Summary
Демонстрация быстрого количественного анализа ингибирования свертывания крови по низким молекулярным весом гепарин, эноксапарин. Вклад эноксапарина оценивается путем удаления своего влияния за счет расщепления гепариназой. Более подробное описание анализа подробно описана в нашем опубликованной работе.
Abstract
Существует необходимость в клиническом анализе для определения степени, в которой кровь пациента эффективно антикоагуляции по низким молекулярным весом гепарина (НМГ), эноксапарин. Есть также срочно клинических ситуаций, в которых было бы важно, если это может быть определено быстро. Настоящий тест предназначен для достижения этой цели. Мы только анализировали образцы крови человека, что вносили известные концентрации эноксапарина. Существенной особенностью настоящего анализа является количественная оценка эффективности эноксапарина в крови пациента, унижающие его завершения бездействия с гепариназой. Два образцы крови были взяты в Vacutainer труб (Becton-Dickenson, Franklin Lakes, NJ), которые вносили эноксапарина; один образец был обработан с гепариназой в течение 5 мин при 37 ° C, другие образцы представлены базовые пациента антикоагулированной статус. Процент сокращения времени свертывания в гепариназой обработанные образцы, по сравнению с бaseline государство, дали антикоагулянт вклад эноксапарина. Мы использовали портативные, батарейки Hemochron 801 Устройство для измерения времени свертывания (Международная Technidyne корпорации, Edison, NJ). Аппарат имеет 2 термостата (37 ° C) скважин анализа трубку. Мы проводили тесты в двух типах анализа картриджи, которые имеются у производителя прибора. Один патрон был изменен, чтобы увеличить его чувствительность. Мы удалили из каолина FTK-ACT картридж обширные промывкой дистиллированной водой, оставив только стеклянные поверхности трубки, и, возможно обнаружение магнита, как активаторы. Мы назвали это наша минимально активированных анализа (МАК). Использование минимально активированных анализа был изучен нами и другими. 2-4 второй патрон, который был изучен был активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) анализ (A104). Это было использовано при поставке от производителя. Термостатировали скважин документа WERэлектронной использоваться как для переваривания гепариназой и коагуляции анализов. Анализ может быть завершен в течение 10 мин. MAA Анализ показал надежную изменения в свертываемости время после гепариназой пищеварения эноксапарина по сравнению с обычным клиническим диапазоне концентраций. На 0,2 анти-Ха МЕ эноксапарина на мл крови, гепариназой пищеварения вызвано среднем снижение на 9,8% (20,4 секунды), время свертывания крови, в 1,0 МЕ на мл эноксапарина было 41,4% снижения (148,8 сек). Данный отчет представляет только экспериментальным применением анализа, его значение в клинической практике еще должны быть установлены.
Protocol
1. Восстановление гепариназой
- Лиофилизированный гепариназой я получается коммерчески (Siemens, Ньюарк штата Делавэр, DadeHepzyme REF B4240-10) во флаконах, содержащих 1 мкг очищенного белка. Белка растворяли в 0,25 мл физиологического раствора (0,9% NaCl).
2. Сбор образцов крови
- Две пробы крови взяты от вакуума в цитрата натрия (0,3 мл 0.109M; 3,2%), буферного Vacutainer труб (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ); трубы как до, так шипами с известной концентрацией эноксапарина; объем крови что нарисовано на 2,7 мл. Общее содержание затем 3,0 мл.
3. Гепариназой пищеварения
- Все содержимое флакона гепариназой, которые могут быть атмосферный в шприц (около 0,2 мл; 80% флаконе; 0,8 мкг белка), передается одному Vacutainer трубки, 0,2 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) добавляется к Вторая трубка, которая служит Базельскойнеравенства состоянии до устранения эноксапарина эффект.
- Оба Vacutainer трубы помещают в термостатируемой скважин Hemochron аппарата в течение 5 мин. (Адекватность 5 мин пищеварения время с гепариназой была создана в нашей ранее опубликованной работе. 1)
4. Анализы свертываемости крови
- В конце гепариназой инкубации 2,0 мл крови передается на анализ картриджа. В случае MAA трубки, предварительно заполненных 0,1 мл 250 мМ CaCl 2 для начала коагуляции. Коммерческие АЧТВ анализа картриджа (A104) предназначен для инициирования свертывания в цельной крови, которые были вовлечены в Vacutainer пробирки, содержащие цитрат натрия в качестве антикоагулянта.
