Summary
Fare embriyonik fibroblast (MEFS) kalitesi, CF-1 gibi farenin sağ suşu tarafından dikte edilir. Bu elde edilen Pluripotency destekleyici MEFS ve klimalı ortam (CM) işbirliği içinde kendini yenileyen ve pluripotency korumak için aktivin / Düğüm ve FGF yolları için gerekli aktivin A, Gremlin ve Tgfβ1 optimal konsantrasyonu içermelidir.
Abstract
Genel olarak, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSCs) 1 değişken koşullarda yetiştirilebilir. Bununla birlikte, bu kültüre için etkili bir sistem oluşturmak için bu hücreler kolay değildir. Kültür koşullarında hESC ve hiPSCs yılında pluripotency bahşeder gen ekspresyonunu etkileyebilir yana, optimizasyon ve kültür yöntemi standardizasyon çok önemlidir.
HESC hatlarının kurulması ilk besleyici hücreler ve fetal sığır serumu (FBS) içeren kültür ortamı 2 olarak MEFS kullanılarak tanımlanmıştır. Sonra, FBS hESC 3 çoğalmasını artıran nakavt serum replasmanı (KSR) ve FGF2, ile değiştirildi. Son olarak, besleyici içermeyen kültür sistemlerinde Matrigel kaplı plakalar üzerinde hücreleri kültür etkinleştirmek KSR içeren klimalı orta (orta MEFS koşullanmış) 4. Daha sonra, hESC kültür koşullarında kimyasal defin içinde besleyici-özgür kültür doğru ilerledik5-7 ed koşulları. Dahası, xeno içermeyen bileşenler kullanılarak patojenler ve hayvansal proteinler kültürü yöntemlerle potansiyeli kirlenmesini önlemek için 8 oluşturulmuştur.
Iyileştirilmiş koşullar elde etmek için fare besleyici hücreler insan hücre hatları (örneğin fetal kas ve deri hücrelerinin 9, yetişkin deri hücrelerine 10, sünnet derisi fibroblast 11-12, amniyotik mezenkimal hücreler 13) ile değiştirildi. Ancak, insan sünnet derisi fibroblast kaynaklı besleyici katmanlar kullanarak farklılaşmamış hESC korumanın verimliliği A 14 aktivin salgısı alt düzeyde olması nedeniyle fare besleyici hücreler o kadar yüksek değildir. Açıkçası, fare ve insan besleyici hücreler tarafından büyüme faktörü üretimde belirgin bir fark vardır.
Fare ve insan besleyici hücrelerin transcriptomes Analizleri ve destekleyici olmayan destekleyici hücreler arasında önemli farklılıklar saptandı. Eksojen FGF2 maintai için çok önemlidirhESC ve hiPSCs kendini yenileme ning ve Tgfβ1, aktivin A ve besleyici hücreler içinde Gremlin (BMP antagonisti) ifadesi düzenleyen önemli bir faktör olarak tespit edilmiştir. Aktivin A OCT4, SOX2 ve hESC 15-16 in NANOG ifadesi neden olduğu gösterilmiştir.
Uzun süreli kültür için hESC ve hiPSCs kendi ayrışmamış durumunu korumak için mitotik inaktif MEFS veya Matrigel kaplı plakalar üzerinde MEF-CM (MEF-Şartlı Orta) olarak besleyici içermeyen koşullarda yetiştirilebilir. Doğrudan hESC büyümesini etkiler yana hem kültürü koşullarının başarısını tamamen besleyici hücre kalitesine bağlı olarak değişir.
Burada, fare embriyonik fibroblast izolasyonu ve kültürü (MEFS) için optimize edilmiş bir yöntem, klimalı ortamda (CM) ve medyanın içindeki bir aktivin seviyelerini değerlendirmek için enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) hazırlanması sunuyoruz.
Protocol
1. Fare Embriyonik Fibroblastlar izolasyonu (MEFS)
Aşağıdaki iki adım non-aseptik koşullar altında gerçekleştirilir.
- Servikal dislokasyon ile 13 veya 14 DPC (Günlük post-coitum) bir gebe fare (CF1, Harlan, ABD) Kurban.
