Summary
En trinnvis protokollen til å isolere og identifisere RNA knyttet komplekser gjennom RIP-Chip.
Abstract
Som et resultat av utviklingen av high-throughput sekvensering og effektiv microarray analysen har global genekspresjonsanalyse blitt en enkel og lett tilgjengelig form for datainnsamling. I mange forskning og sykdom modeller imidlertid ikke steady state nivåer av målet genet mRNA ikke alltid direkte korrelerer med steady state protein nivåer. Post-transcriptional genregulering er en sannsynlig forklaring på avviket mellom de to. Drevet av bindingen av RNA Binding Proteins (RBP), påvirker etter-transkripsjonell regulering mRNA lokalisering, stabilitet og oversettelse ved å danne en ribonucleoprotein (RNP) kompleks med target mRNAs. Identifisere disse ukjente de novo mRNA mål fra mobilnettet ekstrakter i RNP komplekset er sentral for å forstå mekanismer og funksjoner av RBP og deres resulterende effekt på protein utgang. Denne protokollen skisserer en metode kalt RNP immunoutfelling-microarray (RIP-Chip), som gjør det mulig for identifisering av specific mRNAs forbundet i ribonucleoprotein komplekse, under skiftende eksperimentelle forhold, sammen med alternativer for å ytterligere optimalisere et eksperiment for den enkelte forsker. Med denne viktige eksperimentelt verktøy, kan forskerne undersøke intrikate mekanismer knyttet til post-transcriptional genregulering samt andre ribonucleoprotein interaksjoner.
Protocol
Eksperimentforberedelsene
Før du starter forsøket, er det avgjørende å ha alle reagenser, containere og kjøkkenutstyr RNase gratis. Unn glass med RNase inhibitor (RNaseZAP, Ambion) etterfulgt av skylling med DEPC behandlet vann. Sikre at alle reagenser er bekreftet som RNase gratis.
1. Forbered mRNP lysate
- Vokse og høste eksponentielt voksende vevsceller å produsere mellom 2-5 mg totalt protein for hver RIP.
- To P150 kultur retter er vanligvis tilstrekkelig.
- For hver RBP under etterforskning, må totalt mobilnettet nummer og protein mengder være optimalisert for å maksimere passende mål mRNA og RBP interaksjoner.
- RIP for QRT-PCR-analyse kan kreve mindre mobilnettet lysate (ca. 400 mikrogram total protein) på grunn av sin forsterkning og deteksjonsmetode spesielt for stor overflod RBPs som Hur, AUF1, TIAR.
- Pellet celler via sentrifugering ved 200 xg i 8-10 minutter ved 4 ° C, deretter vaskes tre ganger med iskald PBS.
- Etter siste vask, forsiktig flick rørbunnen og resuspender cellepelleten i like volumer av forberedt polysome lyseringsbuffer (PLB) med RNase og proteasehemmere.
- Det er anbefalt å måle ut nøyaktig volum av cellepellet.
- Forsiktig Pipetter blandingen (ikke vortex) for å bryte fra hverandre klumper av celler og inkuber lysat på is i 5 min.
- Sentrifuge ved 13.000 xg i 20 min ved 4 ° C for å fjerne lysatet av rusk.
- Umiddelbart overføre ryddet supernatant til pre-kjølt mikrosentrifuge tube.
- Hold på isen og oppbevar ved -80 ° C.
- Umiddelbar frysing fullfører riktig lysering av cellene og forhindrer uønsket binding. Fortsett med RIP umiddelbart etter prøven tine og holde prøver på isen for å unngå RNA degradering. </ Li>
- Dette lysat kan lagres i inntil seks måneder ved -80 ° C. Unngå gjentatt frysing tine sykluser som dette kan føre til protein og / eller mRNA degradering.
- Kvantifisere proteinkonsentrasjonen i lysat med standard Bradford Protein analysen.
2. Frakk Protein A Sepharose Perler med antistoff og Wash
- Pre-dønning protein A Sepharose (PAS) perler over natten i NT2 buffer (3-4 volumer) med 5% BSA. Oppbevar ved 4 ° C.
- Langtidslagring av opptil flere måneder ved 4 ° C er mulig når supplert med 0,1% natriumazid.
