Summary
De kwaliteit van muizen embryonische fibroblasten (MEF) wordt bepaald door de juiste spanning van muis zoals CF-1. Pluripotentie-ondersteunende MEFs en geconditioneerde media (CM), verkregen van deze moeten bevatten optimale concentraties van Activin A, Gremlin en Tgfβ1 nodig is voor de Activin / Nodal en FGF wegen naar co-operatief te behouden zelfvernieuwing en pluripotentie.
Abstract
In het algemeen menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) en humaan geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) 1 kunnen worden gekweekt onder wisselende omstandigheden. Het is echter niet eenvoudig om een effectief voor het kweken van deze cellen. Omdat de kweekomstandigheden van invloed kunnen zijn expressie van genen die verleent pluripotentie in hESC 's en hiPSCs, de optimalisatie en standaardisatie van de kweekmethode is cruciaal.
De instelling van hESC lijnen werd beschreven door MEF als feeder cellen en foetaal runderserum (FBS) bevattende kweekmedium 2. Vervolgens werd FBS vervangen door knock-out serum vervanging (KSR) en FGF2, die verspreiding van hESC 's 3 verbetert. Tot slot, feeder-vrije cultuur systemen maken het mogelijk het kweken van cellen op Matrigel gecoate platen in KSR-bevattende geconditioneerd medium (medium bepaald door MEF) 4. Vervolgens hebben hESC 's kweekomstandigheden verhuisd naar feeder-vrije cultuur in chemisch defined omstandigheden 5-7. Bovendien hebben om de mogelijke besmetting door ziekteverwekkers en dierlijke eiwitten cultuur methoden met behulp van xeno-vrije componenten te voorkomen is opgericht 8.
Om betere voorwaarden te verkrijgen muis feeder-cellen zijn vervangen door menselijke cellijnen (bijvoorbeeld spier-en foetale huidcellen 9, volwassen huidcellen 10, voorhuid fibroblasten 11-12, vruchtwater mesenchymale cellen 13). Echter, de efficiëntie van de handhaving van ongedifferentieerde hESC 's met behulp van menselijke voorhuid fibroblast-afgeleide feeder lagen is niet zo hoog als dat van de muis feeder cellen als gevolg van het lagere niveau van de secretie van Activin A 14. Uiteraard is er een duidelijk verschil in groeifactor door muizen en mensen feeder cellen.
Analyses van de transcriptomen van muis en mens feeder-cellen aangetoond dat er belangrijke verschillen tussen de ondersteunende en niet-ondersteunende cellen. Exogene FGF2 is cruciaal voor maintaining zelf-vernieuwing van hESC 's en hiPSCs, en is geïdentificeerd als een belangrijke factor die de expressie van Tgfβ1, Activin A en Gremlin (een BMP-antagonist) in feeder-cellen. Activin A is aangetoond dat de expressie van OCT4, SOX2 en NANOG in hESC 's 15-16 induceren.
Voor de lange termijn cultuur, kan hESC 's en hiPSCs worden geteeld op mitotisch geïnactiveerd MEFs of onder feeder-vrije omstandigheden in MEF-CM (MEF-geconditioneerd medium) op Matrigel-gecoate platen om hun ongedifferentieerde toestand te houden. Succes van beide kweekomstandigheden volledig afhankelijk van de kwaliteit van de feeder cellen omdat invloed uitoefenen op de groei van hESC '.
Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode voor de isolatie en de cultuur van muis embryonale fibroblasten (MEF), voorbereiding van geconditioneerd medium (CM) en enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) om de niveaus van activine A in de media te beoordelen.
Protocol
1. Isolatie van muis embryonale fibroblasten (MEF)
De volgende twee stappen worden uitgevoerd onder niet-aseptische omstandigheden.
- Offer een zwangere muis (CF1, Harlan, USA) op 13 of 14 DPC (dag na de coïtus) door cervicale dislocatie.
- Ontleden de baarmoederhoorns kort in 70% (v / v) ethanol en plaats spoel in een Falconbuis met PBS zonder Ca2 + Mg + 2 (Gibco, Invitrogen).
