Summary
Påvisning af en hurtig kvantitativ assay til inhibering af blodkoagulering med lav molekylær vægt-heparin, enoxaparin. Bidraget fra enoxaparin vurderes ved at fjerne sin indflydelse gennem fordøjelse med heparinase. En nærmere beskrivelse af analysen er nærmere beskrevet i vores offentliggjorte papir.
Abstract
Der er behov for et klinisk assay til bestemmelse af hvorvidt en patients blod effektivt antikoaguleret med lav molekylær vægt-heparin (LMWH), enoxaparin. Der er også akutte kliniske situationer, hvor det ville være vigtigt, hvis det kan bestemmes hurtigt. Det foreliggende assay er designet til at opnå dette. Vi kun analyseret humane blodprøver, der fik tilsat kendte koncentrationer af enoxaparin. Det væsentlige træk ved den foreliggende assay er kvantificeringen af virkningen af enoxaparin i en patients blodprøve ved nedbrydning den for at fuldføre inaktivitet med heparinase. To blodprøver blev trukket ind i Vacutainer-rør (Becton-Dickenson, Franklin Lakes, NJ), som fik tilsat enoxaparin; én prøve blev fordøjet med heparinase i 5 minutter ved 37 ° C, den anden prøve repræsenterede patientens baseline antikoaguleret status. Den procentvise kortere koaguleringstid i heparinase-behandlede prøve, sammenlignet med baseline stat, gav det antikoagulerende bidrag enoxaparin. Vi brugte den bærbare, batteridrevet Hemochron 801 apparater til måling af koagulationstider (International Technidyne Corp, Edison, NJ). Apparatet har 2 termostatstyret (37 ° C) assayglas brønde. Vi gennemførte assays i to typer analysekassetterne som er tilgængelige fra fabrikanten af instrumentet. En patron blev ændret for at øge følsomheden. Vi fjernede kaolin fra FTK-ACT patron ved omfattende skylning med destilleret vand, så kun glasoverfladen af røret, og måske påvisning magnet, som aktivatorer. Vi kaldte det vores minimalt aktiveret assay (MAA). Anvendelsen af et minimalt aktiveret assay er blevet undersøgt af os og andre. 2-4 Den anden patron, der blev undersøgt var en aktiveret partiel thromboplastintid (aPTT) assay (A104). Dette blev anvendt som leveret fra fabrikanten. De termostaterede brønde af instrumentet were anvendes til både heparinase fordøjelse og koagulationsassays. Assayet kan gennemføres inden for 10 min. MAA-assay viste robust ændringer i koagulationstid efter heparinase fordøjelse af enoxaparin over en typisk klinisk koncentrationsområde. Ved 0,2 anti-Xa IE enoxaparin per ml blodprøve, heparinase fordøjelse forårsagede et gennemsnitligt fald på 9,8% (20,4 sek) i koagulationstid, ved 1,0 IU per ml af enoxaparin der var en 41,4% reduktion (148,8 sek). Denne rapport kun viser den eksperimentelle anvendelse af assayet, og dens værdi i et klinisk miljø skal stadig fastslås.
Protocol
1. Heparinase Rekonstituering
- Lyofiliseret heparinase I opnås kommercielt (Siemens, Newark Delaware, DadeHepzyme REF B4240-10) i hætteglas indeholdende 1 ug af det oprensede protein. Proteinet opløses i 0,25 ml saltvand (0,9% NaCI).
2. Indsamling af blodprøver
- To blodprøver udtages ved vakuum i natriumcitrat (0,3 ml 0.109M, 3,2%) bufret Vacutainer-rør (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ); rørene er både før tilsætning med en kendt koncentration af enoxaparin, blodvolumen , der trækkes, er 2,7 ml. Det totale indhold er derefter 3,0 ml.
3. Heparinase Fordøjelse
- Hele indholdet af heparinase hætteglas, der kan opsuges i en sprøjte (ca. 0,2 ml, 80% af hætteglasset, 0,8 ug protein), overføres til en Vacutainer rør, 0,2 ml saltvand (0,9% NaCl) tilsættes til det andet rør, der tjener som Baseline tilstand før eliminering af enoxaparin effekt.
- Begge Vacutainer-rør er placeret i den termostaterede brønde i Hemochron apparatet i et tidsrum på 5 min. (Tilstrækkelighed en 5 min fordøjelse tid med heparinase blev etableret i vores tidligere offentliggjorte arbejde. 1)
4. Clotting Assays
- Ved afslutningen af heparinase inkubering 2,0 ml blod overføres til analysekassetten. I tilfælde af MAA-røret, er det på forhånd fyldt med 0,1 ml af 250 mM CaCl2 til at indlede koagulering. Den kommercielle aPTT analysekassette (A104) er designet til at initiere koagulation i helblod, der er blevet trukket ind i Vacutainer rør indeholdende natriumcitrat som antikoagulant.
