Summary
चीर चिप के माध्यम से शाही सेना जुड़े परिसरों को अलग और पहचान के लिए कदम प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम है.
Abstract
उच्च throughput अनुक्रमण और कुशल माइक्रोएरे विश्लेषण के विकास का एक परिणाम के रूप में, वैश्विक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण डेटा संग्रह का एक आसान और आसानी से उपलब्ध फार्म बन गया है. कई शोध और रोग मॉडल लेकिन, लक्ष्य जीन mRNA की स्थिर राज्य स्तर हमेशा स्थिर राज्य प्रोटीन के स्तर के साथ सीधे सहसंबंधी नहीं करता है. पोस्ट ट्रांस्क्रिप्शनल जीन विनियमन दोनों के बीच अंतर के एक संभावना विवरण है. आरएनए बंधनकारी प्रोटीन (RBP) के बंधन से प्रेरित है, के बाद transcriptional विनियमन (RNP) लक्ष्य mRNAs के साथ Ribonucleoprotein जटिल द्वारा निर्मित mRNA स्थानीयकरण, स्थिरता और अनुवाद को प्रभावित करता है. RNP परिसर में सेलुलर अर्क से इन अज्ञात डी Novo mRNA लक्ष्य की पहचान समझ तंत्र और RBP और उनके प्रोटीन उत्पादन पर परिणामी प्रभाव के कार्यों के लिए निर्णायक है. इस प्रोटोकॉल में एक विधि करार दिया immunoprecipitation (आरआईपी चिप) माइक्रोएरे, RNP जो एस के पहचान के लिए अनुमति देता है की रूपरेखाpecific mRNAs ribonucleoprotein परिसर में जुड़े, बदलते प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, विकल्प के साथ आगे व्यक्ति शोधकर्ता के लिए एक प्रयोग का अनुकूलन. इस महत्वपूर्ण प्रायोगिक उपकरण के साथ, शोधकर्ताओं ने जटिल बाद ट्रांस्क्रिप्शनल जीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विनियमन अन्य ribonucleoprotein बातचीत के साथ जुड़े तंत्र का पता लगाने कर सकते हैं.
Protocol
प्रयोग की तैयारी
प्रयोग शुरू करने से पहले, यह सभी अभिकर्मकों, कंटेनर और बर्तन RNase मुक्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. RNase (RNaseZAP, Ambion) अवरोध करनेवाला DEPC पानी का इलाज के साथ rinsing द्वारा पीछा के साथ कांच के बने पदार्थ समझो. सुनिश्चित करें कि सभी अभिकर्मकों RNase मुक्त रूप में पुष्टि कर रहे हैं.
1. MRNP lysate तैयार करें
- बढ़ो और प्रत्येक आरआईपी के लिए कुल प्रोटीन के 2-5 मिलीग्राम के बीच उत्पादन तेजी से बढ़ ऊतक कोशिकाओं फसल.
- दो P150 संस्कृति व्यंजन आम तौर पर कर रहे हैं पर्याप्त है.
- प्रत्येक RBP जांच की जा रही है, कुल सेलुलर संख्या और प्रोटीन की मात्रा के लिए उचित लक्ष्य mRNA और RBP बातचीत को अधिकतम करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.
- चीर qRT - पीसीआर विश्लेषण के लिए कम सेलुलर (लगभग 400 ग्राम कुल प्रोटीन) lysate और ऐसे हूर AUF1, TIAR में उच्च बहुतायत RBPs के लिए विशेष रूप से पता लगाने की विधि के प्रवर्धन के लिए कारण की आवश्यकता हो सकती है.
- Centrifugation के माध्यम से में 8-10 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस, के लिए 200 XG पर गोली कोशिकाओं तो बर्फ के ठंडे पीबीएस के साथ तीन बार धो लो.
- अंतिम धोने के बाद, धीरे तैयार RNase और protease inhibitors के साथ polysome lysis बफर (पीएलबी) के बराबर मात्रा में ट्यूब के नीचे और resuspend सेल गोली झटका.
- यह सेल गोली की सटीक मात्रा को मापने के लिए सिफारिश की है.
- धीरे pipet मिश्रण (भंवर नहीं है) के अलावा कोशिकाओं के clumps को तोड़ने और 5 मिनट के लिए बर्फ पर lysate सेते हैं.
