Summary
Aktuelle Diagnostik antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung beruht auf der Plankton-Wachstum von Isolaten in nährstoffreichen, aeroben Bedingungen. Hier beschäftigen wir eine Alternative künstliche Sputum mittel-bis Antimikrobielle Empfindlichkeit von Pseudomonas aeruginosa Biofilmen unter aeroben und mikroaerophilen Bedingungen mehr repräsentativ für die Mukoviszidose-Lunge zu untersuchen.
Abstract
Es wächst die Besorgnis über die Relevanz der in vitro antimikrobielle Empfindlichkeitstests wann Isolate von P. angewendet aeruginosa von zystischer Fibrose (CF)-Patienten. Bestehende Methoden beruhen auf einzelne oder wenige Isolate wachsen aerob und planktonically. Vorgegebenen cut-offs werden verwendet, um festzulegen, ob die Bakterien empfindlich oder resistent gegenüber einem bestimmten Antibiotikum 1 sind. Doch während chronische Lungeninfektionen bei CF, P. aeruginosa in Biofilmen Populationen existieren und es gibt Hinweise, dass die Umwelt weitgehend mikroaerophile 2 ist. Der extreme Unterschied zwischen den Bedingungen in Bakterien in der Lunge und denen während der diagnostischen Tests haben Zweifel an der Zuverlässigkeit und sogar Relevanz dieser Tests 3 genannt.
Künstliche Sputum Medium (ASM) ein Kulturmedium, das die Komponenten des CF-Patienten Sputum, einschließlich Aminosäuren, Mucin und freie DNA. S. aeruginosa </ Em> Wachstum im ASM Mimik Wachstum während der CF-Infektionen, mit der Bildung von Selbst-Aggregation Biofilmstruktur und Bevölkerung Divergenz 4,5,6. Das Ziel dieser Studie war es, eine Mikrotiterplatte Assay gegen antimikrobielle Empfindlichkeit von P. studieren entwickeln aeruginosa auf das Wachstum in ASM, die für beide mikroaerophile und aeroben Bedingungen beruht.
Ein ASM-Assay wurde in einem Mikrotiterplatten-Format entwickelt. P. aeruginosa Biofilme wurden für 3 Tage vor der Inkubation mit antimikrobieller Mittel zu entwickeln in verschiedenen Konzentrationen für 24 Stunden. Nach Biofilm Störung, die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Färbung mit Resazurin gemessen. Dieser Assay wurde verwendet, um die sessile Zelle minimale Hemmkonzentration (SMIC) von Tobramycin für 15 verschiedene P. ermitteln aeruginosa-Isolaten unter aeroben und mikroaerophilen Bedingungen und SMIC-Werte wurden mit denen mit Standard-Brühe Wachstum verglichen. Zwar gab eseinige Hinweise für eine erhöhte MHK-Werte für Isolate in ASM gewachsen, wenn ihre planktonischen Gegenstücken verglichen wurden die grössten Unterschiede zu Bakterien in mikroaerophilen Bedingungen, die eine wesentlich erhöhte Resistenz zeigte, bis zu einer> 128 fache gegenüber Tobramycin in der ASM-System getestet gefunden, wenn gegenüber Assays unter aeroben Bedingungen durchgeführt.
Der fehlende Zusammenhang zwischen Anfälligkeit aktuellen Prüfmethoden und dem klinischen Ergebnis der Gültigkeit der aktuellen Methoden 3 in Frage gestellt. Mehrere in vitro-Modelle wurden bereits auf S. Studie verwendet aeruginosa Biofilm 7, 8. Allerdings beruhen diese Methoden auf Oberfläche befestigt Biofilmen, während die ASM-Biofilme, die auf der CF-Lunge 9 beobachtet ähneln. Darüber hinaus hat verringert Sauerstoffkonzentration im Schleim wurde gezeigt, dass das Verhalten von P. verändern aeruginosa 2 und beeinflussen Antibiotikaempfindlichkeit 10. Deshalb using ASM unter mikroaerophilen Bedingungen können vorsehen, eine realistischere Umgebung, in der Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiellen Mitteln zu studieren.