- Protein Sepharose perler bør velges basert på isotype av målet RBP antistoff. Proteiner A, G og A / G alle har spesifikke isotype mål og varierer i mål affinitet. Protein A Sepharose perler ble brukt basert på isotype spesifisitet og affinitet for Hur protein antistoff.
- Før bruk, fjerne overflødig NT2 buffer, såat endelige perler til buffer forholdet er 1:1.
- Anvendelse av 1,5 ml RNase-frie mikrosentrifugerør, fjerne 100 pl av PAS oppslemmingen og legge 30 ug antistoff for hver enkelt IP reaksjon (dvs. spesifikke RBP og isotype kontroll).
- Legg 100-200 pl NT2 buffer til antistoff perle mix.
- Blandingen kan lagres i flere uker ved 4 ° C når supplert med 0,1% natriumazid.
- En isotype matchet antistoff eller hel normale sera fra samme art bør brukes parallelt som et antistoff-kontroll i forhold til bakgrunnsstøy RNA.
- Legg hensiktsmessig antistoff til bead blanding og inkuber over natten, tumbling ende over ende ved 4 ° C.
- Optimaliser antistofftiter for spesifikk protein som undersøkes (1, 5, 10 eller 30 ug antistoff er vanligvis tilstrekkelig).
- Forbered antistoff-belagte perler umiddelbart før bruk ved vasking med 1 mliskald NT2 buffer 5 ganger.
- Vask bead blanding ved sentrifugering ved 13.000 xg i 1-2 min ved 4 ° C.
- Fjern forsiktig den maksimale mengden av supernantant med hånden pipetten eller vifte, men vær forsiktig for å unngå å forstyrre pellet.
- Vasking bidrar til å fjerne ubundet antistoff, så vel som RNase forurensninger fra antistoff blandingen.
- Når den endelige vask er fullført, resuspender perlene i 700 pl iskald NT2 buffer fulgt av behandling med forskjellige RNase inhibitorer å beskytte målet mRNAs, deriblant 10 pl RNase Out at 40 U / ul, 10 ul av 100 mM DTT og 15 pl EDTA (15 mM). Bring volumet til 1000 pl med NT2 buffer.
- Vanadyl ribonucleoside komplekser brukes ikke grunnet hemmende effekt av EDTA.
3. Immunoutfelling og RNA Nedbør
- Valgfritt preclearen trinn:
- For å redusere bakgrunnen, kan perler og kontroll antistoff brukes for å pre-klare lysat. Dette kan redusere signal i produksjonen.
- Dette trinnet kan være nødvendig å redusere bakgrunnen når gjør IP etterfulgt av microarray. Det er generelt ikke nødvendig for IP etterfulgt av QRT-PCR.
- Preclear med 15 ug isotypen kontroll i 30 min / 4 ° C risting ende over ende.
- Tilsett 50 pl preswollen PAS perler ikke-belagt med antistoff fra trinn 2.1.
- Inkuber 30 min / 4 ° C med rotasjon ende over ende
- Sentrifuger ved 10.000 xg ved 4 ° C. Lagre supernatant for IP.
- Legg 100fil isolerte ryddet lysat (ca. 2-5 mg) til forberedt antistoff mix.
- Fortynning lysat vil bidra til å redusere bakgrunn og ikke-spesifikk binding.
- Mengde lysat innspill kan variere avhengig deteksjonsmetode og overflod av RBP or effektivitet RBP antistoff som nevnt i trinn 1.1.c.
- (Valgfritt) Umiddelbart blandingsrøret ved forsiktig flicking flere ganger etterfulgt av kort sentrifugering ved 10.000 xg ved 4 ° C for å pelletere perler og umiddelbart fjerne 100 pl av supernatanten som en total inngang mRNA representasjon for qPCR analyse ved hjelp av standard RNA isolering teknikker.
- Dette trinnet er å bekrefte at innspill lysate RNA er optimal for IP og bør kun utføres som en sjekk trinn eller som et feilsøkingstrinn etter RIP med dårlig RNA resultater.
- Pakk røret i Parafilm å sikre tetthet og inkuber ved 4 ° C i 2-4 h, tumbling ende over ende.
- Timing på inkubering bør optimaliseres basert på målet overflod og bør minimaliseres for å unngå kompleks omleiring eller degradering. For noen RBPs kortere Inkuberinger kan mer optimale.
