Summary
A خطوة خطوة لعزل بروتوكول وتحديد مجمعات RNA المرتبطة بها من خلال رقاقة-RIP.
Abstract
نتيجة لتطور الإنتاجية العالية وكفاءة تحليل تسلسل ميكروأري، أصبحت عالمية تحليل التعبير الجيني شكل سهلة ومتاحة بسهولة لجمع البيانات. في مجال البحوث والنماذج كثيرة المرض غير أن مستويات ثابتة من الدولة مرنا الجينات المستهدفة دائما لا ترتبط مباشرة مع ثابت مستويات البروتين الدولة. بعد النسخي تنظيم الجينات هو التفسير المحتمل لاختلاف بين الاثنين. مدفوعا من البروتينات ملزمة RNA ملزم (RBP)، بعد النسخي التنظيم مرنا يؤثر التوطين والاستقرار والترجمة من خلال تشكيل بروتين نووي ريبوزي (RNP) المعقدة مع mRNAs والهدف. تحديد هذه مرنا غير معروف نوفو دي من الأهداف مقتطفات الخلوية في مجمع RNP محورية لفهم آليات ومهام RBP وتأثيرها على الإنتاج مما أدى البروتين. هذا البروتوكول يحدد طريقة تسمى RNP مناعي-ميكروأري (RIP-رقاقة)، والذي يسمح لتحديد من لياليmRNAs وpecific المرتبطة في مجمع بروتين نووي ريبوزي، في ظل الظروف التجريبية المتغيرة، جنبا إلى جنب مع مزيد من الخيارات لتحسين تجربة للباحث على حدة. مع هذه الأداة التجريبية الهامة، يمكن للباحثين استكشاف الآليات المعقدة المرتبطة تنظيم الجينات في مرحلة ما بعد النسخي وكذلك التفاعلات بروتين نووي ريبوزي أخرى.
Protocol
تجربة إعداد
قبل البدء التجربة، فمن الأهمية بمكان أن يكون كل الكواشف والحاويات والأواني ريبونوكلياز الحرة. علاج الأواني الزجاجية مع ريبونوكلياز المانع (RNaseZAP، Ambion)، يليه الشطف مع DEPC المعالجة المائية. ضمان أكد جميع الكواشف كما ريبونوكلياز مجانا.
1. إعداد mRNP المحللة
- تنمو خلايا الأنسجة وحصاد المتزايد باطراد لإنتاج بين 2-5 ملغ من البروتين الكلي لكل RIP.
- طبقين الثقافة P150 عادة ما تكون كافية.
- ليجري التحقيق في كل الممارسات التجارية التقييدية، يجب أن يكون الأمثل إجمالي عدد الخلوية والبروتينات بكميات مناسبة لتعظيم مرنا الهدف والتفاعلات RBP.
- قد RIP لQRT-PCR تحليل المحللة تتطلب أقل الخلوية (حوالي 400 ميكروغرام من البروتين الكلي) وذلك بسبب التضخيم وطريقة الكشف عن الممارسات التجارية التقييدية وخاصة وفرة عالية مثل حور AUF1، TIAR.
- بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 8-10 دقيقة في 4 درجات مئوية، ثم يغسل ثلاث مرات مع الثلج الباردة PBS.
- بعد غسل النهائي، نفض الغبار بلطف أسفل أنبوب و resuspend بيليه خلية في أحجام متساوية من المعدة العازلة تحلل polysome (PLB) مع مثبطات الأنزيم البروتيني وريبونوكلياز.
- من المستحسن لقياس حجم من الدقيق بيليه الخلية.
- خليط بلطف الماصة (لا الدوامة) لتحطيم كتل من الخلايا المحللة واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
- الطرد المركزي في 13000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية لمسح المحللة من الحطام.
- نقل على الفور إلى مسح طاف أنبوب microfuge قبل مبردة.
- الحفاظ على الجليد وتخزينها في -80 درجة مئوية.
- تجميد فوري يكمل تحلل السليم للخلايا ويمنع ملزمة غير المرغوب فيها. المضي قدما في ذوبان الجليد RIP عينة التالية مباشرة والحفاظ على الجليد عينات لتجنب تدهور RNA. </ لى>
- ويمكن تخزين هذه المحللة لمدة تصل إلى ستة أشهر في -80 ° C. تجنب تكرار دورات ذوبان الجليد تجميد وهذا يمكن أن يؤدي إلى البروتين و / أو تدهور مرنا.