Protocol
1. Herstellung künstlicher Sputum Medium (ASM)
- 4 g DNA aus Fischsperma bis 250 ml sterilem Wasser sehr langsam über einen Zeitraum von mehreren Stunden. Die DNA dauert mehrere Stunden, um vollständig zu lösen und kann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt werden.
- 5 g Muzin aus Schweinemagen (Typ II) langsam auf 250 ml sterilem Wasser, bis das Mucin vollständig gelöst ist. Die Lösung kann über Nacht bei 4 ° C gerührt werden
- 0.25 g jeder essentiellen und nicht-essentielle L-Aminosäure, mit Ausnahme von L-Tyrosin und L-Cystein, in 100 ml sterilem Wasser. 0.25 g L-Cystein in 25 ml 0,5 M Kaliumhydroxid (M r 56,11 g / mol) und 0,25 g L-Tyrosin in 25 ml sterilem Wasser.
- Man löst 5,9 mg Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), 5 g NaCl und 2,2 g KCl in 100 ml sterilem Wasser.
- Kombinieren Sie die DNA, Mucin, L-Aminosäuren, DTPA, NaCl und KCl in einem 1-Liter-Flasche.
- 5 ml Eigelb Emulsion und Füllung auf etwa 850 ml mit sterilem Wasser.
- Der pH-Wert auf 6,9 mit 1 M Tris (pH 8,5; M r 121,14) und bringe das Volumen auf 1 Liter mit sterilem Wasser.
- Sterilisieren Sie die ASM durch Filtration mit einem Vacuubrand ME 2 Membran-Vakuumpumpe und Millipore Steritop Filtereinheiten mit einem Poren-und Hals-Größe von 0,22 um und 45 mm. Jeder Steritop Filtereinheit kann sofort werden bis zu dreimal wieder verwendet, allerdings müssen die Filter zweimal mit sterilem Wasser gespült werden, bevor sie erneut verwendet. Die Filtration ist langsam und kann über 2 Tage durchgeführt werden. Andere Versionen von ASM entwickelt worden sind, dass mit der Zugabe von Antibiotika statt Filtration 11 jedoch aufgrund möglicher Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten, empfehlen wir nicht die Methode für diese spezielle Anwendung.
- Ungefilterten und gefilterten ASM sollte bei 4 ° C im Dunkeln gelagert werden. Mit frischen ASM wird jedoch empfohlen, kann es unter diesen Bedingungen für maximal 1 Monat aufbewahrt werden.
2. Bestimmung der planktonischen Sessile Zelle Minimum Metabolic Hemmkonzentration (PSMIC)
- Um die minimale metabolische Hemmkonzentration (PSMIC) Werte für 15 planktonically gewachsen P. bestimmen aeruginosa-Isolate, die Mikrodilutionsmethode sollte durchgeführt werden, wie in den Richtlinien der British Society for Antimicrobial Chemotherapy BSAC 12 beschrieben. Das Antibiotikum der Wahl, in diesem Fall Tobramycin Sulfat, wird seriell in Luria-Bertani (LB)-Medium in einer 96-Well-Mikrotiterplatten zur einen geeigneten Bereich von Antibiotikum-Konzentrationen bereitzustellen verdünnt.
- Verdünnen Sie Übernacht-Kulturen von P. aeruginosa in LB zu einer OD 600 von 0,05 (± 0,01) und 100 ul in die Vertiefungen der 96-Well Mikrotiterplatte mit 100 ul der seriell verdünnt Antibiotikum. In diesem Fall liegt die Endkonzentrationen von Tobramycin Sulfat zwischen 512 bis 0,5 g / ml. Acht Wiederholungen jeder antibiotic Konzentration durchgeführt werden.
- Negative Kontrolle Vertiefungen für jede zu isolieren eingerichtet werden, in denen keine Antibiotika zugesetzt wird. Auch sollte acht Vertiefungen enthalten nur LB für die Verwendung als Rohling während Downstream-Analyse (Abschnitt 2.6).