- HEMOCHRON apparat signalerer afslutningen af blodkoagulation og bevarer de størkningstider på få sekunder. Forskellen i koagulationstider mellem heparinase-behandlede prøve og den oprindelige prøve, divideret med størkning timig for basislinieprøven, giver det procentmæssige fald som følge af eliminering af enoxaparin. Som beskrevet nedenfor, har en kraftig lineære korrelationer er opnået for forholdet mellem procent reduktion i koagulationstid og koncentrationen af enoxaparin prøver med tilsætning af helblod, og for korrelation med målte koncentrationer af enoxaparin ved chromgenic assay af anti-Xa aktivitet. Anti-Xa analyser af enoxaparin koncentration blev udført med et kommercielt kit til en to-trins kromogent assay (BIOPHEN, Aniara, Mason, OH).
Representative Results
Figur 1 viser resultaterne for forholdet mellem den procentiske nedgang i koaguleringstid som følge af eliminering af enoxaparin med heparinase i en serie af spidse koncentrationer af enoxaparin (0,2, 0,4 og 1,0 anti-Xa IU per ml). Resultater er præsenteret for både MAA og APTT-analyse patroner. De målte koncentrationer af enoxaparin fra chromogene analyse af anti-Xa-aktivitet er også inkluderet i abscissen for hvert plot.
Figur 2 viser plots af de samme data som procent nedgang i koagulationstid vs chromogen mål for anti-Xa-aktivitet.
Stærke lineære korrelationer, med høje statistiske betydninger, blev fundet for alle fire relationer.
Figur 1. Point-of care bestemmelser af enoxaparin contribution til koaguleringstider af spiked fuldblod er baseret på ændring i procent (forkortelse) af koagulationstid efter inkubation med heparinase. De tilsatte enoxaparin koncentrationer tilsat til helblod, og de målte anti-Xa-plasmakoncentrationer (middelværdi ± SE, i parenteser) er placeret i abscissen i hver graf. Alle procentvise ændringer i koagulationstider præsenteres som middelværdier og SE, sammen med den gennemsnitlige kortere koaguleringstid i sekunder. Data fra den samme patient er forbundet med stiplede linier. Data for de fire patienter er identificeret med en stjerne i plot A (MAA-resultater) er de samme som de fire patienter i plot B (aPTT assays). Alle resultater repræsenterer enkeltbestemmelser. Pearson korrelationskoefficienterne var r = 0,869 (p = 1,9 x 10 -5) og r = 0,916 (p = 2,8 x 10 -5) for de relationer med MAA og aPTTassay hhv. Gengivet med tilladelse fra Inchiosa et al. 1
. Figur 2 Resultaterne for de procentvise ændringer i størkningstider i point-of-care tests vist i figur 1A og B er plottet mod plasma anti-faktor Xa-koncentrationer A, MAA resultater. B, aPTT assays. Alle resultater er fra enkelte størkningstid assays og enkeltbestemmelser af anti-faktor Xa-koncentrationer. Pearson korrelationskoefficienterne var r = 0,910 (p = 2,5 x 10 -6) og r = 0,922 (p = 2,0 x 10 -5) for de relationer med MAA og aPTT assay, henholdsvis Gengivet med tilladelse fra Inchiosa et al. 1
Discussion
Dette assay af enoxaparin effekt kan tjene som en vigtig mulighed for at bestemme den relative sikkerhed til at udføre en invasiv procedure, der har en ledsagende risiko for blødning eller udvikling af et hæmatom. Dette vil være særligt vigtigt, når en epidural injektion overvejes. Størstedelen af retningslinjer anbefaler en karensperiode på 12 timer mellem injektion af enoxaparin og indledning af en invasiv procedure 5 Nedsat nyrefunktion, fedme og graviditet kan påvirke doseringen kravene til enoxaparin 6,7 Da analysen kan gennemføres inden for en 10.. - min periode, kan det også anvendes på en klinik eller lægens kontor, hvor det ville give oplysninger om tilstrækkeligheden af antikoagulation hos patienter, som er i risiko for udvikling af venøs tromboembolisme. Umiddelbare dosisjusteringer kan anlægges efter behov.