- 4 बजे 20 मिनट के लिए 13,000 XG पर अपकेंद्रित्र ° C मलबे के lysate साफ.
- तुरंत हस्तांतरण पूर्व ठंडा microfuge ट्यूब तैरनेवाला को मंजूरी दे दी है.
- -80 पर बर्फ और दुकान पर रखें ° सी.
- तत्काल ठंड कोशिकाओं के उचित lysis पूर्ण और अवांछित बाध्यकारी रोकता. चीर के तुरंत बाद नमूना पिघलना साथ आगे बढ़ें और शाही सेना गिरावट से बचने के लिए बर्फ पर रखने के लिए नमूने <./ Li>
- इस lysate के लिए भंडारित किया जा सकता है -80 में छह महीने के लिए डिग्री सेल्सियस दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र से बचें क्योंकि यह प्रोटीन और / या mRNA गिरावट के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
- मानक ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख का उपयोग lysate में प्रोटीन एकाग्रता quantitate.
2. कोट प्रोटीन एंटीबॉडी और धो के साथ एक Sepharose मोती
- पूर्व प्रफुल्लित प्रोटीन Sepharose (पीए) 5% BSA के साथ NT2 बफर (3-4 संस्करणों) में रात भर मोती. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
- अप करने के लिए लंबे समय तक 4 में कई महीनों के लिए भंडारण ° C संभव है जब 0.1% सोडियम azide के साथ पूरक.
- प्रोटीन Sepharose मोती लक्ष्य RBP एंटीबॉडी के निर्धारण के आधार पर चुना जाना चाहिए. जी, और ए / जी प्रोटीन सभी विशिष्ट निर्धारण लक्ष्य है और लक्ष्य के संबंध में अलग अलग. एक प्रोटीन sepharose मोती निर्धारण और हूर प्रोटीन एंटीबॉडी के लिए विशिष्टता आत्मीयता के आधार पर इस्तेमाल किया गया.
- उपयोग करने से पहले, अतिरिक्त NT2 बफर ऐसा निकालने के लिए,कि बफर अनुपात करने के लिए अंतिम मोती 1:1 है.
- 1.5 मिलीलीटर RNase मुक्त microcentrifuge ट्यूबों का प्रयोग, पीए घोल के 100 μl हटाने और प्रत्येक व्यक्ति आईपी प्रतिक्रिया (यानी, विशिष्ट RBP और निर्धारण नियंत्रण) के लिए एंटीबॉडी के 30 ग्राम जोड़ें.
- एंटीबॉडी मनका मिश्रण NT2 बफर के 100-200 μl जोड़ें.
- मिश्रण 4 में कई हफ्तों के लिए भंडारित किया जा सकता है ° C जब 0.1% सोडियम azide के साथ पूरक.
- एक निर्धारण - मिलान या एक ही प्रजाति से पूरे सामान्य सीरा एंटीबॉडी पृष्ठभूमि शाही सेना के खिलाफ एक एंटीबॉडी नियंत्रण के रूप में समानांतर में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
- मनका मिश्रण करने के लिए उचित एंटीबॉडी जोड़ें और रातोंरात सेते हैं, 4 में अंत पर अंत tumbling डिग्री सेल्सियस
- जांच की जा रही विशिष्ट प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी अनुमापांक का अनुकूलन (एंटीबॉडी के 1, 5, 10, या 30 ग्राम आमतौर पर पर्याप्त है).
- का उपयोग करने से पहले तुरंत 1 मिलीलीटर के साथ धोने से एंटीबॉडी में लिपटे मोतियों की तैयारीठंडा NT2 5 बार बफर.
- में 1-2 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 13,000 XG पर centrifugation द्वारा मनका मिश्रण धो
- ध्यान से हाथ pipettor या aspirator के साथ supernantant की अधिकतम राशि को हटाने लेकिन गोली खलल न डालें से बचने के लिए सावधान रहना.
- वॉशिंग एंटीबॉडी के मिश्रण से अबाध रूप में के रूप में अच्छी तरह से एंटीबॉडी RNase contaminants को दूर करने में मदद करता है.