- Inkubieren Sie die 96-well Mikrotiterplatten für 1 - 2 Tage bei 37 ° C ohne Schütteln unter aeroben oder mikroaerophile (5% O 2, 10% CO 2, und 85% N 2) Bedingungen. Mikroaerophilen Bedingungen werden mit Hilfe CampyGen Gaserzeugung in großen Packungen Anaerobentopf.
- Nach der Inkubation wird das Bakterienwachstum durch Messung der Absorption der Bakterienkultur in jeder Vertiefung bei einer Wellenlänge von 600 nm unter Verwendung eines Fluostar Omega Mikroplatten-Lesegerät und dem MARS-Datenanalyse-Software bestimmt.
- Die Resorption aus Antibiotika-behandelten Kulturen planktonischen (A Antibiotikum behandelt planktonischen Zellen) und die Absorption von den negativen Kontrollen (Negativkontrolle) sollte durch Subtrahieren korrigiert werdenIon der Hintergrundabsorption aus den Vertiefungen mit LB nur (Eine leere) erhalten. Die prozentuale Hemmung der Lebensfähigkeit wird anschließend als (Mittelwert ± Antibiotikum behandelt planktonischen Zellen / bedeuten eine negative Kontrolle) x 100% berechnet. Die PSMIC 90 wird wie das Antibiotikum Konzentration, die 90% ige Hemmung der planktonischen Bakterienwachstum definiert.
- Um die Lebensfähigkeit von Bakterien nach der Behandlung mit dem Antibiotikum der Wahl, 10 ul von 0,02% (v / v) Resazurin (verdünnt in destilliertem Wasser) wird in jede Vertiefung gegeben und die Platten werden unter aeroben Bedingungen inkubiert für 1 zu bestimmen - 2 h bei 37 ° C, unter Schütteln bei 150 UpM. Lebensfähige Zellen wird die blaue Farbstoff Resazurin dem rosa fluoreszierenden Resorufin Form zu reduzieren.
- Nach der Inkubation mit Resazurin, die Überwachung der Fluoreszenz von jeder Vertiefung mit einer Anregungswellenlänge von 540 nm und einer Emissionswellenlänge von 590 nm in einem Fluostar Omega Mikroplatten-Lesegerät. Die Daten sollen analysiert werden wie folgt beschrieben werdenniedrig.
3. Bestimmung der Biofilm Sessile Handy minimalen Hemmkonzentration (BSMIC)
- Übernacht-Kulturen von P. aeruginosa (in diesem Fall 15 Isolate von P. aeruginosa) gesetzt werden sollen in LB zu einer OD 600 von 0,05 (± 0,01), dann weiter verdünnt 1:100 in frische ASM verdünnt werden (Gesamtvolumen 1,8 ml).
- Die verdünnten Kulturen (1,8 ml) ist in jede Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatten behandelte Platte zugegeben werden. Drei Brunnen sollte nur für den Einsatz als Rohling während Downstream-Analyse (Abschnitt 3.9) ASM.
- Sichern Sie die 24-Well-Platten mit Parafilm Labor und Inkubation für 3 Tage unter aeroben oder mikroaerophilen Bedingungen bei 37 ° C unter Schütteln bei 75 Umdrehungen pro Minute. Mikroaerophilen Bedingungen sollte unter Verwendung CampyGen Gaserzeugung in großen Packungen Anaerobentopf werden.
- Verdünnte das Antibiotikum der Wahl, in diesem Fall Tobramycin Sulfat, um eine geeignete Konzentrationsbereich in frischem bereitzustellenASM. In diesem Fall lag Endkonzentrationen zwischen 512 bis 1 g / ml. Fügen Sie jede Konzentration des Antibiotikums, die in Mengen von 200 ul, in die entsprechenden Vertiefungen der 24-Well-Platten. Vier Replikate von jedem Antibiotikum-Konzentration durchgeführt werden. Biofilme nicht das Antibiotikum der Wahl ausgesetzt wurden als negative Kontrolle verwendet.
- Sichern Sie die 24-Well-Platten mit Parafilm Labor und inkubieren unter aeroben oder mikroaerophilen Bedingungen für weitere 24 h bei 37 ° C unter Schütteln bei 75 Umdrehungen pro Minute.