- Uterus boynuzu dışarı dissect, kısa bir süre Ca2 + Mg 2 olmaksızın PBS içeren bir Falcon tüpe 70% (v / v) etanol ve yerinde durulama + (Gibco, Invitrogen).
Aşağıdaki adımları aseptik koşullarda bir doku kültürü kaputu yürütülen ve steril aletler kullanıyor.
- Petri içine laparotomi yerleştirin ve plasenta ve embriyo kesesi her embriyo ayırın.
- Kafası ve kırmızı organları incelemek, PBS içinde yıkayın ve temiz bir petri tüm embriyolar yerleştirin. İnce bu Pipeti mümkün hale gelinceye kadar steril bir jilet kullanarak doku kıyma.
- % 0.05 1 ml ilave edilir tripsin / EDTA (Gibco, Invitrogen), incluembriyo başına DNaz I (USB) ding 100 Kunitz birimleri.
- Bir 50 ml Falcon tüpüne aktarılır ve doku 37 azından 15 dakika süreyle inkübe edilir ° C. Inkübasyon her 5 dakika sonra, iyice yukarı ve aşağı pipetleme hücreleri ayrışır.
- Taze hazırlanmış MEF besiyeri yaklaşık 1 hacim ekleyerek tripsin inaktive.
MEF kültür ortamı (bileşenler, medya, 500 ml oluşturan tüm bileşenler ve filtre karıştırmak için):
450 ml DMEM, FBS ve 50 ml (10% (v / v)), 200 mM L-glutamin (1/100 (v / v)) ve 5 ml penisilin-streptomisin 5 ml (1/100 (v / v)). - 5 dk, (300 xg) düşük hız ile hücreler santrifüj, dikkatle sıcak MEF orta süpernatan ve Pastör pipetiyle hücre pelletini kaldırın.
- Levha yaklaşık 2 saat süreyle% 0.2 jelatin (büyükbaş hayvanların derilerinden, Tip B, Sigma jelatin) ile kaplanmış her T150 (TPP) şişeye 3-4 embriyo eşdeğer bir hücre sayısı. Fibroblastlar (P0, pasaj 0) jelatin kaplı matara eklemek için yeteneği var sadece hücrelerdir. İdeal olarak, hücre 24 saat sonra% 80-90 konfluent olup, bu aşamada P0 hücrelerinin büyük bir kısmı gelecekteki kullanım için dondurulur.
- P3 veya P4 kadar P0 hücrelerin kalan T150 balonuna (ler) genişletin, sonra inaktive ve besleyiciler hESC replate veya klimalı ortamda (CM) üretmek için kullanın.
2. Inaktivasyonu ve Kaplama MEFS (Besleyici Hücreler Hazırlık)
Tüm adımları aseptik koşullarda bir doku kültürü kaputu yapılmaktadır.
- En az 2 saat oda sıcaklığında% 0.2 jelatin ve inkübe ile kaplamak T150 şişeler.
- Mitomisin C PBS içerisinde (1 mg / ml) ve filtre ile seyreltilir.
- MEFS medya aspire ve Ca 2 + Mg 2 + PBS ile yıkayın.
- 10 mikrogram / MEFS üzerine mitomisin C ml içeren orta yeri 20 ml.
- 37 2 saat boyunca inkübe ° orta içeren mitomisin C ile C PBS, trypsinize, santrifüj (300 xg'de 5 dakika) ve sıcak ortamda Pastör pipetiyle hücreleri ile iki kez yıkayın.
- 56,000 hücre / T150 şişeler içerisinde cm 2 arasında bir yoğunlukta hücreleri ve plaka saymak ve aşağıdaki 6 gün boyunca CM üretimi için kullanımı.
3. Koşullu Orta (CM) hazırlanması
Tüm adımları aseptik koşullarda bir doku kültürü kaputu yapılmaktadır.
- HESC ortamı (UM, doğuştan orta) (0.5 ml / cm 2) ile MEF orta yerine 56,000 hücre / cm 2 arasında bir yoğunlukta inaktive MEFS kaplama sonrası gün 4 ng / ml arasında FGF2 ile desteklenmiş taze.
- 24 saat inkübasyondan sonra besleyici matara gelen CM toplayın ve 4 ng / fiderlere FGF2 ml içeren taze hESC orta ekleyin.
