Summary
低分子量ヘパリン、エノキサパリンによる血液凝固の阻害の迅速な定量分析のデモンストレーション。エノキサパリンの寄与はヘパリナーゼで消化することを通じてその影響を除去することにより評価される。アッセイのより詳細な説明は、当社発表された論文に詳述されている。
Abstract
患者の血液を効果的に低分子量ヘパリン（LMWH）、エノキサパリンによる抗凝固する程度を決定するための臨床検査の必要があります。これは急速に決定することができれば、それは重要であろう緊急の臨床状況もあります。本アッセイは、これを達成するために設計されています。我々は唯一のエノキサパリンの既知濃度を添加したヒト血液試料をアッセイした。本アッセイの本質的な特徴は、ヘパリナーゼと非アクティブを完了するために分解することによって、患者の血液試料中のエノキサパリンの効果の定量化である。エノキサパリンを添加した。2つの血液サンプルがバキュテイナー管（フランクリンレイクス、ニュージャージー州ベクトン·ディッキンソン）に引き込まれた1サンプルは37°Cで5分のためにヘパリナーゼで消化した後、他のサンプルは、患者のベースライン抗凝固状態を表していた。 bに比べてヘパリナーゼ処理したサンプルの凝固時間のパーセント短縮、aseline状態は、エノキサパリンの抗凝固貢献をもたらした。私たちは、凝固時間の測定（国際Technidyne社、エジソン、ニュージャージー州）のためのポータブル、バッテリ駆動Hemochron 801装置を使用していました。装置は2サーモスタット制御（37℃）アッセイ井戸を持っています。我々は、楽器のメーカーから入手可能であるアッセイカートリッジの2種類のアッセイを実施した。ワンカートリッジはその感度を向上させるように変更されました。我々は、活性化剤として、唯一の管のガラス表面、おそらく検出用マグネットを残して、蒸留水でリンスすることにより広範FTK-ACTカートリッジからカオリンを削除しました。我々は、この私たちの最低限の活性化アッセイ（MAA）を呼んだ。最小限の活性化アッセイを使用することは、私たちと他の人が研究されてきた。検討した2月4日第二カートリッジは、活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）アッセイ（A104）であった。メーカーから供給されるので、これを使用した。楽器WERのサーモスタット井戸eはヘパリナーゼ消化および凝固アッセイの両方に使用される。アッセイは10分以内に完了することができます。 MAAのアッセイは、典型的な臨床濃度範囲にわたって、エノキサパリンのヘパリナーゼ消化後に凝固時間で堅牢な変化を示した。 0.2で血液試料1ml当たりエノキサパリンの抗Xa IU、ヘパリナーゼ消化は、凝固時間で9.8％（20.4秒）の平均減少を引き起こし、エノキサパリンのmlあたり1.0 IUで41.4％減（148.8秒）であった。このレポートは、アッセイの実験的なアプリケーションを提示します。臨床現場でその値がまだ確立されなければならない。
Protocol
1。ヘパリナーゼ再構成
- 凍結乾燥ヘパリナーゼ私は精製されたタンパク質の1μgを含むバイアル中（シーメンス、ニューアーク、デラウェア州DadeHepzyme REF B4240-10）市販のものを入手されています。タンパク質は、生理食塩水の0.25ミリリットル（0.9％NaCl）中に溶解させる。
2。血液サンプルの収集
- バキュテイナー管（;フランクリンレイクス、ニュージャージーベクトン·ディッキンソン）は、バッファリングされた、2つの血液サンプルは、クエン酸ナトリウム（3.2％0.3ミリリットル0.109M）に真空によって描かれているチューブは、両方のエノキサパリンの既知濃度のプレスパイクであり、血液量2.7ミリリットルは描かれている。総含有量は、3.0 mlである。
3。ヘパリナーゼ消化
- シリンジ（;バイアルの80％、約0.2ミリリットルタンパク質の0.8μg）の中に吸引することができますヘパリナーゼバイアルの内容全体を、1バキュテイナー管に転送され、生理食塩水0.2ミリリットル（0.9％NaCl）をに追加されますバーゼルとなる第2のチューブ、エノキサパリン効果控除前の伊根状態。
- 両方バキュテイナー管を5分間にわたりHemochron装置のサーモスタットウェルに入れています。 （ヘパリナーゼで5分間の消化時間の妥当性は私たちの以前に出版された仕事に設立されました。1）
4。凝固アッセイ
- ヘパリナーゼのインキュベーションの終了時に、血液2.0mlのアッセイ用カートリッジに転送されます。 MAAの管の場合には、凝固を開始する250 mMのCaCl 2 0.1mlであらかじめ入力されています。商業APTTアッセイカートリッジ（A104）は抗凝固剤としてクエン酸ナトリウムを含有するバキュテイナー管に引き込まれた全血中の凝固開始するために設計されています。
- Hemochron装置は、血液凝固の完了を通知し、数秒で凝固時間を保持します。凝固ダシで割っヘパリナーゼ処理試料と基準試料との間の凝固時間の差は、私は、ベースライン試料に対して、エノキサパリンの除去に起因％の減少をもたらす。後述するように、強い線形相関が凝固時間と全血の添加サンプルで、ならびに抗Xaのchromgenicアッセイによるエノキサパリンの測定濃度との相関のためのエノキサパリンの濃度のパーセントの減少との間の関係のために得られている活動。エノキサパリン濃度の抗Xaアッセイは二段発色アッセイ（; Aniara、メーソン、オハイオBIOPHEN）の市販のキットを用いて行った。