- Nach der Inkubation in der Gegenwart des Antibiotikums der Wahl, Störung der bakteriellen Biofilmen unter Verwendung von 100 ul 100 mg / ml Cellulase (verdünnt in 0,05 M Citratpuffer [9,6 g / l Citrate.H 2 0 in Wasser und pH auf 4,6 mit NaOH] ) und Inkubieren der Platten mit 24 Vertiefungen unter aeroben Bedingungen bei 37 ° C unter Schütteln bei 150 Upm während 1 h. Bei Bedarf könnten weitere Biofilmen durch manuelles Pipettieren werden in dieser Phase gestört.
- Um die metabolischen Aktivitäten bestimmender Bakterienzellen aus den aufgebrochenen Biofilmen freigesetzt, 100 ul von 0,02% (v / v) Resazurin (verdünnt in destilliertem Wasser) sollte zu jeder Vertiefung der 24-Well-Platten gegeben werden und für 1 - 2 h bei 37 ° C unter Schütteln bei 150 Upm.
- Nach der Inkubation mit Resazurin, die Fluoreszenz von jeder Vertiefung mit einer Anregungswellenlänge von 540 nm und einer Emissionswellenlänge von 590 nm in einem Fluostar Omega Mikroplatten-Lesegerät und dem MARS-Datenanalyse-Software.
- Fluoreszenz von den Antibiotika-behandelten Biofilme (F Antibiotikum behandelten Biofilme) und die Fluoreszenz von den negativen Kontrollen (F negative Kontrolle) sollte durch Subtraktion der Hintergrund-Fluoreszenz von den Vertiefungen, die ASM erhalten korrigiert werden nur (F frei). Die prozentuale Hemmung der Lebensfähigkeit wird anschließend als (Mittelwert von F Antibiotikum behandelt Biofilmen / F bedeuten negative Kontrolle) x 100% berechnet. Die BSMIC 90 wird wie der antibio definierttic Konzentration, die 90% ige Hemmung der Stoffwechselaktivität.
4. Repräsentative Ergebnisse
ASM Biofilmbildung in kleinen (2 ml) sind möglich und die Biofilme sind vollständig innerhalb von 3 Tagen (1A) gebildet ist. Dies kann durch eine konsequente Pipettieren den Biofilm, die nur schwer zu stören sollten aufgezeigt werden. Die Mikrokolonien sind vergleichbar mit denen in größeren Volumina 4 (Abbildung 1B) gewachsen. Abbildung 2 zeigt große Unterschiede zwischen den Zellen planktonically und in einem Biofilm als durch elektronenmikroskopische Bild-Analyse nachgewiesen gewachsen. Biofilm Kulturen zeigen deutlich erhebliche Ebenen der extrazellulären Matrix und die Zellen umgebende einzelnen Strukturen innerhalb des Biofilms sind schwer zu identifizieren.
Mehrere Studien legen nahe, dass der Biofilm Lebensstil kann antimikrobiellen Empfindlichkeit 13, 14 auswirken. Unsere Kleinen ASM Test kann verwendet werden, um Dete werdenrmine die BSMIC mehrerer Antibiotika für mehrere Isolate zur gleichen Zeit. Der Workflow des Assays ist in Abbildung 3 dargestellt. Die Wirkung von Antibiotika auf bakterielle Lebensfähigkeit der Zellen kann gemessen unter Verwendung des Resazurin-Assay werden. Antibiotika, in diesem Fall Tobramycin, kann der etablierten Biofilm hinzugefügt und inkubiert für 24 Stunden. Danach wird der Biofilm gestört wird und Resazurin zugegeben.
Metabolisch aktiven Zellen verringern kann die Farbstoff Resazurin was zu einem Farbumschlag von blau (Resazurin) in pink (Resorufin) 15. 4A zeigt ein Beispiel Test, bei dem P. aeruginosa wurde mit verschiedenen Konzentrationen von Tobramycin, bevor Biofilm Störungen und Zugabe von Resazurin in einer Mikrotiterplatte inkubiert. Die nicht-fluoreszierenden blauen Farbe zeigt an, nicht lebensfähige Zellen, während die lebensfähigen Zellen reduzieren den Farbstoff an den rosa fluoreszierenden Form, Resorufin. Der SMIC kann dann durch Umwandlung von Fluoreszenz in Prozent berechnet werdenverbleibenden Lebensfähigkeit der Bakterien. 4B zeigt die Veränderung in% Lebensfähigkeit mit zunehmender Konzentration Tobramycin. 10% Lebensfähigkeit wurde als Hell-Dunkel-gewählt, um die SMIC 90 zu berechnen.