- एक बार अंतिम धोने पूरा हो चुका है, ठंडा NT2 RNase 10 40 यू / μl, 100 मिमी की 10 μl μl सहित लक्ष्य mRNAs, की रक्षा के लिए विभिन्न RNase inhibitors के साथ इलाज के द्वारा पीछा करने के लिए बफर के 700 μl में मोती resuspend डीटीटी और 15 μl EDTA (15 मिमी). NT2 बफर के साथ 1,000 μl मात्रा लाओ.
- Vanadyl ribonucleoside परिसरों EDTA के निरोधात्मक प्रभाव के कारण नहीं किया जाता है.
3. Immunoprecipitation और आरएनए वर्षा
- वैकल्पिक Preclear चरण:
- पृष्ठभूमि को कम करने के लिए, मोती और नियंत्रण एंटीबॉडी lysate पूर्व साफ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस उत्पादन में संकेत को कम कर सकते हैं.
- यह कदम आवश्यक हो पृष्ठभूमि कम जब माइक्रोएरे द्वारा पीछा आईपी कर सकता है. यह आम तौर पर qRT-पीसीआर द्वारा पीछा किया आईपी के लिए आवश्यक नहीं है.
- अंत पर 30 मिनट / 4 ° C tumbling अंत के लिए निर्धारण नियंत्रण के 15 ग्राम के साथ Preclear.
- 2.1 कदम से एंटीबॉडी के साथ गैर लेपित preswollen पीए मोतियों की 50 μl जोड़ें.
- 30 मिनट / 4 ° C रोटेशन अंत के साथ अंत पर सेते
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र आईपी के लिए सतह पर तैरनेवाला सहेजें.
- तैयार एंटीबॉडी मिश्रण करने के लिए अलग मंजूरी दे दी lysate (2-5 लगभग मिलीग्राम) के 100 μl जोड़ें.
- गिराए lysate पृष्ठभूमि और nonspecific बाध्यकारी को कम करने में मदद मिलेगी.
- Lysate इनपुट की राशि विधि का पता लगाने और RBP ओ की बहुतायत के आधार पर भिन्न हो सकते हैंr RBP एंटीबॉडी की दक्षता को रूप में कदम 1.1.c. में नोट किया गया
- (वैकल्पिक) तुरंत धीरे 10,000 XG पर 4 में कई बार संक्षिप्त centrifugation flicking द्वारा ट्यूब मिश्रण डिग्री सेल्सियस गोली मोती और तुरंत qPCR मानक शाही सेना अलगाव तकनीक का उपयोग करते हुए विश्लेषण के लिए कुल निवेश mRNA प्रतिनिधित्व के रूप में सतह पर तैरनेवाला के 100 μl हटा दें.
- यह कदम पुष्टि करने के लिए है कि इनपुट lysate आरएनए आईपी के लिए इष्टतम है और केवल एक चेक कदम के रूप में या गरीब आरएनए परिणामों के साथ चीर के बाद एक समस्या निवारण चरण के रूप में किया जाना चाहिए है.
- लपेटें parafilm में ट्यूब 2 से 4 घंटे के लिए तंग सील और 4 में सेते ° सी सुनिश्चित करने के लिए, अंत पर अंत tumbling.
- ऊष्मायन पर समय लक्ष्य बहुतायत पर आधारित अनुकूलित किया जाना चाहिए और जटिल पुनर्व्यवस्था या गिरावट से बचने के लिए कम से कम किया जाना चाहिए. कुछ RBPs कम incubations अधिक इष्टतम हो सकता है.
- 5000 में गोली मोती xgfया 5 मिनट में 4 डिग्री सेल्सियस और संभावित विश्लेषण के लिए वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा तैरनेवाला बचाने के लिए. -80 पर स्टोर aliquots डिग्री सेल्सियस
- तैरनेवाला अवशिष्ट लक्ष्य प्रोटीन की उच्च मात्रा के साथ aliquots प्रोटीन की एक विफलता के sepharose मोती से उपजी का संकेत हो सकता है.
- जैसा कि पहले बताया गया है, मोती ठंडा NT2 बफर और centrifugation के 1 मिलीलीटर के साथ 5 बार धोने (4 में 5 मिनट के लिए 5000 XG डिग्री सेल्सियस) तो हाथ pipettor या एक वातशोषक के साथ सतह पर तैरनेवाला हटा दें.
