Summary
G-protein bağımlı içe düzeltici K ile etkileşim ilaçların belirlenmesi için gerçek zamanlı tarama yöntemi
Abstract
G-protein bağımlı içeri düzeltici K + (GIRK) kanalları hormonlar ve nörotransmitterler geniş bir yelpazede hücresel mediatörler olarak işlev ve beyin, kalp, iskelet kas ve endokrin doku 1,2 olarak ifade edilir. GIRK kanallar ve plazma zar bağlı, G proteinine kenetlenmiş reseptörlerin (GPCRs) ila (nörotransmiterler, hormonlar, ilaç vs) ligand bağlama sonra aktive olur. Bu bağlanma sonradan bağlanır ve GIRK kanalı aktive protein G (G i ve G o) uyarılması neden olur. Bir kez GIRK kanal K hareketi + dışarı daha olumsuz olma potansiyeli istirahat membran neden hücrenin sağlar açtı. Sonuç olarak, nöronlarda GIRK kanal aktivasyon spontan aksiyon potansiyeli oluşumu azalır ve eksitatör nörotransmitterlerin salınımını inhibe eder. Kalbinde, GIRK kanal aktivasyonu böylece kalp hızını yavaşlatan pacemaker aktivitesi inhibe eder.
Burada, GIRK kanalların yeni modülatörleri belirlenmesi için bir reel-zamanlı tarama deneyi açıklanmaktadır. Bu deneyde, GIRK kanallar ifade nöronal AtT20 hücreleri, bu tür bis-(1,3-dibutylbarbituric asit) gibi zar potansiyeli hassas boyaların flüoresan ile yüklenir trimethine oxonol [4 DiBAC (3)] ya da HLB 021-152 (Şekil 1 ). Boya molekülleri hücreleri (Şekil 1) içine kuvvetli flüoresan aşağıdaki uptake hale gelir. TedaviGPCR ligandlar olan hücrelerin açmak için GIRK kanallar uyarır. Hücresinin neden K + efflux dışarı daha negatif haline zar potansiyeli ve azaltmak için flüoresan sinyali (Şekil 1) neden olur. Böylece, GIRK kanalı yoluyla K + efflux modüle ilaçlar bir floresan plak okuyucu kullanarak test edilebilir. Diğer iyon kanal tarama testleri gibi atomik absorpsiyon spektrofotometresi 4 veya radyotracer analizi 5 aksine, GIRK kanal fluoresan antikor testi, hızlı, gerçek zamanlı ve ucuz bir tarama prosedürü sağlar.
Protocol
1. Hücreler hazırlanması
- % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferinde% 10 at serumu ve 37 ° C'de kültür muhafaza ile desteklenmiş Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde hipofiz hücreleri AtT20 büyür.
- Standart bir tripsinizasyon prosedürü kullanılarak hücrelerin 5-7 günde bir alt kültüre tarafından kültürü muhafaza.
- Siyah, açık bir alt katın kuyuları, poli-L-Lizin 50 uL 96-kuyucuklu plaklar. Kuyular inkübatörde 30 dakika kurumasını bekleyin.
- Çukur başına 30,000 hücre yoğunluğunda ve 3-4 gün için inkübatöre hücreleri depolamak 200 uL ortamı içeren 96 kuyucuklu plaklar içinde plakası hücreleri.
- Yavaş yavaş hücre monolayer gelen kültür ortamı aspire bir ucunda bir vakum bağlı kapaklı bir 4 litrelik kavanoz ve diğer ucunda 200 ul pipet oluşan bir aspirasyon kurulum, kullanın.
- Normal tampon çözeltisinin 200 uL (132 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 m hücreleri yıkayıpM CaCI2, 1 mM MgCl2, 5 mM dekstroz, 5 mM HEPES, NaOH ile pH 7.4).
- Her oyuğa zar potansiyeli duyarlı boya (MPD) DiBAC 4 (3) ya da HLB 021-152 (5 uM) ihtiva eden tampon çözeltisinin 200 uL ekleyin ve 37 azından 40 dakika süreyle inkübe edilir hücreleri ° C.
2. Test Bileşiklerinin ve Hücre Tedavi hazırlanması
- Bir Versette (ThermoFisher) otomatikleştirilmiş sıvı taşıma sistemi kullanılarak bir bileşik kütüphanesinden test bileşiklerinin bir seri seyreltme (DMSO içinde stok = 10 mM) (96-kuyucuklu biçiminde) hazırlayın.
- , 96-plaka çıkarın AtT20 hücreleri içeren, inkübatör gelen ve plakası oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Eski tampon kapalı aspire ve hücrelere MPD içeren taze tampon çözümü uygulayın.