Den enoxaparin koncentration i plasma kan måles ved et chromogent assay af graden af inhibering af koagulationsfaktor, Xa. Men dette kun giver sin koncentration, ikke specifikt dets antikoagulerende effekt, som varierer meget blandt de enkelte patienter. 6-8
Vores undersøgelser blev udført kun med enoxaparin. Imidlertid kan det forventes, at assayet kan anvendes på enhver LMWH, der nedbrydes af heparinase I. Dette er allerede kendt at være tilfældet for dalteparin, nadroparin og tinzaparin. 9-11 Vi har designet af assayet i forhold til træk ved til Hemochron størkningstid instrument. Instrumentet er relativt billigt, også, at de disponible blodopsamlingsrør, heparinasepræparat ampuller og analysens patroner gennemføre en analyse for én patient er omkring 15 US dollars. Det ville således forventes at være egnet til at overvåge antikoagulerende status i forskellige kliniske omgivelser.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Undersøgelserne blev udført udelukkende med støtte fra afdelinger og institutionelle ressourcer. Koagulering apparat (Hemochron 801) blev udlånt uden forpligtelse fra producenten. The assay patroner blev købt i deres omkostninger på detailniveau. Det indledende figur i videoen blev ændret fra Sanderink, et al. 12 Det andet tal i videoen (heparinase fordøjelse tidsforløb) blev gengivet med tilladelse fra Inchiosa et al. 1
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hepzyme | Siemens AG | B4240 | heparinase I |
| "MAA" cartridge | Technidyne | FTK-ACT | modified by kaolin removal |
| aPTT cartridge | Technidyne | A104 |
References
- Inchiosa, M. A. J. r, Pothula, S., Kubal, K., Sanchala, V. T., Navarro, I. Toward development of a point-of-care assay of enoxaparin anticoagulant activity in whole blood. J. Thromb. Thrombolysis. 32, 47-53 (2011).
- Despotis, G. J., Filos, K. S., Levine, V., Alsoufiev, A., Spitznagel, E. Aprotinin prolongs activated and nonactivated whole blood clotting time and potentiates the effect of heparin in vitro. Anesth. Analg. 82, 1126-1131 (1996).
- Pothula, S., Inchiosa, M. A. Jr, Sanchala, V. T., Sarabu, M., Inchiosa, A. S. In vitro effect of protamine excess on blood coagulation assays. Anesth Analg. 96, SCA39 (2010).
- Inchiosa, M. Jr, Pothula, S., Sanchala, V., Kubal, K. Detection of low plasma levels of low molecular weight heparin. Anesth Analg. 102, SCA10 (2010).
- Gogarten, W. The influence of new antithrombotic drugs on regional anesthesia. Curr. Opin. Anaesthesiol. 19, 545-550 (2006).
- Gouin-Thibault, I., Pautas, E., Siguret, V. Safety profile of different low-molecular weight heparins used at therapeutic dose. Drug Saf. 28, 333-349 (2005).
- Bazinet, A., Almanric, K., Brunet, C., Turcotte, I., Martineau, J., Caron, S., Blais, N., Lalonde, L. Dosage of enoxaparin among obese and renal impairment patients. Thromb. Res. 116, 41-50 (2005).
- El Rouby, S., Cohen, M., Gonzales, A., Hoppensteadt, D., Lee, T., Zucker, M. L., Khalid, K., LaDuca, F. M., Fareed, J. The use of a HEMOCHRON JR. HEMONOXTM point of care test in monitoring the anticoagulant effect of enoxaparin during interventional coronary procedures. J. Thromb. Thrombolysis. 21, 137-145 (2006).
- Yang, V. C., Bernstein, H., Cooney, C. L., Kadam, J. C., Langer, R. Removal of the anticoagulant activities of the low molecular weight heparin fractions and fragments with flavobacterial heparinase. Thromb Res. 44, 599-610 (1986).
- Maddineni, J., Walenga, J. M., Jeske, W. P., Hoppensteadt, D. A., Fareed, J., Wahi, R., Bick, R. L. Product individuality of commercially available low-molecular-weight heparins and their generic versions: therapeutic implications. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 12, 267-276 (2006).
- Wijnhoven, T. J., van de Westerlo, E. M., Smits, N. C., Lensen, J. F., Rops, A. L., vander Vlag, J., Berden, J. H., vanden Heuvel, L. P., van Kuppevelt, T. H. Characterization of anticoagulant heparinoids by immunoprofiling. Glycoconj. J. 25, 177-185 (2008).
- Sanderink, G. -J. C. M., Guimart, C. G., Ozoux, M. -L., Jariwala, N. U., Shukla, U. A., Boutouyrie, B. X. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of the prophylactic dose of enoxaparin once daily over 4 days in patients with renal impairment. Thromb. Res. 105, 225-231 (2002).