- ज्यादा कड़े धोने के तरीकों के क्रम में सोडियम deoxycholate, यूरिया या एसडीएस के साथ NT2 बफर सप्लीमेंट द्वारा पृष्ठभूमि को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- जितना संभव बर्फ पर नमूने रखें और लक्ष्य mRNA का क्षरण को कम करने के लिए तेजी से काम करने के लिए.
- वैकल्पिक: मनका मिश्रण का एक छोटा सा अशेष भाजक (10%) सहेजें या आईपी लक्ष्य पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग प्रोटीन की क्षमता की जाँच करने के लिए समानांतर में एक अतिरिक्त नमूना चलाने.
4. DNase और proteinase कश्मीर उपचार
- धोने के बाद, NT2 बफर के 100 μl के साथ resuspend मोतियों RNase मुक्त 1 DNase (2 यू / μl) के 5 μl के साथ पूरक है.
- 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें. NT2 बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 5000 XG पर अपकेंद्रित्र.
- मोतियों का एक छोटा सा अशेष भाजक (~ 10%) एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण द्वारा आईपी दक्षता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- 100 μl NT2 बफर, 5 μl proteinase (10 मिग्रा / मिली) कश्मीर, और 1 μl 10% एसडीएस में Resuspend पीए गोली.
- 55 सी ° एक पानी में स्नान पर 30 मिनट के लिए resuspended मनका मिश्रण सेते हैं, धीरे से हर 10 मिनट में flicking.
- Proteinase कश्मीर RNP घटकों की रिहाई में सहायता करेगा.
- कमरे के तापमान (आर टी) पर 5 मिनट और तैरनेवाला (~ 100 μl) एकत्र के लिए 5000 XG में गोली मोती.
- 200 μl NT2 मोती बफर, centri जोड़ेंFuge आरटी पर 2 मिनट के लिए 5000 XG, तैरनेवाला (~ 200 μl) और त्यागें मोती इकट्ठा.
- Supernatants (100 μl और 200 μl) का मिश्रण है और एसिड phenol के CHCl 3 के 300 μl निचली परत जोड़ने.
- भंवर, 1 मिनट rt (या 37 ° प्रकार के बरतन में सी) और 1 मिनट के लिए आरटी पर 16,000 XG पर अपकेंद्रित्र.
- ऊपरी परत की 250 μl (इंटरफ़ेस को बाधित नहीं) ले लीजिए, पीएच 5.2, 625 μl ETOH 100% और 5 μl glycoblue में 25 μl सोडियम एसीटेट जोड़ने के लिए, और अच्छी तरह से मिश्रण.
- -20 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात स्टोर
- शाही सेना के उचित वसूली सुनिश्चित करने के glycoblue के अलावा एक वाहक अणु के रूप में अभिनय द्वारा आरएनए गोली की दृश्यता में वृद्धि होगी.
- अगले दिन, 4 में से 3-5 बार उलटा मिश्रण ट्यूबों, 12,000 XG पर स्पिन डिग्री सेल्सियस 30 मिनट के लिए और सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- नीले गोली और उलटा या vortexing से मिश्रण करने के लिए 70% ETOH के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
- 4 डिग्री सेल्सियस से कम 2 मिनट के लिए 12,000 XG अपकेंद्रित्र.
- डीतैरनेवाला iscard और 4 में 1 मिनट के लिए 12,000 XG अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
- 5 मिनट के लिए किसी भी अवशिष्ट एक विंदुक और शुष्क हवा आरटी गोली के साथ 70% ETOH निकालें.
- RNase / DNase मुक्त पानी या किसी अन्य उपयुक्त मात्रा के रूप में जरूरत के 20-40 μl में Resuspend.
- नमूना अब qRT पीसीआर या माइक्रोएरे के रूप में आगे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए तैयार है.
- नमूना एकाग्रता का आकलन करने में Nanodrop स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, कीमती नमूनों के साथ, यह करने के लिए nanodropping के नमूने से बचने के रूप में यह बेकार और अपेक्षाकृत गलत हो सकता है फायदेमंद हो सकता है. हम गृह व्यवस्था जीन टेप सामान्य नमूने कीमती या कम उपज के नमूने के लिए पवित्रता और आईपी दक्षता का आकलन करने का सुझाव है.