- Sıvı işleme sisteminin çeşitli test bileşiklerinin konsantrasyonu (10 nM 10 uM) (2-20 uL) ve kontrol çözeltileri (% 0.1 DMSO) (tampon çözeltisi containi uygulanır kullanılarakhücreler içeren 96 kuyucuklu plak için ng MPD).
- Floresan ölçümü için önceden test bileşikleri ile birlikte 5 dakika süreyle inkübe hücreleri.
3. GIRK Kanallar aktivasyonu, Floresan Ölçüm ve Analiz
- Bir BIOTEK Synergy2 floresan plaka okuyucu içine 96-plaka takın ve sırasıyla, uyarma ve emisyon dalga boyları 520 ve 560 nm floresan arka sinyal edinin.
- Synergy2 enjektör sistemini kullanarak GIRK kanalları etkinleştirmek için (toplam hacim = 220 uL) kuyulara GPCR ligandlar (somatostatin = 200 nM veya karbakol = 10 uM) ya da kontrol solüsyonu (tampon tek başına) (20 uL) uygulayın. Sırasıyla, uyarma ve emisyon dalga boyları 520 ve 560 nm, 300 s örnekleme dönemi boyunca 10 sn aralıklarla veri puan toplayın.
- Zaman ders ve BIOTEK Gen5 yazılımı kullanarak floresan değişimi tepe genliği elde etmek ve daha fazla analiz için Excel'e veri ihracat. Assay of güvenilirliğini belirlemek için Z'-faktörü hesaplamak. Z'faktör tayini için kullanılan plakalar 2 satır olumlu her (GPCR ligand) ve negatif (tampon yalnız) kontrolleri içeriyordu. Z'-faktörü olarak tanımlanır: Z '= 1 - (p + 3σ 3σ N) / | μ P - μ N | μ P & μ N pozitif kontrol ve negatif kontrol sinyallerinin aracı olup, ve σ P & σ N pozitif kontrol standart sapmalarının ve negatif kontrol sinyalleri, sırasıyla, 6 vardır. 0,5-1,0 aralığında Z'-faktörleri assay of kalitesi 6 mükemmel olduğunu göstermektedir. 0.5 Aşağıda Z'-faktörleri ile Tabaklar analiz dışında tutulmuştur.
- Floresan sinyali modüle Bileşikler içeri düzeltici K + kanal özgüllük onaylamak için Ba 2 varlığı + veya tertiapin-Q yeniden test edilir.
4. Representative Sonuçlar
GIRK kanalı deneyi kullanılarak ölçülmüştür floresans sinyalinin bir örnek, Şekil 2'de gösterilmiştir. AtT20 hücrelere GPCR ligand somatostatin (200 nM) ilave HLB 021-152 flüoresan sinyali bir hızla, zamana bağlı azalma (Şekil 2) neden olmuştur. Bunun aksine, kontrol solüsyonu ilave süre ile (Şekil 2) başlangıç dönen bir floresans küçük bir ani yükselme üretilir. Somatostatin kontrolü ve çözümleri enjekte 96-kuyucuklu plaklar içinde tepe floresan değerleri ile karşılaştırılması 0,7-0,5 arasında değişen bir Z'-faktörleri verdi. Daha da nicelendirilmek üzere, kontrol kayıt kayıt somatostatin çıkarıldı ve elde edilen somatostatin duyarlı sinyali (Şekil 2) analiz edildi.
Assay hızlı GIRK kanallar modüle ilaçların belirlenmesi için bir yöntem sağlar. Örneğin, ilaç GIRK cha inhibe ettiklerinnel hücrelerinden K + efflux önleyerek floresans GPCR ligand-aracılı azalır azaltacaktır. Bloklar GIRK kanal 7, somatostatin-aracılı flüoresan değişikliğinin bir inhibisyon üretilen Şekil 3, tertiapin-Q, bir toksin sahip hücrelerin tedavisinde de gösterildiği gibi. Propafenon, kalp 8 blok GIRK kanalı, aynı zamanda flüoresan değişimi (Şekil 4) inhibe ettiği bir anti-aritmik ilaç. Assay da GIRK kanalının aktivatörleri belirlenmesi için yararlı olabilir. Çözeltisi (p <0.5) kontrol ile karşılaştırıldığında Ancak, etanol uygulama (100 ve 200 mM), GIRK kanalı 2,3, bir aktivatör flüoresan sinyali önemli bir değişiklik yoktur neden oldu.
