Summary
Demonstrasjon av en hurtig kvantitativ analyse av hemming av blodkoagulasjon av lav-molekylær-vekt-heparin, enoksaparin. Bidraget av enoksaparin er vurdert ved å fjerne sin innflytelse gjennom fordøyelsen med heparinase. Nærmere beskrivelse av analysen er beskrevet i våre publiserte papir.
Abstract
Det er behov for en klinisk assay for å bestemme i hvilken grad en pasients blod blir effektivt antikoaguleres av lav-molekylær-vekt-heparin (LMWH), enoksaparin. Det finnes også presserende kliniske situasjoner der det ville være viktig hvis dette kunne bestemmes raskt. Foreliggende analysen er utformet for å oppnå dette. Vi bare analysert humane blodprøver som ble tilsatt med kjente konsentrasjoner av enoksaparin. Hovedtrekket ved den foreliggende analysen er kvantifisering av effektiviteten av enoksaparin pasientens blodprøve ved nedverdigende det å fullføre inaktivitet med heparinase. To blodprøver ble trukket inn Vacutainer-rør (Becton-Dickenson, Franklin Lakes, NJ) som ble tilsatt med enoxaparin; en prøve ble digerert med heparinase i 5 min ved 37 ° C, representerte den andre prøven pasientens utgangsnivå antikoagulert status. Den prosentvise forkortelse av koagulasjonstid i heparinase-behandlede prøven, i forhold til baseline staten, ga den antikoagulerende bidrag enoksaparin. Vi brukte den bærbare, batteridrevet Hemochron 801 apparater for måling av clotting ganger (International Technidyne Corp, Edison, NJ). Anordningen har to termostatstyrt (37 ° C)-analysen tube brønner. Vi gjennomførte analysene i to typer analysen patroner som er tilgjengelige fra produsenten av instrumentet. En patron ble endret for å øke følsomheten. Vi fjernet kaolin fra FTK-ACT patronen ved omfattende skylling med destillert vann, slik at bare på glassoverflaten av røret, og kanskje gjenkjennings magnet, som aktivatorer. Vi kalte dette vår minimal aktivert analysen (MAA). Bruk av en minimal aktivert analysen har blitt studert av oss og andre. 2-4 andre kassett som ble studert var en aktivert partiell tromboplastintid (aPTT) analysen (A104). Dette ble brukt som levert fra produsenten. De termostatstyrt brønner i instrumentet were brukes til både heparinase fordøyelse og koagulasjon analyser. Analysen kan gjennomføres innen 10 min. MAA analysen viste robuste endringer i clotting tid etter heparinase fordøyelsen av enoksaparin over en typisk klinisk konsentrasjonsområde. Ved 0,2 anti-Xa IE av enoksaparin per ml blodprøve, forårsaket heparinase fordøyelsen en gjennomsnittlig reduksjon på 9,8% (20,4 sek) i koagulasjonstid, på 1,0 IE per ml av enoksaparin var det en 41,4% reduksjon (148,8 sek). Denne rapporten presenterer bare den eksperimentelle anvendelse av analysen, dens verdi i en klinisk setting må fortsatt være etablert.
Protocol
1. Heparinase Rekonstituering
- Lyofilisert heparinase I er oppnådd kommersielt (Siemens, Newark Delaware, DadeHepzyme REF B4240-10) i hetteglass inneholdende 1 pg av det rensede protein. Proteinet oppløses i 0,25 ml saltvann (0,9% NaCl).
2. Innsamling av blodprøver
- To blodprøver er tegnet av vakuum inn natriumsitrat (0,3 ml 0.109M, 3.2%) bufret Vacutainer-rør (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ); rørene er både pre-spiked med en kjent konsentrasjon av enoksaparin, blodvolumet som er trukket er 2,7 ml. Det totale innhold er da 3,0 ml.
3. Heparinase Fordøyelse
- Hele innholdet av de heparinase hetteglass som kan aspireres til en sprøyte (ca. 0,2 ml, 80% av hetteglasset; 0,8 ug protein), overføres til en Vacutainer tube, 0,2 ml saltvann (0,9% NaCl) tilsettes til det andre røret, som tjener som det baseline tilstand før eliminering av enoksaparin effekt.
- Begge Vacutainer rør er plassert i termostatstyrt brønnene i Hemochron apparat for en periode på 5 min. (The tilstrekkelighet av en 5 min fordøyelsen tid med heparinase ble etablert i vår tidligere publiserte arbeider. 1)
4. Clotting Assays
- På slutten av heparinase inkubasjon 2,0 ml blod overført til analysens patronen. I tilfelle av MAA rør, er det pre-fylt med 0,1 ml av 250 mM CaCl 2 å initiere koagulasjon. Den kommersielle aPTT analysen patronen (A104) er utformet til å initiere koagulering i fullblod som har blitt trukket inn i Vacutainer-rør inneholdende natriumsitrat som antikoagulant.