- Quantitate تركيز البروتين في المحللة باستخدام معيار فحص البروتين برادفورد.
2. البروتين معطف A الخرز sepharose و مع الأجسام المضادة وغسيل
- قبل تنتفخ البروتين A (PAS) في ليلة وضحاها sepharose و الخرز NT2 العازلة (حجم 3-4) مع 5٪ BSA. تخزين في C. ° 4
- تخزين طويلة الأجل تصل إلى عدة أشهر عند 4 ° C هو ممكن عندما تستكمل مع أزيد الصوديوم 0.1٪.
- وينبغي اختيار حبات sepharose و البروتين على أساس نمط إسوي من الأجسام المضادة RBP الهدف. البروتينات A G، G و A / جميعها أهدافا محددة ونمط إسوي تختلف في النسب المستهدفة. واستخدمت البروتين A sepharose و الخرز يعتمد على خصوصية نمط إسوي وتقارب الأجسام المضادة لبروتين حور.
- قبل الاستخدام، وإزالة العازلة NT2 الزائد، ولأن الخرز النهائي لنسبة المخزن المؤقت 1:1.
- باستخدام أنابيب 1،5 مل ميكروسنتريفوج ريبونوكلياز خالية، وإزالة الطين من 100 ميكرولتر وإضافة PAS 30 ميكروغرام من الأجسام المضادة لكل فرد رد فعل IP (أي محددة ومراقبة الممارسات التجارية التقييدية نمط إسوي).
- إضافة 100-200 ميكرولتر من العازلة NT2 لمزيج الأجسام المضادة حبة.
- قد يتم تخزين الخليط لمدة عدة أسابيع في 4 درجات مئوية عندما تستكمل مع أزيد الصوديوم 0.1٪.
- وينبغي استخدام جسم مضاد نمط إسوي المطابقة أو الأمصال العادية كلها من نفس النوع في نفس الوقت كعنصر تحكم الأجسام المضادة ضد RNA الخلفية.
- إضافة الأجسام المضادة المناسبة لمزيج حبة واحتضان بين عشية وضحاها، تراجع عن نهاية نهاية عند 4 ° C.
- تحسين عيار الأجسام المضادة لبروتين معين يجري التحقيق (1، 5، 10 أو 30 ميكروغرام من الأجسام المضادة وعادة ما يكفي).
- إعداد الأجسام المضادة المغلفة الخرز فورا قبل الاستخدام عن طريق الغسيل مع 1 مل منالجليد الباردة عازلة NT2 5 مرات.
- غسل مزيج حبة بواسطة الطرد المركزي في 13000 XG لمدة 1-2 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- إزالة بعناية أكبر قدر ممكن من supernantant مع pipettor اليد أو الشافطة ولكن كن حذرا لتجنب تعطيل بيليه.
- يساعد على إزالة الأجسام المضادة غسل غير منضم وكذلك الملوثات ريبونوكلياز من خليط الأجسام المضادة.
- مرة واحدة وقد تم الانتهاء من غسل النهائي، إعادة تعليق الخرز في 700 ميكرولتر من العازلة الجليد الباردة NT2 تليها العلاج مع مثبطات ريبونوكلياز مختلفة لحماية mRNAs والهدف، بما في ذلك 10 ميكرولتر من خارج ريبونوكلياز في 40 ميكرولتر 10 U / ميكرولتر، 100 مم DTT و 15 ميكرولتر EDTA (15 ملم). تحقيق حجم ميكرولتر إلى 1،000 مع NT2 العازلة.
- لا تستخدم المجمعات ريبونوكليوزيد Vanadyl بسبب تأثير كابح من EDTA.
3. مناعي والأمطار RNA
- Preclear الخطوة اختيارية:
- للحد من الخلفية، يمكن استخدام الخرز والأجسام المضادة لسيطرة واضحة قبل المحللة. وهذا قد خفض إشارة في الإخراج.