Şekil 1. GIRK kanal fluoresan antikor testi Deneysel tasarım. AtT20 hücreleri, bir membran ihtiva eden tampon içinde kuluçkalanıre potansiyel duyarlı floresan boya (D). Boya molekülleri hücre içine girmek ve proteinleri (üst panel) bağlanarak üzerine floresan olur. Onun GPCR için (Som) somatostatin Bağlama GIRK kanalı (alt panel) aktivasyon neden G inhibitör protein (G i) uyarır. K hücre dışı + ve daha sonra akış hücreleri çıkmak için daha negatif ve boya molekülleri haline zar potansiyeli neden olur. Sonuç olarak floresan sinyal azaldıkça (alt panel).
Somatostatin veya kontrol solüsyonu eklenmesi sırasında AtT20 hücrelerinin zaman içinde ölçülen Şekil 2. Temsilcisi HLB 021-152 floresan sinyal. Floresan yoğunluğu (F / F O) oranı (F O) reklamı önce ölçülen temel sinyal ile somatostatin varlığı (F) (veya kontrol solüsyonu) sinyal bölünmesi ile elde edilmiştirsomatostatin olduğunu belirtmektedir (ya da kontrol solüsyonu). Her nokta ortalama ± SE 5-6 kuyularda elde temsil eder. Somatostatin veya kontrol solüsyonu zaman sıfır (↓) ilave edildi. Kontrol solüsyonu ilave flüoresan sinyal küçük bir geçici bir artışa yol açmıştır. Bu çözelti enjeksiyon neden olduğu bir sıcaklık değişimi ile sonuçlanmıştır.
Şekil 3. Tertiapin-S (500 nm) AtT20 hücreleri tedavisi için bağlayıcı ve GIRK kanalı bloke flüoresan sinyali somatostatin-aracılı azalma inhibe eder. Her nokta ortalama ± SE 4-6 kuyularda elde temsil eder. Somatostatin zaman sıfır (↓) ilave edildi.
Şekil 4. Propafenon (20 uM) ile AtT20 hücreler arıtılması ayrıca somatostatin-aracılı azalma inhibefloresan sinyal. Her nokta ortalama ± SE 5-6 kuyularda elde temsil eder. Somatostatin zaman sıfır (↓) ilave edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Membran potansiyeli duyarlı floresan boyalar iyon kanallarını modüle uyuşturucu 9,10 tanımlamak için kullanılmış iken, bu nöronal GIRK kanal ilaç keşfi için uygulama ilk rapordur. Burada sunulan GIRK kanal fluoresan antikor testi ligand kapılı K + kanalları tarama için hızlı, güvenilir ve gerçek zamanlı bir yöntem sağlar. Tahlil, bir eksojen rekombinant GIRK kanalı 11 veya klonal hücre çizgileri (AtT20, PC-12), bir endojen kanalı ifade ifade ölümsüzleştirilmiş hücreleri çizgileri (HEK293, CHO, vs) de dahil olmak üzere, geniş bir hücre serisi ile kullanılmak üzere modifiye edilebilir. Buna ek olarak, deney embriyonik sap hücresi ve primer hücre kültürlerinde eleme ilaçlar için adapte edilmiş olabilir. AtT20 hücreleri ile birlikte kullanıldığı haliyle, deney de GIRK kanalın birden fazla GPCR ligandları (somatostatin ve karbakol) ve çalışma izin vermek ekstra yarar sağlamaktadır. Herhangi bir floresan deneyde olduğu gibi, kontrol deneyleri e yapılmalıdıroto-floresans bileşik ve boya molekülleri ile bileşiklerin doğrudan etkileşimler kaynaklanan hatalar nedeniyle tespit eşya liminate. Böyle talyum testi akını 11 ve otomatik yama kelepçe prosedürü 12 olarak alternatif yaklaşımlar da dikkate alınmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Amerikan Halk Sağlığı Servisi ödül NS-071.530 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-114 | |
| 96-well plates | Corning | 3603 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S9129 | |
| Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 | |
| Versette automated liquid handler | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 650-01 | |
| Synergy2 fluorescent plate reader | BioTek | ||
| Gen5 analysis software | BioTek | ||
| Table 1. Table of specific reagents and equipment. | |||
References
- Hibino, H. Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles. Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).
- Lusscher, C., Slesinger, P. A. Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).
- Kobayashi, T., Ikeda, K. G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets. Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).
- Terstappen, G. C. Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay. Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).
- Cheng, C. S. A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look. Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).
- Zhang, J. -H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Jin, W., Lu, Z. A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels. Biochem. 37, 13291-13299 (1998).
- Inomata, N. Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes. Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).
- Tang, W. Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel. J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).
- Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays. J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).
- Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors. Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).
- Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. Comparison of human Ether-á-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux. Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).