De volgende stappen worden uitgevoerd in een weefselkweek kap onder aseptische omstandigheden en met steriele instrumenten.
- Plaats baarmoederhoorns in een petrischaal en scheid elk embryo uit de placenta en embryonale weg.
- Ontleden hoofd en rode organen, te wassen in PBS en plaats alle embryo's in een schone petrischaal. Fijn gehakt het weefsel met behulp van een steriel scheermesje totdat het mogelijk wordt pipetteer aan.
- Voeg 1 ml 0,05% trypsine / EDTA (Gibco, Invitrogen), incluDing 100 Kunitz eenheden van DNase I (USB), per embryo.
- Breng het weefsel in een 50 ml Falcon buis incuberen gedurende 15 min bij 37 ° C. Na elke vijf minuten incubatie, dissociëren cellen en neer te pipetteren goed.
- Inactiveren van de trypsine door ongeveer 1 deel vers bereide MEF medium.
MEF kweekmedium (componenten tot 500 ml van de media te maken, meng alle componenten en filter):
450 ml DMEM 50 ml FBS (10% (v / v)), 5 ml 200 mM L-glutamine (1/100 (v / v)) 5 ml penicilline-streptomycine (1/100 (v / v)). - Centrifugeer de cellen met lage snelheid (300 xg), 5 min, verwijder voorzichtig het supernatant af en resuspendeer celpellet in warme MEF medium.
- Plaat ongeveer aantal cellen die gelijk 3-4 embryo per T150 (TPP) kolf bekleed met 0,2% gelatine (Gelatine van runderen huid, type B, Sigma) gedurende 2 uur. De fibroblasten (P0, passage 0) zijn de enige cellen die het vermogen om aan een gelatine beklede kolven. Idealiter cellen 80-90% confluent na 24 uur en in dit stadium een groot deel van P0 cellen ingevroren voor toekomstig gebruik.
- Vouw de resterende T150 kolf (s) van P0 cellen tot P3 of P4 vervolgens geïnactiveerd en gebruikt als voeders voor hESC 'replate of geconditioneerde medium (CM) produceren.
2. Inactivatie en Plating MEF (Feeder cellen Voorbereiding)
Alle stappen worden uitgevoerd in een weefselkweek kap onder aseptische omstandigheden.
- Coat T150 flessen met 0,2% gelatine en incuberen bij kamertemperatuur ten minste 2 uur.
- Verdun mitomycine C in PBS (1 mg / ml) en filter.
- Zuig media van MEFs en wassen met PBS zonder Ca 2 + Mg 2 +.
- 20 ml medium dat 10 ug / ml mitomycine C op MEFs.
- Incubeer 2 uur bij 37 ° C met mitomycine C bevattend medium vervolgens tweemaal wassen met PBS, trypsinize, centrifuge (gedurende 5 min bij 300 x g) en hersuspenderen cellen in warm medium.
- Tel cellen en plaat met een dichtheid van 56.000 cellen / cm 2 T150 flessen en gebruiken CM productie de volgende 6 dagen.
3. Geconditioneerd medium (CM) Voorbereiding
Alle stappen worden uitgevoerd in een weefselkweek kap onder aseptische omstandigheden.
- De dag erna plateren geïnactiveerd MEFs bij een dichtheid van 56.000 cellen / cm 2 vervangen MEF medium hESC medium (UM, ongeconditioneerd medium) (0,5 ml / cm 2) aangevuld vers met 4 ng / ml FGF2.
- Verzamel CM van feeder kolven na 24 uur incubatie en voeg verse hESC medium dat 4 ng / ml van FGF2 op de voedingsdraden.
- Herhaal deze procedure voor de komende 6 dagen. Elke dag slaan verzameld CM bij -20 ° C.
- Na 6 dagen meng alle fracties van de middelgrote en filter (Corning, 0,22 pm, PAS). Maak 50 ml porties en bewaar bij -80 ° C.