- قد تكون هذه الخطوة ضرورية للحد من الخلفية عند القيام IP تليها ميكروأري. ومن المسلم به عموما ليس من الضروري لIP تليها QRT-PCR.
- Preclear مع 15 ميكروغرام من السيطرة نمط إسوي لمدة 30 دقيقة / 4 ° C تراجع خلال نهاية النهاية.
- إضافة 50 ميكرولتر من الخرز PAS preswollen غير المغلفة مع الأجسام المضادة من الخطوة 2.1.
- احتضان 30 دقيقة / 4 ° C مع نهاية التناوب على نهاية
- الطرد المركزي في 10000 XG في C. ° 4 حفظ طاف لIP.
- إضافة 100 ميكرولتر من عزلة المحللة مسح (حوالي 2-5 مجم) لمزيج الأجسام المضادة المعدة.
- سوف تمييع المحللة يساعد على الحد من خلفية غير محددة وملزمة.
- قد كمية المدخلات المحللة تختلف تبعا لطريقة الكشف وفرة من س RBPR كفاءة الأجسام المضادة RBP كما لوحظ في خطوة 1.1.c.
- (اختياري) تخلط مباشرة بواسطة أنبوب عبها بلطف عدة مرات ثم الطرد المركزي وجيزة في 10،000 XG في 4 درجات مئوية لالخرز بيليه على الفور وإزالة 100 ميكرولتر من طاف وتمثيل المدخلات مرنا الإجمالية للتحليل qPCR باستخدام معيار تقنيات عزل الحمض النووي الريبي.
- هذه الخطوة هو التأكد من أن المدخلات المحللة RNA هو الأمثل لIP ويجب فقط أن يتم تنفيذ كخطوة الاختيار أو كخطوة استكشاف الأخطاء وإصلاحها التالية RIP مع نتائج الحمض النووي الريبي الفقراء.
- أنبوب لفاف في parafilm لضمان اغلاق محكم على احتضان عند 4 ° C لمدة 2 إلى 4 ساعات، تراجع عن نهاية نهاية.
- وينبغي أن يكون الأمثل على توقيت الحضانة يعتمد على وفرة الهدف ويجب أن يكون الحد الأدنى لتجنب إعادة ترتيب معقدة أو تدهورها. لبعض الممارسات التجارية التقييدية قد تكون أكثر أقصر حضانات الأمثل.
- الخرز بيليه في 5،000 xgfأو 5 دقائق في 4 درجات مئوية وانقاذ طاف للتحليل لطخة غربية محتملة من قبل. مأخوذة المحل في -80 درجة مئوية.
- قد مأخوذة من طاف مع كميات عالية من البروتين الهدف المتبقية تشير إلى فشل البروتين لتكون محرضة من الخرز sepharose و.
- كما هو موضح سابقا، وغسل الخرز 5 مرات مع 1 مل من الجليد الباردة عازلة NT2 والطرد المركزي (5،000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية) ثم إزالة طاف مع الشافطة pipettor اليد أو ملف.
- ويمكن استخدام أساليب أكثر صرامة غسل من أجل الحد من الخلفية من خلال استكمال NT2 العازلة مع deoxycholate الصوديوم واليوريا أو SDS.
- الحفاظ على العينات على الجليد قدر الإمكان والعمل بسرعة للحد من تدهور مرنا الهدف.
- اختياري: حفظ قسامة الصغيرة (10٪) من مزيج حبة أو تشغيل عينة إضافية بالتوازي لفحص كفاءة IP للبروتين الهدف باستخدام تحليل لطخة غربية.
4. الدناز والعلاج بروتين K
- بعد غسل والخرز مع 100 ميكرولتر إعادة تعليق من NT2 العازلة تستكمل مع 5 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية الدناز 1 (2 U / ميكرولتر).
- الحفاظ على C ° 37 لمدة 5-10 دقيقة. إضافة 1 مل من NT2 العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- ويمكن استخدام صغيرة (~ 10٪) قسامة من الخرز للتحقق من كفاءة IP SDS-PAGE التحليل.
- إعادة تعليق بيليه PAS في 100 ميكرولتر العازلة NT2، 5 ميكرولتر بروتين K (10 ملغ / مل)، و 1 ميكرولتر SDS 10٪.