- Pellet perler på 5000 xgfeller 5 min ved 4 ° C og lagre supernatant for potensiell analyse ved Western blot. Oppbevar alikvoter ved -80 ° C.
- Aliquoter av supernatant med store mengder gjenværende målprotein kan indikere en svikt av proteinet som skal utfelles ved Sepharose-kuler.
- Som beskrevet tidligere, vaske perlene 5 ganger med 1 ml iskald NT2 buffer og sentrifugering (5000 x g i 5 min ved 4 ° C) og deretter fjerne supernatant med hånd pipetten eller en aspirator.
- Strengere vask metoder kan benyttes for å redusere bakgrunnen ved å supplere NT2 buffer med natriumdeoksykolat, urea eller SDS.
- Hold prøvene på is så mye som mulig og arbeide raskt for å minimere nedbrytning av målet mRNA.
- Valgfritt: Lagre en liten alikvot (10%) av limstrengen blanding eller kjøre en ekstra prøve i parallell for å kontrollere IP effektiviteten målprotein ved hjelp av Western blot-analyse.
4. DNase og Proteinase K behandlinger
- Etter vasking, resuspender perler med 100fil NT2 buffer supplert med 5 ul av RNase-fri DNase 1 (2 U / pl).
- Hold ved 37 ° C i 5-10 min. Tilsett 1 ml NT2 buffer og sentrifuger ved 5000 xg i 1 minutt ved romtemperatur.
- En liten (~ 10%) prøve av perlene kan bli brukt til å kontrollere IP effektivitet ved SDS-PAGE-analyse.
- Gjensuspender PAS pellet i 100 pl NT2 buffer, 5 pl proteinase K (10 mg / ml), og 1 ul 10% SDS.
- Inkuber resuspenderte limstrengen blandingen i 30 minutter ved 55 ° C i et vannbad, forsiktig flicking på hvert 10 min.
- Proteinase K skal hjelpe til med utgivelsen av RNP komponenter.
- Pellet perler på 5.000 xg i 5 min ved romtemperatur (RT) og samle supernatanten (~ 100 ul).
- Tilsett 200 ul NT2 buffer til perler, sentrifugeresFUGE 5000 xg i 2 min ved RT, samle supernatanten (~ 200 ul), og kast perler.
- Kombiner supernatanter (100 pl og 200 pl) og tilsett 300 ul nedre lag av syre fenol-CHCl 3.
- Vortex, 1 min RT (eller 37 ° C i shaker) og sentrifuger ved 16.000 xg ved RT i 1 min.
- Samle 250 ul øvre lag (IKKE forstyrre grensesnitt), tilsett 25 pl natriumacetat på 5,2 pH, 625 ul 100% ETOH og 5 pl glycoblue, og bland godt.
- Lagre natten over ved -20 ° C.
- For å sikre riktig gjenvinning av RNA, vil tillegg av glycoblue øke synligheten av RNA pellet ved å opptre som en transportør molekyl.
- Den følgende dag, bland rør ved inversjon 3-5 ganger, spinn ved 12.000 xg ved 4 ° C i 30 min og kast supernatanten.
- Tilsett 1 ml av 70% EtOH til den blå pellet og bland ved inversjon eller virvling.
- Sentrifuger 12.000 xg ved 4 ° C i 2 min.
- Discard supernatant og sentrifugere 12.000 xg i 1 min ved 4 ° C.
- Fjerne eventuelle gjenværende 70% ETOH med en pipette og lufttørk pellet ved RT i 5 min.
- Resuspender i 20-40 ul RNase / DNase-fritt vann eller en annen passende volum etter behov.
- Prøven er nå klar for videre nedstrøms applikasjoner som Qrt-PCR eller microarray.
- NanoDrop spektrofotometri kan brukes i vurderingen prøven konsentrasjon, men med edle prøver, kan det være fordelaktig å unngå nanodropping prøvene som det kan være bortkastet og relativt unøyaktig. Vi foreslår å normalisere prøvene til husholdningsgenet transkripsjoner for å vurdere renhet og IP effektivitet for edle eller lav avkastning prøver.