Unter aeroben Bedingungen sind die Tobramycin SMIC 90-Werte höher als Biofilm-Zellen sind als die der planktonischen gezüchtet. Tabelle 1 zeigt die Variation in PSMIC 90 und 90 BSMIC für alle Isolate getestet. Tabelle 2 zeigt, dass unter aeroben Bedingungen, ein dramatischer Anstieg der Resistenz gegen Tobramycin (2 bis> 32 fache Erhöhung der SMIC) für die meisten Isolate wurde beobachtet, wenn in ASM (Biofilm-Modus) im Vergleich zu LB (Plankton-Modus) gewachsen. Zusätzlich zeigten Biofilme unter mikroaerophilen Bedingungen gezüchtet eine erhöhte SMIC zwischen 2 und> 128-fache an, wenn von Biofilmen unter aeroben Bedingungen angebaut werden.
Abbildung1. Biofilmbildung von P. aeruginosa in ASM P. aeruginosa Stamm PAO1 bildet makroskopisch sichtbare Klumpen (Mikrokolonien), wenn in ASM gewachsen. A, Biofilmbildung in 30 ml Kulturen ASM (Groß-) nach 7 Tagen Wachstum in Schraubverschluss Glas Duran Flaschen. B, Biofilm-Bildung in 2 ml ASM Kulturen ( kleinräumige) nach 3 Tagen Wachstum in 24-Well-Polystyrol-Platten.
Abbildung 2. TEM-Aufnahmen von Biofilmen ASM A / C TEM-Aufnahme (x; 27.000) von PAO1 planktonically gewachsen und in ASM bzw. B / D TEM-Aufnahme (x57, 000) von PAO1grown planktonischen und in ASM bzw.. Planktonically gewachsenen Bakterien wurden über Nacht in LB-Medium kultiviert. Biofilme wurden 7 Tage lang in 30 ml ASM Kulturen angebaut. Schwarze Pfeile beziehen sich auf Zellen innerhalb des Biofilms und die Sterne beziehen sich auf extrazellulären Raum. Maßstabsbalken = 1um.
Abbildung 3. Workflow des ASM Biofilm antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung Assay.
Abbildung 4. Verwendung Resazurin zur Bestimmung der MHK Bakterielle Zellen mit verschiedenen Konzentrationen des Antibiotikums und der verbleibende metabolische Aktivität wurde unter Verwendung Resazurin inkubiert wurden. A, zeigt die blaue nicht-fluoreszierenden oxidierte Form von Resazurin nicht lebensfähigen Zellen und wird durch metabolische verringert aktive Zellen zu pink fluoreszierenden Resorufin. B wird die Fluoreszenz-Intensität in den Prozentsatz der verbleibenden Lebensfähigkeit der Bakterien umgewandelt. 10% Lebensfähigkeit wurde als Cut-off gewählt, um die MSMIC90 berechnen. Klicken Sie hier um lar sehenger Figur.Die Stämme PSMIC 90 (pg / ml) 1 BSMIC 90 (pg / ml) 1 Aerob Microaerophilic 2 Aerob Microaerophilic 2 PAO1 4 4 8 > 512 Liverpool Epidemic Strain (LES) isoliert LESB58 21 8 64 64 128 LES400 22 32 128 8 256 LESB25 16 32 256 512 LESB55 16 64 64 > 512 LESB64 16 64 > 512 > 512 LES431 22 4 8 32 > 512 LESB49 16 64 64 256 LES109 32 128 32 > 512 Non-LES-Isolate 49461 16 32 16 > 512 59032 0,5 2 4 > 512 59073 > 512 > 512 > 512 > 512 59076 16 32 32 > 512 </ Td> 27 8 16 4 > 512 45 16 32 4 > 512 Tabelle 1. Die Anfälligkeit von P. aeruginosa zu Tobramycin.