- احتضان الخليط معلق حبة لمدة 30 دقيقة في C ° 55 في حمام مائي، بلطف عبها في كل 10 دقيقة.
- سوف بروتين K مساعدة في الافراج عن مكونات RNP.
- الخرز بيليه في 5،000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) وجمع طاف (~ 100 ميكرولتر).
- أضف 200 ميكرولتر العازلة لNT2 الخرز، centrifuge 5000 x ج لمدة 2 دقيقة في RT، وجمع طاف (~ 200 ميكرولتر)، والخرز تجاهل.
- الجمع بين supernatants (100 ميكرولتر ميكرولتر و200) وإضافة 300 ميكرولتر طبقة أقل من 3 الفينول حمض-CHCl.
- دوامة، 1 دقيقة RT (أو 37 درجة مئوية في شاكر) وأجهزة الطرد المركزي في 16000 XG لRT في 1 دقيقة.
- جمع 250 ميكرولتر من الطبقة العليا (عدم تعطيل واجهة)، إضافة 25 ميكرولتر خلات الصوديوم عند أس هيدروجيني 5،2، 625 ميكرولتر ETOH 100٪ و 5 ميكرولتر glycoblue، وتخلط جيدا.
- بين عشية وضحاها في تخزين -20 ° C.
- لضمان الانتعاش السليم من الحمض النووي الريبي، وإضافة glycoblue زيادة وضوح من بيليه RNA من خلال العمل كناقل الناقل.
- في اليوم التالي، وأنابيب مزيج من انعكاس 3-5 مرات، وتدور في 12000 XG في 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة وتجاهل طاف.
- إضافة 1 مل من 70٪ ETOH إلى بيليه مزيج من الزرقاء وانعكاس أو vortexing.
- أجهزة الطرد المركزي في 12000 XG C ° 4 لمدة 2 دقيقة.
- Discard طاف وأجهزة الطرد المركزي 12000 XG لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- إزالة أي ETOH المتبقية 70٪ مع ماصة والهواء الجاف بيليه في RT لمدة 5 دقائق.
- resuspend في ميكرولتر من 20-40 ريبونوكلياز / الدناز خالية المياه أو وحدة تخزين أخرى مناسبة حسب الحاجة.
- عينة جاهز الآن لمزيد من التطبيقات المصب مثل QRT-PCR أو ميكروأري.
- ويمكن استخدام القياس الطيفي Nanodrop في تقييم تركيز العينة، ولكن مع عينات الثمينة، فإنه قد يكون من المفيد لتجنب عينات nanodropping لأنها يمكن أن تكون غير دقيقة والإسراف نسبيا. نقترح عينات لتطبيع النصوص الجينات التدبير المنزلي لتقييم الكفاءة والنقاء IP العائد للعينات ثمينة أو منخفضة.
5. ممثل النتائج
إذا تم تحسين الإجراء ويقوم بشكل صحيح، يجب أن تسفر عن تخصيب مناعي كبير من الأهداف مرنا. عادة، اعتمادا على الممارسات التجارية التقييدية وهدفها مرنا (ق)، ونحن نرى إثراء حوالي 10 - إلى أضعاف-50 عند تقييمها من قبل QRT-PCR. ويمكن اكتشاف العديد من الأهداف من الممارسات التجارية التقييدية بشكل جماعي باستخدام ميكروأري التحليل. ومع ذلك، هذا الأسلوب هو أكثر حساسية لتدهور بالمقارنة مع QRT-PCR. اعتمادا على الممارسات التجارية التقييدية، وعدد من الأهداف وكفاءة التفاعل، يمكن ميكروأري تكشف مئات الأهداف الرواية، أو أنه قد كشف سوى عدد قليل، إن وجدت. على سبيل المثال، واحدة من أفضل RNA تتميز حور البروتينات ملزمة، بعد transcriptionally ينظم التعبير وترجمة العديد من الجينات الهامة الفسيولوجية 1 و 2. عزل حور-ribonucleo المعقدة عن طريق رقاقة-RIP في خطوط خلايا سرطان الثدي، على سبيل المثال، كشفت إثراء العديد من الأهداف الهامة حور المعروفة، بما في ذلك أكتين-β-PCR باستخدام QRT كما هو مبين في الشكل 1. في كل من