- Устройство Hemochron сигнализирует о завершении процесса свертывания крови и сохраняет время свертывания в секундах. Разница в времени свертывания между гепариназой обработанных образцов и базовых образцов, деленное на свертывание тиМне для базового образца, дает процентное снижение в результате ликвидации эноксапарина. Как будет показано ниже, сильной линейной корреляции были получены для отношений между процентное снижение времени свертывания крови и концентрации эноксапарина в шипами образцов цельной крови, а также для корреляции с измеряемой концентрации эноксапарина по chromgenic анализа анти-Ха деятельности. Анти-Ха анализы эноксапарина концентрации были проведены с коммерческим комплект для двухступенчатой хромогенного анализа (BIOPHEN; Aniara, Мейсон, Огайо).
Representative Results
На рисунке 1 представлены результаты для отношений между процентное снижение времени свертывания после отмены эноксапарина с гепариназой для серии шипами концентрации эноксапарина (0,2, 0,4 и 1,0 анти-Ха МЕ в мл). Результаты представлены как для MAA и картриджи АЧТВ теста. Измеренная концентрация эноксапарина от хромогенного анализа анти-Ха активности, также включены в абсцисс каждого участка.
На рисунке 2 представлены графики те же данные, процентное снижение времени свертывания против хромогенных меры анти-Ха активности.
Сильные линейной корреляции, с высокой статистической значимости, были найдены для всех четырех отношениях.
Рисунок 1. Point-ухода определения эноксапарина контрГиви, чтобы время свертывания с шипами цельной крови на основе процентного изменения (сокращения) свертывания время после инкубации с гепариназой. Шипами концентрации эноксапарина добавлен в цельной крови и измеренных анти-Ха концентрации в плазме (среднее ± SE, в скобках) помещают в абсцисса каждой графе. Все процент изменения в свертываемости раз представлены в виде средств и SE, вместе со средним сокращением времени свертывания в секундах. Данные из того же пациента связаны пунктирными линиями. Данные для четырех выявленных больных со звездочками в заговоре (MAA результатов) такие же, как у четырех пациентов в заговоре B (АЧТВ анализов). Все результаты представляют однократное измерение. Коэффициенты корреляции Пирсона были R = 0,869 (р = 1,9 · 10 -5) и г = 0,916 (р = 2,8 х 10 -5) за отношения с MAA и aPTTassay, соответственно. Воспроизведено с разрешения Inchiosa и др. 1.
На рис. 2 результаты за процент изменения времени свертывания в точке-санитарной помощи анализов показано на рисунках 1А & B нанесены против плазме анти-Xa фактора концентрации, результаты MAA;. B, АЧТВ анализов. Все результаты находятся в одном свертывания крови Анализы время и одно определение анти-Ха фактора концентрации. Коэффициенты корреляции Пирсона были R = 0,910 (р = 2,5 · 10 -6) и г = 0,922 (р = 2,0 х 10 -5) за отношения с MAA и АЧТВ теста, соответственно Воспроизведено с разрешения Inchiosa и др. 1.
Discussion
Этот анализ эффективности эноксапарина может служить важной опцией для определения относительной безопасности проведения инвазивной процедурой, которая имеет сопутствующий риск кровотечения или развития гематомы. Это было бы особенно важно, когда эпидуральная инъекция рассматривается. Большинство рекомендуют период ожидания 12 часов между введением эноксапарина и начала инвазивные процедуры 5 почечная недостаточность, ожирение и беременность может повлиять на дозирование требования эноксапарина 6,7 Так как анализ может быть завершен в течение 10.. - минутного периода, он также может быть использован в клинике или в кабинете врача, где будет представлена информация о достаточности антикоагулянтов у пациентов, которые находятся на риск развития венозной тромбоэмболии. Немедленная корректировка дозы может быть возбуждено, по мере необходимости.