- Gelecek 6 gün için bu yordamı yineleyin. Her gün mağaza -20 ° C'de CM toplanan
- 6 gün, orta ve filtre (Corning, 0.22 um, PAS) tüm alikotları karıştırın sonra. -80 Az 50 ml hacimde ve mağaza olun ° C
- Matrigel yetişen hESC eklemeden önce ek 4 ng / ml FGF2 CM tamamlayın. </ Li>
4. Koşullu ortam bir aktivin ölçümü (ELISA) 15
- Tüm örnekler ve reaktifler oda sıcaklığına getirin.
- Mikroplaka eklemek,% 1 BSA ile PBS (İnsan \ Fare \ Rat aktivin A MAb, R & D Systems) antikor yakalamak (100 ul / kuyu) ve RT gece inkübe sulandırınız.
- 24 saat blok (% 1 BSA / PBS, 300 ul / kuyucuk) oda sıcaklığında 1 saat daha sonra PBST (% 0.05 Tween 20 ile PBS) (de 300 ul /) ile üç kez kuyuları yıkayıp sonra.
- Bu süre içinde bir aktivin A 7 dilüsyonları (30 ng / ml konsantrasyonu daha az) ve boş bir örnek de dahil olmak üzere (R & D Systems) standart eğri, hazırlamak. Aktivin doğrusal çalışma aralığı 0.25 ile 32 ng / ml 'dir.
- Kuyular (iyi 100 ul /) için standartlar ve örneklerin kopyası ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
- Kuyu üç kez (PBST 300 ul) yıkayın.
- Ikincil (biyotin) antikoru (İnsan / Fare / Rat aktivin A MAb, R & D Systems biyotinile) (0 ekleyin.25 ug / ml% 1 BSA / PBS) ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edilir.
- Kuyu üç kez (PBST 300 ul) yıkayın, Streptavidin-HRP (% 1 BSA / PBS, R & D Systems ile sulandırılmış) ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir.
- Kuyu üç kez (PBST 300 ul) yıkayın, substrat çözeltisi 100 ul (Quantikine, R & D Systems) ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.
- Her bir kuyuya durak çözüm 100 ul (Quantikine, R & D Systems) ekleyin ve hafifçe karıştırın.
- De her optik yoğunluğu belirlemek için 540 veya 570 nm dalga boyu düzeltmesi ile 450 nm Set Mikroplaka okuyucu (Molecular Devices Spectra Max 250, Global Tıbbi Cihazlar A.Ş., Minnesota),.
5.. Temsilcisi Sonuçlar
Izolasyon prosedürü genel şeması Şekil 1'de verilmiştir. HESC ve farklı koşullar altında kültüre hiPSCs tipik morfolojisi Şekil 2'de sunulmuştur. Morfolojisi MEFS ve CM hazırlamak için kullanılan inaktif besleyici hücreler Şekil 3'te sunulmuştur. Genel olarak, hücreler 24 saat sonrası izolasyon konfluant ve dondurulmuş veya genişletilebilir hazır olmalıdır. Ancak, bazen bu birleşik kültürler almadan önce 2-3 gün sürebilir. CM pasaj 4 değil, daha az hücrelerden hazırlanır. Primer hücreler sadece yaşlılık başlangıcı önce 4-5 geçişleri için açılabilir, çünkü bu çok önemlidir.
Sitokin, aktivin A, pluripotent hücreler 14 farklılaşmamış büyüme desteği için besleyici hücreler tarafından salgılanan en önemli faktör olarak kabul edilir. CM A aktivin düzeyinin ölçümü (Şekil 4) MEFS kalitesini izlemek için çok uygun bir kantitatif bir testtir.
Şekil 1. MEFS izolasyon prosedürü şematik gösterimi.
Şekil 2,. (A) besleyici hücre, (B) şartlandırılmış orta ve (C) orta tanımlandığı varlığında kültüre andiferansiye hESC tipik morfolojisi. (D, E) besleyici hücre varlığında kültüre hiPSCs tipik morfolojisi.