خطوط الخلايا السرطانية غير المخصب β-أكتين 12 - لأضعاف-15. عادة، عندما يقوم بشكل صحيح نرى ENR كبيرةichment من أكتين-β في مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا. ومع ذلك، إذا RIP لا تكشف عن أي تخصيب كبيرة للأكتين-β هذا يشير إلى وجود مشكلة مع RIP والإجراء قد تحتاج إلى تكرار. وعلاوة على ذلك، كشفت ميكروأري تحليل عينات من هذه immunoprecipitated خطوط الخلايا مجموعات فرعية متميزة من الأهداف التعبير الحر في مستقبلات هرمون الاستروجين مختلفة (ER) إيجابية الخلايا MCF-7 سرطان مقابل ER-231 MB السلبية خطوط خلايا سرطان الثدي كما هو موضح في الشكل 2 1. هذه الأهداف تندرج في عدة فئات: حور الأهداف المعروفة وغير المعروفة التي كانت مرتبطة أو غير مرتبطة بالسرطان. على سبيل المثال، وCALM2 CD9 على حد سواء جينات السرطان التي لم تحدد سابقا باسم حور الأهداف. تم العثور على استخدام وتأكيد ميكروأري مع QRT-PCR، وCALM2 CD9 أن تكون 5 - إلى 180 أضعاف المخصب بيليه حور يدل على أن التفاعل بين البروتين بارز حور وهذه الجينات المستهدفة.
الشكل 2. حور RIP-CHIP يحدد ملامح جينية منفصلة في + ER والخلايا السرطانية ER-الثدي.أجريت immunoprecipitations حور من MB-231-7 أو MCF الخلية لست] باستخدام الأجسام المضادة IgG1 حور والسيطرة نمط إسوي المهجنة لصفائف Sentrix البورشيد (47،000 الجينات). تم طرح إشارات التحكم. النتائج تمثل البيانات التراكمية من 12 المصفوفات المختلفة. وقد أجريت تجارب في ثلاث نسخ (ن = 3) لكل خط الخلية مع الضوابط مطابقة. جداول هي log2.
Discussion
ونظرا لطبيعة هذا التحسين، والتجربة والخبرة تكون مضمونة فقط الطرق للحصول على النتائج المرجوة بنجاح. في العديد من الخطوات من هذا الإجراء، ودرجة الحرارة والمعالجة الفعالة للالكواشف والمنتجات هي ذات أهمية حاسمة. والتخطيط السليم وتنفيذ تقنية مساعدة تأكد من أن تم إجراء التجربة في إطار زمني مناسب في درجات الحرارة المثلى الموصى بها. ومن القضايا الرئيسية مع التجارب العزلة RNA هو حساسية من RNAs إلى تدهور من RNases. جميع الكواشف يجب أن تكون حرة وريبونوكلياز المخزنة أو المستخدمة في ريبونوكلياز خالية الحاويات. هذا هو خطوة حاسمة في ضمان سلامة العينة مرنا الخاص بك. حتى عندما يتم تنفيذ التجربة بشكل صحيح، ومع ذلك، قد لا يمكن تحقيق النتيجة المرجوة نظرا لطبيعة التفاعل بين الممارسات التجارية التقييدية وmRNAs وهدفها.
مشكلة واحدة محتملة هو وجود منخفض أو حتى أي إشارة من RNA عزلها تشيب-RIP.على الرغم من أنه قد تكون هناك إشارة من الحمض النووي الريبي مجموع، وهذا قد يكون نتيجة لعدم كفاية البروتين ملزمة يجري سحب من قبل الخرز. الخطوة الأولى هي استكشاف الأخطاء وإصلاحها للتأكد من أن المحللة الخلوية المستخدمة لديها التعبير الكافي للRBP محددة. بعد تأكيد، قد يتم عزل البروتين بعد غسل NT2 النهائي ومعلق في المخزن المؤقت أو آخر Laemmli العازلة المناسبة يبدل طبيعة ويسخن في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ويمكن استخدام تحليل لطخة غربية على هذه العينات المحللة في التنسيق مع المدخلات وكذلك الضوابط السلبية لضمان ما يكفي من هدم للبروتين المرتبطة بها.