5. Representant Resultater
Hvis prosedyren er optimalisert og utføres korrekt, bør immunoutfelling gi betydelig anrikning av mRNA mål. Vanligvis, Avhengig RBP og dets mRNA kilde (r), ser vi anrikning på ca 10 - til 50-ganger ved vurdert ved QRT-PCR. Mange mål for RBPs kan bli oppdaget en masse hjelp microarray analyse. Imidlertid er denne metoden mer følsom for nedbrytning sammenlignet med QRT-PCR. Avhengig RBP, antall mål og effektiviteten av reaksjonen kan mikromatriser avdekke hundrevis av nye mål, eller det kan bare avdekke en få, om noen. For eksempel, en av de bedre preget RNA bindende proteiner Hur, post-transkripsjonelt regulerer uttrykket og oversettelse av mange viktige fysiologiske gener 1, 2. Isolasjon av Hur-ribonucleo-kompleks via RIP-Chip i brystkreft cellelinjer, for eksempel, avslørte anrikning av flere viktige kjente Hur mål, inkludert β-aktin hjelp QRT-PCR som vist i figur 1. I begge kreftcellelinjer β-actin er beriket 12 - til 15-fold. Vanligvis, når utført riktig vi se en betydelig enrichment av β-aktin i en rekke cellelinjer. Men hvis RIP ikke avsløre alle signifikante berikelse for β-actin dette indikerer et problem med RIP og prosedyren må gjentas. Videre avdekket mikromatriser analyse av immunoutfelt prøver fra disse cellelinjer distinkte uttrykk undergrupper av Hur mål i forskjellige østrogenreseptor (ER) positiv MCF-7 kreftceller versus ER negative MB-231 brystkreft cellelinjer som demonstrert i Figur 2 en. Disse målene faller inn i flere kategorier: kjente og ukjente Hur mål som enten var forbundet eller ikke assosiert med kreft. For eksempel CALM2 og CD9 er både kreft gener som tidligere ikke var identifisert som Hur mål. Bruke microarray og bekrefter med QRT-PCR, CALM2 og CD9 ble funnet å være 5 - til 180 ganger beriket i Hur pellet som indikerer en fremtredende samspill mellom Hur protein og disse målgener.
Figur 1. Immunoutfelling og RIP i MB-231 (ER-) og MCF-7 (ER +) brystkreft celler. Immunoprecipitations ble utført fra MB-231-eller MCF-7 cellelysater ved anvendelse av anti-Hur monoklonalt antistoff (3A2) og IgG1 isotype kontroll. A. IP Western of Hur avslørt forventet størrelse band som oppdaget av 3A2. Panel på høyre avslører mengder Hur i input lysates brukes fra begge cellelinjer, med β-tubulin som lasting kontroll. B. Kontroll av kvantitativ RT-PCR viste femten og elleve fold enrichments av β-actin, en kjent Hur mål, i 3A2 IP-adresser fra MB-231 og MCF-7, henholdsvis. Alle ΔΔCT verdier ble normalisert til GAPDH. Eksperimenter ble utført i duplikat (n = 2).
Figur 2. Hur RIP-CHIP identifiserer distinkte genetiske profiler i ER + og ER-brystkreftceller.Hur immunoprecipitations ble utført fra MB-231 eller MCF-7 cellelysater bruker Hur antistoff og IgG1 isotype kontroll hybridisert til Illumina Sentrix arrays (47000 gener). Styresignaler ble trukket. Resultatene representerer akkumulerte data fra 12 forskjellige arrays. Eksperimenter ble utført i triplikat (n = 3) for hver cellelinje med matchende kontroller. Skalaer er log2.
Discussion
På grunn av beskaffenheten av dette eksperimentet, optimalisering og erfaring vil være den eneste garantert måter å kunne tilegne de tilsiktede resultater. I mange trinn av denne prosedyren, temperatur og effektiv håndtering av reagenser og produkter er kritisk viktig. Riktig planlegging og gjennomføring av teknikken vil hjelpe sikre at forsøket ble utført på en hensiktsmessig tidsramme på de optimale temperaturer anbefales. Et stort problem med RNA isolering eksperimenter er følsomheten av RNAer for nedbrytning av RNases. Alle reagenser må være RNase fri og lagres eller brukes i RNase-frie beholdere. Dette er et viktig skritt i å sikre integriteten til mRNA prøven. Selv når eksperimentet utføres skikkelig, men, kan det ønskede resultat ikke oppnås på grunn av beskaffenheten av samspillet mellom RBP og dens mål mRNA.