1 Zur Bestimmung der PSMICs und BSMICs Tobramycin wurde in 2-fache serielle Verdünnungen verwendet
reicht von 512 bis 0,5 pg / ml (n = 8 für jede Konzentration) und 512 bis 1 pg / ml (n = 4 für jede
Konzentration) verbunden sind;; PSMICs wurden unter Verwendung des Standard
Mikrodilutionsmethode 1.2 mikroaerophilen Bedingungen waren 5% O 2, 10% CO 2, und 85% N 2.
Belasten PSMIC 90/90 BSMIC fache Änderung 1 PSMIC aeroben →
PSMIC mikroaerophileBSMIC aeroben →
BSMIC mikroaerophilePSMIC aeroben →
BSMIC aerobenPSMIC mikroaerophile →
BSMIC mikroaerophilePAO1 0 > 64 2 128 LES-Isolate LESB58 8 2 8 2 LES400 4 32 0,25 2 LESB25 2 2 16 16 LESB55 4 > 8 4 > 8 LESB64 4 ND > 32 > 8 LES431 2 > 16 8 > 64 LESB49 4 4 4 4 LES109 4 16 0 > 4 Non-LES-Isolate 49461 2 > 32 0 > 16 59032 4 > 128 8 > 256 59073 ND ND ND ND 59076 2 > 16 2 > 16 27 2 > 128 0,5 > 32 45 2 > 128 0,25 > 16 Tabelle 2. Fache Änderung der PSMICs und BSMICs zu Tobramycin.
1 ND, nicht bestimmt; Werte in Fettschrift zeigen SMIC fache Veränderungen> 10.
Discussion
In dieser Studie verwendeten wir ein neues in vitro Modell basierend auf ASM zu replizieren P. aeruginosa Biofilm Bedingungen innerhalb der CF Lunge 4. Das Modell wurde erfolgreich für die kleinräumige, Hochdurchsatz-Screening von antimikrobiellen Wirkstoffen modifiziert.
Die kritischen Schritte dieses Tests sind:
- Konsequente Vorbereitung der ASM Medien und Aufrechterhaltung der Sterilität. Wir haben viele Stunden, um die Optimierung des in der jede Komponente hinzugefügt, um reproduzierbare Ergebnisse jedes Mal gewidmet ist. Die Filtration des ASM ist langsam, ist aber vorzuziehen, Autoklavieren, die die Muzin-Komponente beschädigt werden kann. Wir raten den Zusatz von Antibiotika, wie von anderen vorgeschlagen 11, weil diese erheblichen Selektionsdruck, Antriebs-Mutationen auferlegen können, induzieren Prophagen Lyse 16 und signifikante Veränderung der Expression von mehreren bakteriellen Genen.
- Der Test sollte nach dem Volumen o optimiert werdenf ASM verwendet. Shaking Geschwindigkeiten sind für kleinere Volumina erhöht und einen kürzeren Lebenszyklus Biofilm beobachtet wird.