وعلاوة على ذلك، لأن lysing الخلية هو مطلوب للوصول إلى هذه المكونات، قد يتم عرض إمكانية التفاعلات غير طبيعي وغير المرغوب فيها بين البروتينات وفصلها عادة مرنا. يمكن ربط هذه التفاعلات المحتملة و"امتصاص" mRNAs والهدف الخاص بك أو البروتينات من خلال التفاعلات غير محددة ملزمة. بالإضافة إلى ذلك، شارك في هذه البروتينات متفاوتةيمكن nditions أضعاف في أشكال متعددة والزخارف التي قد تصبح ملزمة لا يمكن الوصول إليها لmRNAs وهدفهم، ومنع تفاعلها. كل من هذه تعزيز أهمية العمل بكفاءة وكذلك الاستفادة من درجات الحرارة المثلى للحد من سرد هذه التفاعلات غير المرغوب فيها. بالإضافة إلى ذلك، سوف الأمثل لغسل الظروف لكل بروتين هدف معين تكون حاسمة لتحقيق أقصى قدر من التفاعل نقاء. قد تكون هناك حاجة غسل ظروف أكثر صرامة. على سبيل المثال، قد يتم استكمال العازلة غسل SDS أو مع مبلغ مناسب من اليوريا للحد من التفاعلات غير محددة والخلفية في الناتج إشارة. سيكون هذا تعتمد اعتمادا كليا على الممارسات التجارية التقييدية في الهدف المجرب وكذلك مرنا الهدف في ظروفها الفسيولوجية فريدة من نوعها. فإن بعض الظروف لا تكون مناسبة لبعض أدوات التحليل مرنا، والتي تجدر الإشارة في إعداد العينات.
وأخيرا، على الرغم من RIP ناجحا في إثراء RNARBP-التفاعلات، مشكلة معروفة بشكل جيد مع طريقة (CHIP) RIP هو عدم القدرة على التعرف على مجالات محددة ملزمة للRBP على الأهداف مرنا عابرة. ويمكن استخدام العديد من التقنيات عبر ربط تليها RIP لعزل الأهداف تسلسل فريد، إلا أن استخدام الأشعة فوق البنفسجية قصيرة الموجة يميل إلى أن يؤدي إلى تلف الحمض النووي. وهناك طريقة جديدة تعرف باسم CLIP-PAR، أو photoactivatable يشابك ريبونوكليوزيد وimmuoprecipitation، ويعمل منذ فترة طويلة موجة الأشعة فوق البنفسجية لدمج thiouridine إلى RNA الوليدة السماح تحديد مواقع الربط فريدة من التفاعلات RNA سواء مستقرة وعابرة.
وعموما، تم تأسيس RIP-الرقاقة، أداة ممتازة تستخدم لعزل ودراسة التفاعلات بين البروتينات RNA ملزم والأهداف مرنا من خلال مجموعتنا وكذلك العديد من المجموعات البحثية الأخرى. على الرغم من الطبيعة الحساسة في والممارسة، وحسن تنفيذ هذا الإجراء يحقق عزلة هذه المجمعات RNP، التي كانت حتى وقت قريب، كانت inaccessible لاكتشاف وتحليل.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة.