Şekil 3. Fare embriyonik fibroblast tipik morfolojisi (MEFS). (A) Passage 0 (P0) kaplama / izolasyon iki gün sonra, 56.000 hücre / cm yoğunluğu (B) inaktive besleyici tabaka. 2
Şekil 4. Enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) tabanlı klimalı ortamda (CM) pr bir aktivin konsantrasyonu ölçümleriCF1 fare soyundan türetilmiş fare embriyonik fibroblastlar ile epared. CM 6 gün boyunca toplandı ve ardından birleştirilmiş edildi. CM "1" ve CM "2" medya ve şartsız medyaya UM farklı gruplar bakın. Conditioning işleminin fonksiyonu MEFS, aktivin tarafından aracı madde içine bir salgılama aktivin gibi bir UM hemen hemen mümkün değildir.
Discussion
Burada sunulan MEFS izolasyon prosedürü hESC ve hiPSCs için standart bir kültür durumun kurulmasını sağlar. Bundan başka besleyici hücreler tarafından sitokin üretimini değerlendirmek için kullanılmıştır ELISA bazlı sistemi MEF-türevi şartlandırılmış ortam kalitesi yararlı bir göstergesidir. Destekleyen fibroblastlar sağlayan fare suşu (CF1) rutin bakımı kültür ortamı toplu-seri varyasyonu önlemek için gereklidir. Dahası, aynı zamanda hücre tutarlıdır kalitesi elde etmek için çok sayıda farelerin embriyo izole edilmesi tavsiye edilir. Kesinlikle yeni ayrılmış MEFS P0 ve P1 dondurularak saklanabilir. Ayrıca inaktive MEFS hücre kültürü için gereksinimlerine bağlı olarak uygun miktarda hacimde donmuş muhafaza edilebilir. Genellikle yaklaşık 250.000 hücre kültürü hESC ve iPS hücreleri için 6-iyi plaka tek bir iyi kaplanmış olmalıdır. Kurulan ve optimize yöntemi rutin yönün arasındaki değişkenliği en aza indirmek için kullanılabilirdeneyler kira.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
. 2007 Greber ark yayınlanan aktivin A ELISA protokolü kurmak için Dr Boris Greber özel teşekkürler. Biz grafik bakış hazırlanması için Bayan Monica Shevack özellikle müteşekkiriz. Biz çekimler öncesi ve sırasında her türlü yardımı ve değerli önerileri için Dr Heiko Fuchs için minnettarız. Biz MEFS ve CM sabit bir kaynağı korumak için Adjaye laboratuvar, özellikle Elisabeth Socha tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Biz de onların sürekli destek için MPIMG bir hayvan tesis bünyesinde çalışan tüm arkadaşlarımız kabul ediyorsunuz. Bu çalışma kısmen Max Planck Topluluğu ve tarafından finanse edilmiştir [BMBF; hibe sayısı 0315717A], ERASysBio ortakları + AB 7.Çerçeve Programı'na ERA-NET Plus, programı kapsamında desteklenen girişim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | Biochrom | S0115 | |
| L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
| Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
| beta-Mercapt–thanol | Sigma | M7522 | |
| PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
| Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
| Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
| Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Amit, M. Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Dev. Biol. 227, 271-278 (2000).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Ludwig, T. E. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat. Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Yao, S. Long-term self-renewal and directed differentiation of human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6907-6912 (2006).
- Lu, J., Hou, R., Booth, C. J., Yang, S. H., Snyder, M. Defined culture conditions of human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 5688-5693 (2006).
- Skottman, H., Hovatta, O. Culture conditions for human embryonic stem cells. Reproduction. 132, 691-698 (2006).
- Richards, M., Fong, C. Y., Chan, W. K., Wong, P. C., Bongso, A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).
- Richards, M. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells. 21, 546-556 (2003).
- Amit, M. Human feeder layers for human embryonic stem cells. Biol. Reprod. 68, 2150-2156 (2003).
- Inzunza, J. Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells. 23, 544-549 (2005).
- Zhang, K. Utilization of Human Amniotic Mesenchymal Cells as Feeder Layers to Sustain Propagation of Human Embryonic Stem Cells in the Undifferentiated State. Cell Reprogram. , (2011).
- Eiselleova, L. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev. Biol. 52, 353-363 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Fibroblast growth factor 2 modulates transforming growth factor beta signaling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs (hESCs) to support hESC self-renewal. Stem Cells. 25, 455-464 (2007).
- Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells. J. Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).