- Den Hemochron apparat signaliserer ferdigstillelse av blod koagulasjon og bevarer clotting ganger i sekunder. Forskjellen i clotting ganger mellom den heparinase-behandlet prøve og grunnlinjen prøven, dividert clotting TImeg for grunnlinjen prøven, gir den prosentvise nedgangen som følge av eliminering av enoksaparin. Som diskutert nedenfor, har sterke lineære korrelasjoner innhentet for forholdet mellom prosent reduksjon i koagulasjonstid, og konsentrasjonen av enoksaparin piggete prøver av fullblod, samt for korrelasjonen med målte konsentrasjoner av enoksaparin ved chromgenic analysen av anti-Xa aktivitet. Anti-Xa analyser av enoksaparin konsentrasjon ble utført med en kommersiell kit for en to-trinns kromogen substratmetode (BIOPHEN; Aniara, Mason, OH).
Representative Results
Figur 1 viser resultatene for forholdet mellom prosent nedgang i clotting tid etter eliminering av enoksaparin med heparinase for en rekke piggete konsentrasjoner av enoksaparin (0,2, 0,4 og 1,0 anti-Xa IE per ml). Resultater er presentert for både MAA og aPTT analysegrenser patroner. De målte konsentrasjoner av enoksaparin fra kromogen analyse av anti-Xa-aktivitet er også inkludert i abscissen fra hvert plott.
Figur 2 viser plott av de samme data som prosent nedgang i koagulasjonstid vs kromogent mål for anti-Xa-aktivitet.
Sterke lineære sammenhenger, med høy statistisk betydninger, ble funnet for alle fire relasjoner.
Figur 1. Point-of care bestemmelse av enoksaparin kontribution til clotting tider spiked fullblod basert på prosentvis endring (forkorting) av clotting tid etter inkubasjon med heparinase. De piggete enoxaparin konsentrasjoner tilsatt til helblod og de målte anti-Xa plasmakonsentrasjoner (gjennomsnitt ± SE, i parentes) er plassert i abscissen av hver graf. Alle prosent endringer i clotting ganger presenteres som middel og SE, sammen med den gjennomsnittlige avkorting av koagulasjonstid i sekunder. Data fra den samme pasienten er forbundet med stiplede linjer. De data for de fire pasienter identifisert med stjerner i plott A (MAA resultater) er de samme som de fire pasienter i plott B (aPTT analyser). Alle resultatene representerer en analyse. Pearson korrelasjonskoeffisienter var r = 0,869 (p = 1,9 x 10 -5) og r = 0,916 (p = 2,8 x 10 -5) for forbindelser med MAA og aPTTassay henholdsvis. Gjengitt med tillatelse fra Inchiosa et al. En
. Figur 2 Resultatene for de prosentvise endringer i clotting ganger i point-of-care analyser vist i figur 1A og B er plottet mot plasma anti-faktor Xa konsentrasjoner A, MAA resultater,. B, APTT analyser. Alle resultatene er fra enkle koagulasjonstid analyser og enslige bestemmelse av anti-faktor Xa-konsentrasjoner. Pearson korrelasjonskoeffisienter var r = 0,910 (p = 2,5 x 10 -6) og r = 0,922 (p = 2,0 x 10 -5) for relasjoner med MAA og aPTT analysen, henholdsvis Gjengitt med tillatelse fra Inchiosa et al. En
Discussion
Denne analysen av enoksaparin effekt kan tjene som et viktig alternativ for å bestemme den relative sikkerheten til å utføre en invasiv prosedyre som har en ledsager risiko for blødning eller utvikling av et hematom. Dette vil være av særlig betydning når en epidural injeksjon blir vurdert. Flertallet av retningslinjer anbefaler en ventetid på 12 timer mellom injeksjon av enoksaparin og initiering av en invasiv prosedyre 5 Nedsatt nyrefunksjon, fedme og graviditet kan påvirke doseringen krav enoxaparin 6,7 Siden analysen kan gjennomføres innen 10.. - min periode, kan det også bli brukt i en klinikk eller legens kontor, hvor det ville gi informasjon om tilstrekkeligheten av antikoagulasjon i pasienter som har en risiko for utvikling av venøs tromboemboli. Umiddelbar dosejusteringer kan bli reist, etter behov.