Acknowledgments
وزارة الدفاع (جائزة فكرة W81XWH-07-0406) - لأتاسوي اولوس
NIH RO1 A1080870 - لأتاسوي اولوس
NIH R21 A1079341 - لأتاسوي اولوس
جامعة ميسوري صناديق المؤسسية - لأتاسوي اولوس
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M dithiothreitol | Fisher | BP172-5 | DTT |
| DNase 1 | Ambion | 2235 | RNase free |
| Ethylendiamine Tetraccetic Acid | Fisher | BP118-500 | EDTA |
| Glycogen | Ambion | 9516 | |
| 1 HEPES | Sigma | H3375-100G | pH 7.0 |
| Igepal Nonidet P-40 | USB | 78641 | NP40 |
| 1 M KCl | Fisher | BP366-500 | |
| 1 M MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
| NT2 Buffer | *See Below | ||
| Polysome Lysis Buffer | *See Below | ||
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11873580001 | |
| Protein A Sepharose Beads | Sigma | P3391 | |
| Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
| RNase Out RNase inhibitor | Invitrogen | 10777-019 | 40 U/μl |
| 1 M NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher | BP166-500 | SDS |
| 1 M Tris-HCl | Fisher | BP153-500 | pH 7.4 |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | New England Labs | S1402S | VRC |
| Reagent Workup | |||
| Prepare reagents in RNase/DNase-free, DEPC-treated glassware | |||
| Polysome lysis Buffer | |||
| 100 mM KCl | |||
| 5 mM MgCl2 | |||
| 10 mM HEPES (pH 7.0) | |||
| 0.5% NP40 | |||
| 1 mM DTT | |||
| 100 units/ml RNase Out | |||
| 400 μM VRC | |||
| Protease inhibitor cocktail tablet | |||
| 5 ml of Polysome lysis buffer | |||
| Add 50 μl of 1 M HEPES (pH 7.0) | |||
| 500 μl of 1 M KCL | |||
| 25 μl of 1 M MgCl2 | |||
| 25 μl of NP40 | |||
| 4.7 ml RNase-DNase-free H2O | |||
| 50 μl of 1 M DTT | |||
| 12.5 μl of 100 U/ml RNase Out | |||
| 200 μl Protease inhibitor cocktail (dissolved according to manufacturer) | |||
| 10 μl 200 mM VRC (at time of use) | |||
| NT2 Buffer | |||
| 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) | |||
| 150 mM NaCl | |||
| 1 mM MgCl2 | |||
| 0.05% NP40 | |||
| 1 L of NT2 Buffer | |||
| 50 ml Tris (pH 7.4) | |||
| 30 ml 5 M NaCl | |||
| 1 ml 1 M MgCl2 | |||
| 500 μl NP40 | |||
| 820 ml RNase-DNase-free H2O |
References
- Calaluce, R., Gubin, M. M., Davis, J. W., Magee, J. D., Chen, J., Kuwano, Y., Gorospe, M., Atasoy, U. The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer. BMC Cancer. 10, 126-140 (2010).
- Gubin, M. M., Calaluce, R., Davis, J. W., Magee, J. D., Strouse, C. S., Shaw, D. P., Ma, L., Brown, A., Hoffman, T., Rold, T. L., Ulus Atasoy, U. Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis. Cell Cycle. 9, 3337-3346 (2010).
- Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nature Protocols. 1, 302-307 (2006).
- Tenenbaum, S. A., Lager, P. J., Carson, C. C., Keene, J. D. Ribonomics: identifying mRNA subsets in mRNP complexes using antibodies to RNA-binding proteins and genomic arrays. Methods. 26, 191-198 (2002).
- Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Atasoy, U., Keene, J. D. Genome-wide regulatory analysis using en masse nuclear run-ons and ribonomic profiling with autoimmune sera. Gene. 317, 79-87 (2003).
- Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14085-14090 (2000).
- Baroni, T. E., Chittur, S. V., George, A. D., Tennebaum, S. A. Advances in RIP-Chip Analysis. Methods in Molecular Biology. 419, 93-108 (2008).
- de Silanes Lopez, I., Zhan, M., Lal, A., Yang, X., Gorospe, M. Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2987-2992 (2004).
- de Silanes Lopez, I., Lal, A., Gorospe, M. HuR: post-transcriptional paths to malignancy. RNA Biol. 2, 11-13 (2005).
- Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide analysis of mRNA stability using transcription inhibitors and microarrays reveals posttranscriptional control of ribosome biogenesis factors. Mol. Cell Biol. 24, 5534-5547 (2004).
- Hieronymus, H., Silver, P. A. Genome-wide analysis of RNA-protein interactions illustrates specificity of the mRNA export machinery. Nat. Genet. 33, 155-161 (2003).
- Hieronymus, H., Yu, M. C., Silver, P. A. Genome-wide mRNA surveillance is coupled to mRNA export. Genes Dev. 18, 2652-2662 (2004).
- Mukherjee, N., Corcoran, D. L., Nusbaum, J. D. Integrative Regulatory Mapping Indicates that the RNA-Binding Protein HuR Couples Pre-mRNA Processing and mRNA Stability. Molecular Cell. 43, 1-13 (2011).