Et potensielt problem er å ha lav eller ingen signal fra RNA isolert ved RIP-Chip.Selv om det kan være et signal fra total RNA, kan dette være et resultat av utilstrekkelig bindingsprotein blir trukket ned av perlene. Det første trinnet i feilsøkingen er å bekrefte at mobilnettet lysate som brukes har tilstrekkelig uttrykk for den spesifikke RBP. Ved bekreftelse, kan protein isoleres etter den siste NT2 vask og resuspendert i Laemmli buffer eller et annet egnet denaturerende buffer og oppvarmet ved 95 ° C i 5 min. Western blot-analyse kan brukes på disse prøvene i samordning med inndata lysat samt negative kontroller for å sikre tilstrekkelig trekk ned av assosiert protein.
Videre, fordi lysering cellen er nødvendig for å få tilgang til disse komponentene, kan den potensielle for unormale og uønskede interaksjoner mellom normalt separerte proteiner og mRNA bli introdusert. Disse interaksjonene kan potensielt binde og "suge opp" målet mRNA eller bindende proteiner gjennom uspesifikke interaksjoner. I tillegg proteiner i disse varierende conditions kan kaste i flere varianter og deres bindende motiver kan bli utilgjengelige for sine mål mRNA, hindrer deres interaksjoner. Begge disse styrke viktigheten av å arbeide effektivt samt utnytte optimale temperaturer oppført å begrense disse uønskede interaksjoner. Tillegg vil optimalisering av vaske driftsforhold for hver bestemte målprotein være kritisk å maksimere renheten av interaksjon. Strengere vaske forhold kan være nødvendig. For eksempel kan vaskebufferen suppleres med SDS eller en passende mengde av urea for å redusere uspesifikke interaksjoner og bakgrunn i signalutgang. Dette vil være helt avhengig av experimenter mål RBP samt målet mRNA i deres unike fysiologiske betingelser. Noen forhold vil ikke være egnet for enkelte mRNA analyseverktøy, som bør nevnes i forberedelse av prøver.
Til slutt, selv om RIP er vellykket i anriking av RNA-RBP interaksjoner, en velkjent problem med RIP (CHIP) metoden er manglende evne til å identifisere de spesifikke bindende domener av RBP på forbigående mRNA mål. Flere tverrbindende teknikkene kan brukes etterfulgt av RIP til isolere unik sekvens mål, men har en tendens til bruk av kortbølget UV til føre til nukleinsyre skade. En ny metode som kalles PAR-CLIP, eller photoactivatable ribonucleoside crosslinking og immuoprecipitation, sysselsetter langbølget UV å innlemme thiouridine inn begynnende RNA slik identifisering av unike bindingssteder fra både stabile og forbigående RNA interaksjoner.
Samlet har RIP-Chip etablert som et utmerket verktøy som brukes til å isolere og studere samspillet mellom RNA proteiner og deres mRNA mål av vår gruppe så vel som mange andre forskningsmiljøer. Selv sensitive i naturen og praksis skal forsvarlig gjennomføring av denne prosedyren gi isolering av disse RNP komplekser, som inntil nylig har vært inaccessible for oppdagelse og analyse.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Department of Defense (Idea Award W81XWH-07-0406) - For å Ulus Atasoy
NIH RO1 A1080870 - To Ulus Atasoy
NIH R21 A1079341 - To Ulus Atasoy
University of Missouri institusjonelle fond - Til Ulus Atasoy
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M dithiothreitol | Fisher | BP172-5 | DTT |
| DNase 1 | Ambion | 2235 | RNase free |
| Ethylendiamine Tetraccetic Acid | Fisher | BP118-500 | EDTA |
| Glycogen | Ambion | 9516 | |
| 1 HEPES | Sigma | H3375-100G | pH 7.0 |
| Igepal Nonidet P-40 | USB | 78641 | NP40 |
| 1 M KCl | Fisher | BP366-500 | |
| 1 M MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
| NT2 Buffer | *See Below | ||
| Polysome Lysis Buffer | *See Below | ||