Эноксапарина концентрации в плазме крови может быть измерен хромогенныхssay степени ингибирования фактора свертывания крови Ха. Однако, это только дает его концентрации, а не конкретно свою эффективность антикоагулянт, который варьируется между отдельными пациентами. 6-8
Наши исследования проводились только с эноксапарина. Тем не менее, можно ожидать, что анализ может быть применен к любой НМГ, который разлагается под гепариназой I. Это уже известно, что в случае дальтепарина, надропарин и тинзапарин. 9-11 Мы разработали тест, в связи с особенностями Hemochron свертывания инструмента времени. Прибор является относительно недорогим, а также, одноразовые для сбора крови труб, гепариназой ампулы, и анализа картриджи для завершения анализа для одного пациента составляет около 15 долларов США. Таким образом, можно было бы ожидать, чтобы быть пригодными для мониторинга состояния антикоагулянт в различных клинических ситуациях.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Исследования проводились исключительно при поддержке ведомственной и институциональные ресурсы. Коагуляции аппарата (Hemochron 801) был отдан в аренду без обязательства от производителя. Анализ картриджи были приобретены на их розничной стоимости. Во вступительной фигурой в видео был изменен с Sanderink и др. 12. Вторая цифра в видео (гепариназой время переваривания конечно) была воспроизведена с разрешения Inchiosa и др. 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hepzyme | Siemens AG | B4240 | heparinase I |
| "MAA" cartridge | Technidyne | FTK-ACT | modified by kaolin removal |
| aPTT cartridge | Technidyne | A104 |
References
- Inchiosa, M. A. J. r, Pothula, S., Kubal, K., Sanchala, V. T., Navarro, I. Toward development of a point-of-care assay of enoxaparin anticoagulant activity in whole blood. J. Thromb. Thrombolysis. 32, 47-53 (2011).
- Despotis, G. J., Filos, K. S., Levine, V., Alsoufiev, A., Spitznagel, E. Aprotinin prolongs activated and nonactivated whole blood clotting time and potentiates the effect of heparin in vitro. Anesth. Analg. 82, 1126-1131 (1996).
- Pothula, S., Inchiosa, M. A. Jr, Sanchala, V. T., Sarabu, M., Inchiosa, A. S. In vitro effect of protamine excess on blood coagulation assays. Anesth Analg. 96, SCA39 (2010).
- Inchiosa, M. Jr, Pothula, S., Sanchala, V., Kubal, K. Detection of low plasma levels of low molecular weight heparin. Anesth Analg. 102, SCA10 (2010).
- Gogarten, W. The influence of new antithrombotic drugs on regional anesthesia. Curr. Opin. Anaesthesiol. 19, 545-550 (2006).
- Gouin-Thibault, I., Pautas, E., Siguret, V. Safety profile of different low-molecular weight heparins used at therapeutic dose. Drug Saf. 28, 333-349 (2005).
- Bazinet, A., Almanric, K., Brunet, C., Turcotte, I., Martineau, J., Caron, S., Blais, N., Lalonde, L. Dosage of enoxaparin among obese and renal impairment patients. Thromb. Res. 116, 41-50 (2005).
- El Rouby, S., Cohen, M., Gonzales, A., Hoppensteadt, D., Lee, T., Zucker, M. L., Khalid, K., LaDuca, F. M., Fareed, J. The use of a HEMOCHRON JR. HEMONOXTM point of care test in monitoring the anticoagulant effect of enoxaparin during interventional coronary procedures. J. Thromb. Thrombolysis. 21, 137-145 (2006).
- Yang, V. C., Bernstein, H., Cooney, C. L., Kadam, J. C., Langer, R. Removal of the anticoagulant activities of the low molecular weight heparin fractions and fragments with flavobacterial heparinase. Thromb Res. 44, 599-610 (1986).
- Maddineni, J., Walenga, J. M., Jeske, W. P., Hoppensteadt, D. A., Fareed, J., Wahi, R., Bick, R. L. Product individuality of commercially available low-molecular-weight heparins and their generic versions: therapeutic implications. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 12, 267-276 (2006).
- Wijnhoven, T. J., van de Westerlo, E. M., Smits, N. C., Lensen, J. F., Rops, A. L., vander Vlag, J., Berden, J. H., vanden Heuvel, L. P., van Kuppevelt, T. H. Characterization of anticoagulant heparinoids by immunoprofiling. Glycoconj. J. 25, 177-185 (2008).
- Sanderink, G. -J. C. M., Guimart, C. G., Ozoux, M. -L., Jariwala, N. U., Shukla, U. A., Boutouyrie, B. X. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of the prophylactic dose of enoxaparin once daily over 4 days in patients with renal impairment. Thromb. Res. 105, 225-231 (2002).