5. प्रतिनिधि परिणाम
अगर प्रक्रिया अनुकूलित है और सही ढंग से किया, immunoprecipitation mRNA लक्ष्य के महत्वपूर्ण संवर्धन उपज चाहिए. आमतौर परRBP और अपने mRNA लक्ष्य (ओं) पर निर्भर करता है, हम लगभग 10 के संवर्धन को देखने - 50-गुना जब qRT-पीसीआर द्वारा मूल्यांकन. RBPs के कई लक्ष्य सामूहिक रूप से खोज की जा सकती माइक्रोएरे विश्लेषण का उपयोग. हालांकि, इस पद्धति अधिक गिरावट के लिए संवेदनशील qRT - पीसीआर के साथ तुलना के रूप में है. RBP, लक्ष्य और प्रतिक्रिया की दक्षता की संख्या पर निर्भर करता है, माइक्रोएरे उपन्यास लक्ष्य के सैकड़ों पता चलता है, कर सकते हैं या यह केवल कुछ को उजागर हो सकता है, यदि कोई हो. उदाहरण के लिए, एक बेहतर विशेषता आरएनए बंधनकारी प्रोटीन हूर के, के बाद transcriptionally और कई महत्वपूर्ण शारीरिक 1 जीन, 2 की अभिव्यक्ति अनुवाद को नियंत्रित करता है. हूर - ribonucleo परिसर के माध्यम से स्तन कैंसर कोशिका लाइनों में चीर - चिप अलगाव, उदाहरण के लिए, कई महत्वपूर्ण ज्ञात qRT-पीसीआर का उपयोग कर के रूप में चित्र 1 में दिखाया β-actin सहित हूर लक्ष्य, के संवर्धन का पता चला. दोनों कैंसर कोशिका लाइनों में β-actin 12 समृद्ध है - 15-गुना. आमतौर पर, जब ठीक से प्रदर्शन हम एक महत्वपूर्ण ENRβ-actin सेल लाइनों की एक किस्म में ichment. हालांकि, अगर चीर β-actin के लिए किसी भी महत्वपूर्ण संवर्धन प्रकट नहीं करता है इस चीर के साथ एक समस्या का संकेत है और प्रक्रिया को दोहराया जा आवश्यकता हो सकती है. इसके अलावा, इन सेल लाइनों immunoprecipitated नमूने के माइक्रोएरे विश्लेषण अलग एस्ट्रोजन रिसेप्टर में हूर लक्ष्य के विशिष्ट अभिव्यक्ति कैंपेन्स (ईआर) ईआर नकारात्मक MB-231 स्तन कैंसर के रूप में सेल लाइनों बनाम सकारात्मक MCF-7 कैंसर की कोशिकाओं को 2 1 चित्रा में प्रदर्शन का पता चला. ज्ञात और अज्ञात हूर लक्ष्य है कि या तो जुड़े थे और कैंसर के साथ जुड़ा नहीं: इन लक्ष्यों को कई श्रेणियों में गिर जाते हैं. उदाहरण के लिए, CALM2 और CD9 दोनों कैंसर जीन है जो पहले हूर लक्ष्य के रूप में नहीं पहचान की गई. 180 गुना हूर गोली में समृद्ध हूर प्रोटीन और इन लक्ष्य जीन के बीच एक प्रमुख बातचीत का संकेत माइक्रोएरे और qRT-पीसीआर, CALM2 और CD9 साथ की पुष्टि करने के लिए 5 पाए गए.
चित्रा 2. हूर चीर - चिप ईआर + और ईआर स्तन कैंसर की कोशिकाओं में अलग आनुवंशिक प्रोफाइल को पहचानती है.हूर immunoprecipitations MB-231 या MCF 7-सेल lysates हूर एंटीबॉडी और IgG1 निर्धारण Illumina Sentrix arrays (+४७,००० जीन) संकरित नियंत्रण का उपयोग से प्रदर्शन किया गया. नियंत्रण संकेतों थे घटाया. परिणाम 12 अलग arrays से संचयी डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं. प्रयोगों मिलान नियंत्रण के साथ प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए तीन प्रतियों (n 3 =) में किया गया. लीब्रा log2 हैं.