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11873580001 | |
| Protein A Sepharose Beads | Sigma | P3391 | |
| Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
| RNase Out RNase inhibitor | Invitrogen | 10777-019 | 40 U/μl |
| 1 M NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher | BP166-500 | SDS |
| 1 M Tris-HCl | Fisher | BP153-500 | pH 7.4 |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | New England Labs | S1402S | VRC |
| Reagent Workup | |||
| Prepare reagents in RNase/DNase-free, DEPC-treated glassware | |||
| Polysome lysis Buffer | |||
| 100 mM KCl | |||
| 5 mM MgCl2 | |||
| 10 mM HEPES (pH 7.0) | |||
| 0.5% NP40 | |||
| 1 mM DTT | |||
| 100 units/ml RNase Out | |||
| 400 μM VRC | |||
| Protease inhibitor cocktail tablet | |||
| 5 ml of Polysome lysis buffer | |||
| Add 50 μl of 1 M HEPES (pH 7.0) | |||
| 500 μl of 1 M KCL | |||
| 25 μl of 1 M MgCl2 | |||
| 25 μl of NP40 | |||
| 4.7 ml RNase-DNase-free H2O | |||
| 50 μl of 1 M DTT | |||
| 12.5 μl of 100 U/ml RNase Out | |||
| 200 μl Protease inhibitor cocktail (dissolved according to manufacturer) | |||
| 10 μl 200 mM VRC (at time of use) | |||
| NT2 Buffer | |||
| 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) | |||
| 150 mM NaCl | |||
| 1 mM MgCl2 | |||
| 0.05% NP40 | |||
| 1 L of NT2 Buffer | |||
| 50 ml Tris (pH 7.4) | |||
| 30 ml 5 M NaCl | |||
| 1 ml 1 M MgCl2 | |||
| 500 μl NP40 | |||
| 820 ml RNase-DNase-free H2O |
References
- Calaluce, R., Gubin, M. M., Davis, J. W., Magee, J. D., Chen, J., Kuwano, Y., Gorospe, M., Atasoy, U. The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer. BMC Cancer. 10, 126-140 (2010).
- Gubin, M. M., Calaluce, R., Davis, J. W., Magee, J. D., Strouse, C. S., Shaw, D. P., Ma, L., Brown, A., Hoffman, T., Rold, T. L., Ulus Atasoy, U. Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis. Cell Cycle. 9, 3337-3346 (2010).
- Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nature Protocols. 1, 302-307 (2006).
- Tenenbaum, S. A., Lager, P. J., Carson, C. C., Keene, J. D. Ribonomics: identifying mRNA subsets in mRNP complexes using antibodies to RNA-binding proteins and genomic arrays. Methods. 26, 191-198 (2002).
- Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Atasoy, U., Keene, J. D. Genome-wide regulatory analysis using en masse nuclear run-ons and ribonomic profiling with autoimmune sera. Gene. 317, 79-87 (2003).
- Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14085-14090 (2000).
- Baroni, T. E., Chittur, S. V., George, A. D., Tennebaum, S. A. Advances in RIP-Chip Analysis. Methods in Molecular Biology. 419, 93-108 (2008).
- de Silanes Lopez, I., Zhan, M., Lal, A., Yang, X., Gorospe, M. Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2987-2992 (2004).
- de Silanes Lopez, I., Lal, A., Gorospe, M. HuR: post-transcriptional paths to malignancy. RNA Biol. 2, 11-13 (2005).
- Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide analysis of mRNA stability using transcription inhibitors and microarrays reveals posttranscriptional control of ribosome biogenesis factors. Mol. Cell Biol. 24, 5534-5547 (2004).
- Hieronymus, H., Silver, P. A. Genome-wide analysis of RNA-protein interactions illustrates specificity of the mRNA export machinery. Nat. Genet. 33, 155-161 (2003).
- Hieronymus, H., Yu, M. C., Silver, P. A. Genome-wide mRNA surveillance is coupled to mRNA export. Genes Dev. 18, 2652-2662 (2004).
- Mukherjee, N., Corcoran, D. L., Nusbaum, J. D. Integrative Regulatory Mapping Indicates that the RNA-Binding Protein HuR Couples Pre-mRNA Processing and mRNA Stability. Molecular Cell. 43, 1-13 (2011).