- Supplement CM extra 4 ng / ml FGF2 voor het toevoegen aan hESC 'gegroeid Matrigel. </ Li>
4. Meting van activine A in geconditioneerde media (ELISA) 15
- Breng alle monsters en reagentia op kamertemperatuur komen.
- Verdun vangen antilichaam (Human \ Mouse \ Rat Activin een mAb, R & D Systems) in PBS met 1% BSA, toe te voegen aan microplaat (100 pl / putje) en overnachting in het RT uitbroeden.
- Na 24 uur de putjes drie keer daarna wassen met PBST (PBS met 0,05% Tween 20) (300 ul / well) blok (1% BSA / PBS, 300 ul / well) gedurende 1 uur bij RT.
- In deze tijd bereiden op een Activin A (R & D Systems) standaard curve, waaronder 7 verdunningen (concentratie minder dan 30 ng / ml) en de blanco monster. De lineaire werkbereik van de Activin A tussen 0,25 en 32 ng / ml.
- Voeg duplicaten van standaarden en monsters aan de gootjes (100 ul / well) en incubeer 2 uur bij KT.
- Was putjes drie keer (300 ul PBST).
- Voeg de secundaire (gebiotinyleerd) antilichaam (Human / muis / rat gebiotinyleerd Activin een mAb, R & D Systems) (0.25 ug / ml in 1% BSA / PBS) en geïncubeerd gedurende 2 uur bij KT.
- Was putjes drie keer (300 ul PBST) toevoegen Streptavidine-HRP (verdund in 1% BSA / PBS, R & D Systems) en geïncubeerd gedurende 20 min bij KT.
- Was putjes drie keer (300 ul PBST) toevoegen van 100 pi substraatoplossing (Quantikine, R & D Systems) en geïncubeerd gedurende 30 min bij kamertemperatuur in het donker.
- Voeg 100 ul van stop-oplossing (Quantikine, R & D Systems) in elk putje en meng voorzichtig.
- Set microplaat afleesapparaat (Molecular Devices Spectra Max 250 Global medische instrumenten, Inc, Minnesota) tot 450 nm, met een golflengte correctie bij 540 of 570 nm, om de optische dichtheid van elk putje bepalen.
5. Representatieve resultaten
De opzet van de isolatieprocedure is weergegeven in figuur 1. De typische morfologie van hESC 'en hiPSCs gekweekt onder verschillende omstandigheden is weergegeven in figuur 2. De morfologie van MEFs en geïnactiveerd feeder cellen die worden gebruikt om CM te bereiden is weergegeven in figuur 3. In het algemeen moet cellen zijn samenvloeiing 24 uur na isolatie en klaar om te worden ingevroren of uitgebreid. Echter, soms kan het 2-3 dagen duren voordat het verkrijgen van samenvloeiende culturen. De CM worden bereid uit cellen doorgang 4 en uiterlijk. Dit is cruciaal omdat de primaire cellen kunnen alleen worden uitgebreid voor 4-5 passages voor het begin van senescentie.
De cytokine, Activin A, wordt beschouwd als de belangrijkste factor wordt uitgescheiden door feeder cellen voor de ondersteuning van ongedifferentieerde groei van pluripotente cellen 14. De meting van het niveau van activine A in CM (figuur 4) is een zeer gunstige kwantitatieve bepaling van de kwaliteit van MEF controleren.
Figuur 1. Een schematische weergave van de MEF isolatieprocedure.
Figuur 2. De typische morfologie van ongedifferentieerde hESC 'gekweekt in aanwezigheid van (A) feeder cellen (B) geconditioneerd medium en (C) gedefinieerd medium. De typische morfologie van hiPSCs gekweekt in aanwezigheid van (D, E) feeder cellen.
