de comprimentos de onda de 520 e 560 nm, respectivamente.
- Obtenha o curso do tempo e amplitude do pico da mudança fluorescente usando Biotek software Gen5 e exportar os dados para o Excel, para posterior análise. Calcula-se a Z'-factor para determinar a fiabilidade do ensaio. As placas utilizadas para Z'fator de determinação contida 2 linhas cada uma positiva (ligando GPCR) e negativo (tampão sozinho) controles. O Z'-factor é definido como: Z '= 1 - (P + 3σ 3σ N) / | P μ - μ N |, onde P e μ μ N são os meios de controlo positivo, e sinais de controlo negativo, e s P e N σ são os desvios padrão de controlo positivo e sinais de controlo negativo, respectivamente 6. Z'-factores no intervalo de 0,5 a 1,0 indicam que a qualidade do ensaio é excelente 6. Placas com Z'-factores abaixo de 0,5 são excluídos da análise.
- Os compostos que modulam o sinal fluorescente são novamente testados na presença de Ba 2 + ou tertiapin-Q para confirmar interior rectificador K + especificidade do canal.
4. RResultados epresentative
Um exemplo do sinal de fluorescência medida utilizando o ensaio de canal GIRK é mostrado na Figura 2. A adição da somatostatina ligante de GPCR (200 nM) para os AtT20 células causada uma rápida, diminuição dependente do tempo no sinal fluorescente 021-152 HLB (Figura 2). Em contraste, a adição da solução de controlo produzida uma pequena subida instantânea na fluorescência que com o tempo retornado para a linha de base (Figura 2). Comparação dos valores de pico fluorescentes em placas de 96 poços de controlo e injectados com soluções de somatostatina deu um factores Z'na gama de 0,5 a 0,7. Para a quantificação mais, o registo de controlo foi subtraído a partir do registo de somatostatina eo resultante somatostatina-sensível sinal analisado (Figura 2).
O ensaio proporciona um método para identificar rapidamente drogas que modulam canais GIRK. Por exemplo, as drogas que inibem o cha GIRKnnel deve reduzir GPCR ligando mediadas diminuições na fluorescência, impedindo K + efluxo a partir das células. Como mostrado na Figura 3, o tratamento das células com tertiapin-Q, uma toxina que bloqueia os canais GIRK 7, produziu uma inibição da mudança de somatostatina mediada fluorescente. Propafenona, uma droga anti-arrítmica que bloqueia os canais GIRK no coração 8, também inibiu a mudança fluorescente (Figura 4). O ensaio também pode ser útil para a identificação de activadores do canal de GIRK. No entanto, a aplicação de etanol (100 e 200 mM), um activador do canal GIRK 2,3, não causou alteração significativa no sinal fluorescente em relação ao controle de solução (p> 0,5).
Figura 1. O delineamento experimental do ensaio canal GIRK fluorescente. AtT20 células são incubadas em tampão contendo um Membrane corante fluorescente sensível potencial-(D). As moléculas de corante entrar nas células e tornar-se fluorescente após ligação a proteínas intracelulares (painel superior). A ligação de somatostatina (SOM) para a sua GPCR estimula a proteína inibidora de G (G i) causando a activação do canal de GIRK (painel inferior). O efluxo subsequente de K + para fora das células faz com que o potencial de membrana a tornar-se mais negativa e as moléculas de corante para sair das células. Como resultado, as diminuições de sinal fluorescente (painel inferior).
Figura 2. Representativas HLB 021-152 sinal fluorescente medido ao longo do tempo nas células AtT20 durante a adição de somatostatina ou solução de controlo. A relação da intensidade de fluorescência (F / F O) foi calculado dividindo o sinal na presença (F) da somatostatina (ou solução de controlo) pelo sinal de linha de base medido antes (F O) addição de somatostatina (ou solução de controlo). Cada ponto representa a média ± SE obtido em 5-6 poços. Somatostatina ou solução de controlo foi adicionado no tempo zero (↓). A adição da solução de controlo causou um aumento pequeno transiente no sinal fluorescente. Isto resultou de uma mudança de temperatura causada por injecção da solução.
Figura 3. Tratamento das células com AtT20 tertiapin-Q (500 nM) inibe a diminuição da somatostatina mediada no sinal fluorescente e ligando-se a bloquear os canais de GIRK. Cada ponto representa a média ± SE obtido em 4-6 poços. Somatostatina foi adicionado no tempo zero (↓).
Figura 4. Tratamento das células com AtT20 propafenona (20 uM) também inibe a diminuição da somatostatina mediada-ino sinal fluorescente. Cada ponto representa a média ± SE obtido em 5-6 poços. Somatostatina foi adicionado no tempo zero (↓).
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Discussion
Enquanto potencial de membrana sensíveis corantes fluorescentes foram usados para identificar drogas que modulam canais iônicos 9,10, este é o primeiro relato de sua aplicação para neuronal GIRK droga Discovery Channel. O ensaio GIRK canal fluorescente apresentado aqui fornece um método rápido, confiável e em tempo real para o rastreamento de ligante fechadas canais de K +. O ensaio pode ser modificadas para utilização com uma vasta gama de células incluindo linhas de células imortalizadas (HEK293, CHO, etc) expressam um exógeno recombinante GIRK canal 11, ou linhas de células clonais (AtT20, PC-12) que expressam um canal endógena. Além disso, o ensaio pode ser adaptado para rastreio de drogas em células estaminais embrionárias e culturas de células primárias. Tal como utilizado com os AtT20 células, o ensaio também proporciona o benefício extra de permitir o estudo de ligandos múltiplos GPCR (somatostatina e carbacol) no canal GIRK. Como com qualquer ensaio fluorescente, experiências de controlo deve ser efectuado aeLIMINE artefactos devidos ao composto autofluorescência e para identificar erros resultantes das interacções directas dos compostos com as moléculas de corante. Abordagens alternativas, tais como o ensaio de influxo de tálio 11 e automatizado remendo 12 procedimento grampo deve também ser considerada.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos EUA prémio Serviço Público de Saúde NS-071530.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-114 | |
| 96-well plates | Corning | 3603 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S9129 | |
| Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 | |
| Versette automated liquid handler | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 650-01 | |
| Synergy2 fluorescent plate reader | BioTek | ||
| Gen5 analysis software | BioTek | ||
| Table 1. Table of specific reagents and equipment. | |||
References
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