Discussion
इस प्रयोग, अनुकूलन, और अनुभव की प्रकृति के कारण केवल गारंटी करने के लिए सफलतापूर्वक इच्छित परिणाम प्राप्त करने के तरीके का हो जाएगा. इस प्रक्रिया के कई चरणों में, तापमान और अभिकर्मकों और उत्पादों के कुशल से निपटने के गंभीर रूप से महत्वपूर्ण हैं. उचित योजना और तकनीक के निष्पादन में मदद मिलेगी बीमा है कि प्रयोग इष्टतम सिफारिश तापमान पर एक उचित समय सीमा में प्रदर्शन किया गया था. शाही सेना अलगाव प्रयोगों के साथ एक प्रमुख मुद्दा RNAs के RNases गिरावट के लिए संवेदनशीलता है. सभी अभिकर्मकों RNase मुक्त और संग्रहीत या RNase मुक्त कंटेनरों में इस्तेमाल होने की जरूरत है. यह अपनी mRNA नमूना की अखंडता को सुनिश्चित करने में एक महत्वपूर्ण कदम है. यहां तक कि जब प्रयोग ठीक से किया जाता है, तथापि, वांछित परिणाम RBP और अपने लक्ष्य mRNAs के बीच बातचीत की प्रकृति की वजह से नहीं हासिल हो सकता है.
एक संभावित समस्या कम या भी शाही सेना से कोई संकेत चीर चिप से अलग हो रही है.हालांकि कुल शाही सेना से संकेत हो सकता है, यह अपर्याप्त बाध्यकारी प्रोटीन मोती से नीचे खींच लिया जा रहा है का परिणाम हो सकता है. पहली समस्या निवारण चरण पुष्टि करने के लिए है कि सेलुलर lysate इस्तेमाल किया जा रहा है विशिष्ट RBP की पर्याप्त अभिव्यक्ति है. पुष्टि होने पर, प्रोटीन अंतिम NT2 धोने के बाद अलग किया जा सकता है और Laemmli बफर या किसी अन्य उपयुक्त denaturing बफर में resuspended और 95 पर गरम डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण इनपुट के रूप में के रूप में अच्छी तरह से lysate नकारात्मक नियंत्रण के साथ समन्वय में इन नमूनों पर इस्तेमाल किया जा सकता है जुड़े प्रोटीन की पर्याप्त नीचे खींच करने के लिए सुनिश्चित करें.
इसके अलावा, क्योंकि सेल lysing इन घटकों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है, सामान्य रूप से अलग प्रोटीन और mRNA के बीच असामान्य और अवांछित बातचीत के लिए संभावित पेश किया जा सकता है. इन मुलाकातों संभावित बाँध और "सोख" nonspecific बातचीत के माध्यम से अपने लक्ष्य mRNAs या बंधनकारी प्रोटीन सकता है. इसके अतिरिक्त इन अलग सह में, प्रोटीनकई रूपों में nditions गुना और उनके बंधन रूपांकनों अपने लक्ष्य mRNAs दुर्गम हो जाता है, उनकी बातचीत को रोकने कर सकते हैं. इन दोनों कुशलता से काम कर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इष्टतम इन अवांछित बातचीत को सीमित करने के लिए सूचीबद्ध तापमान के उपयोग के महत्व को मजबूत. इसके अतिरिक्त, प्रत्येक विशिष्ट लक्ष्य प्रोटीन के लिए वाशिंग शर्तों के अनुकूलन के लिए बातचीत की पवित्रता को अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण होगा. अधिक कड़े धोने की स्थिति की जरूरत हो सकती है. उदाहरण के लिए, धोने बफर एसडीएस या यूरिया अपने संकेत उत्पादन में nonspecific बातचीत और पृष्ठभूमि को कम करने का एक उचित मात्रा के साथ पूरक हो सकता है. यह प्रयोगकर्ता के लक्ष्य के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपने अद्वितीय शारीरिक स्थितियों में लक्ष्य mRNA RBP पर पूरी तरह से निर्भर हो जाएगा. कुछ शर्तों कुछ mRNA विश्लेषण उपकरण है, जो नमूनों की तैयारी में ध्यान दिया जाना चाहिए के लिए उपयुक्त नहीं होगा.