Figuur 3. De typische morfologie van muizen embryonische fibroblasten (MEF). (A) Passage 0 (P0) twee dagen na plating / isolatie, (B) geïnactiveerd voedingsbodem bij een dichtheid van 56.000 cellen / cm. 2
Figuur 4. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) gebaseerde metingen van de concentratie van activine A in geconditioneerd medium (CM) prepared met muis embryo fibroblasten afgeleid van de CF1 muizenstam. CM werd verzameld voor 6 dagen en dan samengevoegd. CM "1" en CM "2" naar verschillende partijen media en UM ongeconditioneerde media. Als de functie van de conditionering proces wordt Activin een afscheiding in het medium door MEF, Activin A is bijna niet op te sporen in de UM.
Discussion
De MEF isolatieprocedure hier gepresenteerde maakt het opzetten van een gestandaardiseerde cultuur voorwaarde voor hESC 's en hiPSCs. Bovendien is de ELISA-systeem gebruikt cytokine productie beoordelen door feeder cellen is een bruikbare indicator van de kwaliteit van de MEF verkregen geconditioneerde media. De onderhoud van het muizenstam (CF1) voor de ondersteuning fibroblasten moet batch-tot-partij variatie van kweekmedia voorkomen. Bovendien is het aan te raden om embryo's te isoleren van meerdere muizen tegelijkertijd om een constante kwaliteit van de cellen te verkrijgen. Zeker vers geïsoleerde MEFs gehouden kunnen worden bevroren op P0 en P1. Ook geïnactiveerd MEF worden ingevroren in hoeveelheden van geschikte hoeveelheden afhankelijk van de eisen voor celkweek. Meestal ongeveer 250.000 cellen worden uitgeplaat in een put van een 6-wells plaat tot cultuur hESC 's en IPS-cellen. De gevestigde en geoptimaliseerd methode routinematig worden gebruikt om de verschillen tussen diffe minimaliserenhuren experimenten.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Met dank aan dr. Boris Greber voor het opzetten van de Activin een ELISA-protocol, zoals gepubliceerd in Greber et al.. 2007. Wij zijn bijzonder dankbaar aan mevrouw Monica Shevack de voorbereiding van de grafisch overzicht. We zijn erg dankbaar dat dr. Heiko Fuchs voor alle hulp en waardevolle suggesties voor en tijdens het filmen. We willen alle leden van de Adjaye laboratorium, in het bijzonder Elisabeth Socha bedanken voor het handhaven van een constante aanvoer van MEFs en CM. Wij erkennen ook onze collega's van het dier faciliteit van de MPIMG voor hun blijvende steun. Dit werk werd mede gefinancierd door het Max Planck Instituut en de [BMBF; licentienummer 0315717A] en partners uit de ERASysBio + initiatief ondersteund door het EU ERA-NET Plus-regeling in KP7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | Biochrom | S0115 | |
| L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
| Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
| beta-Mercapt–thanol | Sigma | M7522 | |
| PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
| Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
| Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
| Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Amit, M. Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Dev. Biol. 227, 271-278 (2000).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Ludwig, T. E. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat. Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Yao, S. Long-term self-renewal and directed differentiation of human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6907-6912 (2006).
- Lu, J., Hou, R., Booth, C. J., Yang, S. H., Snyder, M. Defined culture conditions of human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 5688-5693 (2006).
- Skottman, H., Hovatta, O. Culture conditions for human embryonic stem cells. Reproduction. 132, 691-698 (2006).
- Richards, M., Fong, C. Y., Chan, W. K., Wong, P. C., Bongso, A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).
- Richards, M. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells. 21, 546-556 (2003).
- Amit, M. Human feeder layers for human embryonic stem cells. Biol. Reprod. 68, 2150-2156 (2003).
- Inzunza, J. Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells. 23, 544-549 (2005).
- Zhang, K. Utilization of Human Amniotic Mesenchymal Cells as Feeder Layers to Sustain Propagation of Human Embryonic Stem Cells in the Undifferentiated State. Cell Reprogram. , (2011).
- Eiselleova, L. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev. Biol. 52, 353-363 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Fibroblast growth factor 2 modulates transforming growth factor beta signaling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs (hESCs) to support hESC self-renewal. Stem Cells. 25, 455-464 (2007).
- Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells. J. Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).