Enoxaparin konsentrasjon i plasma kan måles ved et kromogent enssay av graden av hemming av koagulasjonsfaktor, Xa. Men gir dette bare konsentrasjonen, ikke spesielt dens antikoagulerende effekt, som varierer mye mellom de enkelte pasienter. 6-8
Våre studier ble utført bare med enoksaparin. Imidlertid kan det forventes at analysen kan anvendes på en hvilken som helst LMWH som er forringet av heparinase I. Dette er allerede kjent for å være tilfelle for dalteparin, nadroparin og tinzaparin. 9-11 Vi utviklet analysen i forhold til egenskapene til den Hemochron koagulasjonstid instrument. Instrumentet er relativt billig, også, til disponibel blodprøverør, heparinase ampulle, og analysen patroner fullføre en analyse for en pasient er ca $ 15. Dermed ville det være forventet å være egnet for å overvåke antikoagulerende status i forskjellige kliniske omgivelser.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Undersøkelsene ble utført utelukkende med støtte fra avdelinger og institusjonelle ressurser. Koagulasjonssystemet apparater (Hemochron 801) ble lånt uten forpliktelser fra produsenten. Analyseresultatene kassetter ble kjøpt til sine detaljhandel kostnader. Den innledende figur i videoen ble endret fra Sanderink, et al. 12 Den andre figuren i videoen (heparinase fordøyelsen tid selvfølgelig) ble gjengitt med tillatelse fra Inchiosa et al. En
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hepzyme | Siemens AG | B4240 | heparinase I |
| "MAA" cartridge | Technidyne | FTK-ACT | modified by kaolin removal |
| aPTT cartridge | Technidyne | A104 |
References
- Inchiosa, M. A. J. r, Pothula, S., Kubal, K., Sanchala, V. T., Navarro, I. Toward development of a point-of-care assay of enoxaparin anticoagulant activity in whole blood. J. Thromb. Thrombolysis. 32, 47-53 (2011).
- Despotis, G. J., Filos, K. S., Levine, V., Alsoufiev, A., Spitznagel, E. Aprotinin prolongs activated and nonactivated whole blood clotting time and potentiates the effect of heparin in vitro. Anesth. Analg. 82, 1126-1131 (1996).
- Pothula, S., Inchiosa, M. A. Jr, Sanchala, V. T., Sarabu, M., Inchiosa, A. S. In vitro effect of protamine excess on blood coagulation assays. Anesth Analg. 96, SCA39 (2010).
- Inchiosa, M. Jr, Pothula, S., Sanchala, V., Kubal, K. Detection of low plasma levels of low molecular weight heparin. Anesth Analg. 102, SCA10 (2010).
- Gogarten, W. The influence of new antithrombotic drugs on regional anesthesia. Curr. Opin. Anaesthesiol. 19, 545-550 (2006).
- Gouin-Thibault, I., Pautas, E., Siguret, V. Safety profile of different low-molecular weight heparins used at therapeutic dose. Drug Saf. 28, 333-349 (2005).
- Bazinet, A., Almanric, K., Brunet, C., Turcotte, I., Martineau, J., Caron, S., Blais, N., Lalonde, L. Dosage of enoxaparin among obese and renal impairment patients. Thromb. Res. 116, 41-50 (2005).
- El Rouby, S., Cohen, M., Gonzales, A., Hoppensteadt, D., Lee, T., Zucker, M. L., Khalid, K., LaDuca, F. M., Fareed, J. The use of a HEMOCHRON JR. HEMONOXTM point of care test in monitoring the anticoagulant effect of enoxaparin during interventional coronary procedures. J. Thromb. Thrombolysis. 21, 137-145 (2006).
- Yang, V. C., Bernstein, H., Cooney, C. L., Kadam, J. C., Langer, R. Removal of the anticoagulant activities of the low molecular weight heparin fractions and fragments with flavobacterial heparinase. Thromb Res. 44, 599-610 (1986).
- Maddineni, J., Walenga, J. M., Jeske, W. P., Hoppensteadt, D. A., Fareed, J., Wahi, R., Bick, R. L. Product individuality of commercially available low-molecular-weight heparins and their generic versions: therapeutic implications. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 12, 267-276 (2006).
- Wijnhoven, T. J., van de Westerlo, E. M., Smits, N. C., Lensen, J. F., Rops, A. L., vander Vlag, J., Berden, J. H., vanden Heuvel, L. P., van Kuppevelt, T. H. Characterization of anticoagulant heparinoids by immunoprofiling. Glycoconj. J. 25, 177-185 (2008).
- Sanderink, G. -J. C. M., Guimart, C. G., Ozoux, M. -L., Jariwala, N. U., Shukla, U. A., Boutouyrie, B. X. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of the prophylactic dose of enoxaparin once daily over 4 days in patients with renal impairment. Thromb. Res. 105, 225-231 (2002).