अंत में, हालांकि चीर शाही सेना के संवर्धन में सफल होता हैRBP बातचीत, चीर विधि (चिप) के साथ एक अच्छी तरह से ज्ञात मुद्दा क्षणिक mRNA लक्ष्य पर RBP की विशिष्ट बंधनकारी डोमेन की पहचान करने में असमर्थता है. अद्वितीय अनुक्रम लक्ष्य को अलग करने के लिए चीर द्वारा पीछा किया जाना कई पार से जोड़ने की तकनीक इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन है, छोटी लहर यूवी के उपयोग न्यूक्लिक एसिड क्षति का कारण बन जाता है. एक नए PAR क्लिप, या photoactivatable ribonucleoside crosslinking और immuoprecipitation, के रूप में जाना जाता विधि लंबी लहर नवजात दोनों स्थिर और क्षणिक आरएनए बातचीत से अद्वितीय बाध्यकारी साइटों की पहचान की अनुमति शाही सेना में thiouridine शामिल यूवी कार्यरत हैं.
कुल मिलाकर, चीर - चिप एक उत्कृष्ट को अलग करने और हमारे समूह के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कई अन्य अनुसंधान समूहों द्वारा शाही सेना बंधनकारी प्रोटीन और उनके mRNA लक्ष्य के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया उपकरण के रूप में स्थापित किया गया है. हालांकि प्रकृति और व्यवहार में संवेदनशील, इस प्रक्रिया के समुचित निष्पादन इन RNP परिसरों के अलगाव है, जो हाल ही में जब तक किया गया है, inacc निकलेगाखोज और विश्लेषण के लिए essible.
Disclosures
लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा हितों की है.
Acknowledgments
रक्षा विभाग (आइडिया पुरस्कार W81XWH-07-0,406) - Ulus Atasoy
Ulus Atasoy NIH RO1 A1080870
Ulus Atasoy NIH R21 A1079341
मिसौरी संस्थागत फंड के विश्वविद्यालय - Ulus Atasoy
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M dithiothreitol | Fisher | BP172-5 | DTT |
| DNase 1 | Ambion | 2235 | RNase free |
| Ethylendiamine Tetraccetic Acid | Fisher | BP118-500 | EDTA |
| Glycogen | Ambion | 9516 | |
| 1 HEPES | Sigma | H3375-100G | pH 7.0 |
| Igepal Nonidet P-40 | USB | 78641 | NP40 |
| 1 M KCl | Fisher | BP366-500 | |
| 1 M MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
| NT2 Buffer | *See Below | ||
| Polysome Lysis Buffer | *See Below | ||
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11873580001 | |
| Protein A Sepharose Beads | Sigma | P3391 | |
| Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
| RNase Out RNase inhibitor | Invitrogen | 10777-019 | 40 U/μl |
| 1 M NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher | BP166-500 | SDS |
| 1 M Tris-HCl | Fisher | BP153-500 | pH 7.4 |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | New England Labs | S1402S | VRC |
| Reagent Workup | |||
| Prepare reagents in RNase/DNase-free, DEPC-treated glassware | |||
| Polysome lysis Buffer | |||
| 100 mM KCl | |||
| 5 mM MgCl2 | |||
| 10 mM HEPES (pH 7.0) | |||
| 0.5% NP40 | |||
| 1 mM DTT | |||
| 100 units/ml RNase Out | |||
| 400 μM VRC | |||
| Protease inhibitor cocktail tablet | |||
| 5 ml of Polysome lysis buffer | |||
| Add 50 μl of 1 M HEPES (pH 7.0) | |||
| 500 μl of 1 M KCL | |||
| 25 μl of 1 M MgCl2 | |||
| 25 μl of NP40 | |||
| 4.7 ml RNase-DNase-free H2O | |||
| 50 μl of 1 M DTT | |||
| 12.5 μl of 100 U/ml RNase Out | |||
| 200 μl Protease inhibitor cocktail (dissolved according to manufacturer) | |||
| 10 μl 200 mM VRC (at time of use) | |||
| NT2 Buffer | |||
| 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) | |||
| 150 mM NaCl | |||
| 1 mM MgCl2 | |||
| 0.05% NP40 | |||
| 1 L of NT2 Buffer | |||
| 50 ml Tris (pH 7.4) | |||
| 30 ml 5 M NaCl | |||
| 1 ml 1 M MgCl2 | |||
| 500 μl NP40 | |||
| 820 ml RNase-DNase-free H2O |
References
- Calaluce, R., Gubin, M. M., Davis, J. W., Magee, J. D., Chen, J., Kuwano, Y., Gorospe, M., Atasoy, U. The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer. BMC Cancer. 10, 126-140 (2010).
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