Representative Results
図1は、エノキサパリンのスパイク濃度（0.2、0.4、1.0ミリリットル当たり抗Xa IU）の一連のヘパリナーゼとエノキサパリンの除去後に凝固時間のパーセントの減少との関係についての結果を提示します。結果はMAAおよびAPTTアッセイカートリッジの両方のために提示されます。抗Xa活性の発色アッセイからエノキサパリンの測定濃度はまた、各グラフの横軸に含まれています。
図2は、抗Xa活性を発色測定対凝固時間のパーセントの減少と同じデータのプロットを示します。
高い統計的有意性を持つ強い線形相関は、すべての4つの関係でした。
図1エノキサパリンCONTRのケアの決定ポイントのヘパリナーゼとのインキュベーション後の凝固時間の割合（％）の変化に基づいて、スパイクされた全血の凝固時間にibution（短縮）。全血と測定抗Xa血漿中濃度（カッコ内に、平均±SE）に追加されたスパイクエノキサパリン濃度は、各グラフの横軸に配置されます。凝固時間のすべてのパーセントの変更は数秒で凝固時間の平均短縮とともに、手段とSEとして提示されます。同じ患者からのデータは、破線によって接続されています。プロット内のアスタリスクで識別された4人の患者のデータが（MAAの結果）B区で4人の患者（APTTアッセイ）と同じです。すべての結果は、単一の決定を表す。ピアソンの相関係数はr = 0.869（P = 1.9×10 -5）およびr =それぞれMAAおよびaPTTassayとの関係のために0.916（P = 2.8×10 -5）であった。 Inchiosa らから許可を得て複製。1
図2は、図1A及びBに示すように、ポイントオブケアアッセイにおける凝固時間の変化率の結果は、血漿抗Xa因子の濃度に対してプロットされ、MAAの結果、B、APTTアッセイ。すべての結果は、単一の凝固時間アッセイおよび抗Xa因子濃度の単一の測定からです。ピアソンの相関係数はそれぞれInchiosa らから許可を得て複製、MAAおよびAPTTアッセイとの関係のためにはr = 0.910（P = 2.5×10 -6）とr = 0.922（P = 2.0×10 -5）であった。1
Discussion
エノキサパリンの効果このアッセイは、出血や血腫の開発の付随リスクを持っている侵襲的手技を行うの相対的な安全性を決定するための重要な選択肢となる可能性があります。硬膜外注射を検討しているとき、これは特に重要であろう。ガイドラインの大部分は、エノキサパリンと侵襲的処置の開始の注入の間に12時間の待機期間をお勧めします5腎機能障害、肥満、妊娠はエノキサパリンの投与要件に影響を与える可能性がある6,7アッセイは10以内に完了することができるので。 -分の期間は、それは、静脈血栓塞栓症の発症リスクがある患者における抗凝固療法の妥当性に関する情報を提供する診療所や医師のオフィスでも使用することができます。必要に応じて即時投与量の調整は、提起することができます。
血漿中のエノキサパリン濃度が発色することによって測定することができる凝固因子、Xaの阻害の程度ssay。しかし、これだけではありません具体的にはその濃度は、個々の患者によって大きく異なり、その抗凝固効果をもたらす。6月8日
我々の研究は、エノキサパリンを用いて行った。しかし、このアッセイは、すでにダルテパリン、ナドロパリン及びチンザパリンためのケースであることが知られているヘパリナーゼIによって分解され、任意の低分子ヘパリンにも適用できることが予想できます9月11日は、我々の機能に関連してアッセイをデザインHemochron凝固時間測定器。楽器は、比較的安価であり、また、使い捨ての採血管、ヘパリナーゼアンプル、アッセイカートリッジは一人の患者のための分析を完了するには約15ドルです。したがって、それは、様々な臨床現場で抗凝固状態を監視するのに適していることが予想される。
Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
調査はもっぱら部門や機関のリソースからの支援を受けて実施した。凝固装置（Hemochron 801）はメーカーからの義務を負うことなく、貸された。アッセイカートリッジは小売コストで購入した。ビデオの入門図はSanderink らから変更されました。ビデオで12番目の図（ヘパリナーゼ消化の時間経過）がInchiosa らの許可を得て再現しました。1
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hepzyme | Siemens AG | B4240 | heparinase I |
| "MAA" cartridge | Technidyne | FTK-ACT | modified by kaolin removal |
| aPTT cartridge | Technidyne | A104 |
References
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