Eine naheliegende Anwendung der kleinräumigen ASM Biofilm-Modell ist die realistischere Bestimmung der Biofilm antimikrobiellen Empfindlichkeiten (BSMIC 90). Anaerobe und mikroaerophilen Nischen in der CF-Lunge und es gibt Belege dafür, dass Sauerstoff tief innerhalb reife Biofilme 2, 17 begrenzt. Hier zeigen wir, dass 10/14 klinischen P. aeruginosa-Isolaten von CF-Patienten weisen eine erhebliche Sputum (4 - ≥ 128-fach) Abnahme der Empfindlichkeit auf Tobramycin unter mikroaerophilen Bedingungen in ASM. Die Ergebnisse dieser Studie legen nahe, dass Antibiotika wie Tobramycin, möglicherweise weniger wirksam gegen P. aeruginosa-Infektionen in der Lunge CF als durch herkömmliche Methoden Empfindlichkeitsprüfung angegeben. Diese Ergebnisse spiegeln früheren Studien über die antimikrobielle Empfindlichkeit von Biofilmen 10. Klein-Maßstab ASM-Assays somit eine einfache Plattform mit hohem Durchsatz zur Erzeugung aussagekräftiger Antibiotikaempfindlichkeit Daten besser zu informieren therapeutische Entscheidungen. Der Test wird in der gleichen Weise wie herkömmliche Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung, daß einzelne Kolonien für das Screening, die nicht repräsentativ für die gesamte Bevölkerung können aufgenommen beschränkt. Wir glauben jedoch, dass ein Ansatz, (i) Verwendung von nicht-Oberfläche befestigt Biofilmwachstum und (ii) für mikroaerophilen Bedingungen, eine klare Alternative und eine mögliche Verbesserung bestehender Methoden darstellt. Wir schließen daraus, dass dieser Test ein geeignetes Modell, um zu studieren, ist P. aeruginosa Biofilm Populationen. Weitere Tests im klinischen Umfeld würde prüfen, ob Antibiotika-Empfindlichkeiten auf Biofilm-Basis gewachsen P. aeruginosa könnte auf unterschiedliche Antibiotika-Entscheidungen mit möglicherweise verbessert mikrobiologischen und klinischen Ergebnissen führen. Ähnliche Untersuchungen mit klassischen Biofilm-Modelle haben gezeigt, dass BSMIC Werten führenverschiedene Empfehlungen zur antibiotischen Behandlung 5,17.
Zusätzlich zur Prüfung der Wirksamkeit von Antiinfektiva, stellt der ASM-System eine billige, einfache und reproduzierbare Alternative zu Tiermodellen für Studien wie die im Verständnis der Diversifizierung der P. richtet aeruginosa Bevölkerungen. Wir haben umfangreiche Heterogenität in natürlichen Populationen von P. beobachtet aeruginosa aus CF-Patienten Sputum 18, 19 erholt. Ähnliche phänotypische und genotypische Diversifizierung kann während des Wachstums in ASM-4 (und unsere unveröffentlichte Daten) beobachtet werden, so dass es ein attraktives In-vitro-Modell der CF Lungenerkrankungen. Die relative Einfachheit des ASM-Modell macht es einfach zu entwerfen langfristige Anpassung Experimente sollen, zum Beispiel bei der Überwachung der Auswirkungen von Antibiotika oder anderen Belastungen auf P. aeruginosa Bevölkerung Divergenz. Darüber hinaus können andere bakterielle Erreger in angebaut werdenASM. Zum Beispiel, Fouhy et al. ASM 2007 verwendet haben, um die Biofilmbildung von S. studieren maltophillia 20.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir erkennen die Unterstützung des Vereinigten Königreichs National Institute for Health Research, die Dr Hadwen Trust for Humane Research, der führende britische medizinischen Forschung Nächstenliebe Finanzierung ausschließlich tierversuchsfreie Forschungsmethoden zu Tierversuchen ersetzen, und dem Wellcome Trust (Grant 089215). Wir erkennen auch Novartis Pharmaceuticals UK Ltd (unrestricted educational grant).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA from fish sperm | Sigma-Aldrich | 74782 | |
| Mucin from porcine stomach, type II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| L-Alanine | Acros Organics | 102830250 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | |
| L(+)-Asparagine monohydrate | Acros Organics | 175271000 | |
| L(+)-Aspartic acid | Acros Organics | 105041000 | |
| L-Cysteine | Sigma-Adrich | 168149 | |
| L(+)-Glutamic acid | Acros Organics | 156211000 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| Glycine | Acros Organics | 220911000 | |
| L-Histidine | Sigma-Adrich | H8000 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| L(+)-Lysine monohydrochloride | Acros Organics | 125222500 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| L-Phenylalanine | Acros Organics | 130310250 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| L-Serine | Acros Organics | 132660250 | |
| L-Threonine | Acros Organics | 138930250 | |
| L(-)-Tryptophan | Acros Organics | 140590250 | |
| L-Tyrosine | Acros Organics | 140641000 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500 | |
| Diethylenetriaminepentaacetic acid | Sigma-Aldrich | 32318 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S/3160/60 | |
| KCl | VWR | BDH0258 | |
| KOH | VWR | BDH0262 | |
| Egg yolk emulsion | Sigma-Aldrich | 17148 | |
| ME 2 diaphragm vacuum pump | Vacuubrand | 696126 | |
| Steritop filters (Pore size: 0.22 μm, Neck size: 45 mm) | EMD Millipore | SCGPT10RE | |
| Luria-Bertani medium | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| 96-well microtitre plates | Sarstedt Ltd | 82.1581 | |
| 24-well tissue culture-treated plates | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 3820-024 | |
| CampyGen gas generation packs | Oxford Labware | CN0025 | |
| Microaerophilic chamber | Oxford Labware | HP0011 | |
| Tobramycin sulphate | Sigma-Aldrich | T1783 | |
| Cellulase, from Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | 22178 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | 199303 | |
| Citrate.H20 | VWR | BDH0288 | |
| Fluostar omega microplate reader | BMG-Labtech | SPECTROstar Omega |
References
- Andrews, J. M. BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8). J. Antimicrob. Chemother. 64, 454-489 (2009).
- Worlitzsch, D. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J. Clin. Invest. 109, 317-325 (2002).
- Smith, A. L., Fiel, S. B., Mayer-Hamblett, N., Ramsey, B., Burns, J. L. Susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa isolates and clinical response to parenteral antibiotic administration: lack of association in cystic fibrosis. Chest. 123, 1495-1502 (2003).
- Sriramulu, D. D., Lunsdorf, H., Lam, J. S., Romling, U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J. Med. Microbiol. 54, 667-676 (2005).
- Garbe, J. Characterization of JG024, a pseudomonas aeruginosa PB1-like broad host range phage under simulated infection conditions. BMC Microbiol. 10, 301 (2010).
- Naughton, S. Pseudomonas aeruginosa AES-1 exhibits increased virulence gene expression during chronic infection of cystic fibrosis lung. PLoS One. 6, e24526 (2011).
- Moskowitz, S. M., Foster, J. M., Emerson, J. C., Gibson, R. L., Burns, J. L. Use of Pseudomonas biofilm susceptibilities to assign simulated antibiotic regimens for cystic fibrosis airway infection. J. Antimicrob. Chemother. 56, 879-886 (2005).
- Field, T. R., White, A., Elborn, J. S., Tunney, M. M. Effect of oxygen limitation on the in vitro antimicrobial susceptibility of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa grown planktonically and as biofilms. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 24, 677-687 (2005).
- Bjarnsholt, T. Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients. Pediatr. Pulmonol. 44, 547-558 (2009).
- Hill, D. Antibiotic susceptibilities of Pseudomonas aeruginosa isolates derived from patients with cystic fibrosis under aerobic, anaerobic, and biofilm conditions. J. Clin. Microbiol. 43, 5085-5090 (2005).
- Fung, C. Gene expression of Pseudomonas aeruginosa in a mucin-containing synthetic growth medium mimicking cystic fibrosis lung sputum. J. Med. Microbiol. 59, 1089-1100 (2010).
- Andrews, J. M. BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8). The Journal of antimicrobial chemotherapy. 64, 454-489 (2009).
- Rybtke, M. T. The implication of Pseudomonas aeruginosa biofilms in infections. Inflamm Allergy Drug Targets. 10, 141-157 (2011).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm. Pharmacol. Ther. 21, 595-599 (2008).
- Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. J. Immunol. Methods. 170, 211-224 (1994).
- Fothergill, J. L. Effect of antibiotic treatment on bacteriophage production by a cystic fibrosis epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 426-428 (2011).
- Singh, P. K. Quorum-sensing signals indicate that cystic fibrosis lungs are infected with bacterial biofilms. Nature. 407, 762-764 (2000).
- Mowat, E. Pseudomonas Aeruginosa Population Diversity and Turnover in Cystic Fibrosis Chronic Infections. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. , (2011).
- Fothergill, J. L., Mowat, E., Ledson, M. J., Walshaw, M. J., Winstanley, C. Fluctuations in phenotypes and genotypes within populations of Pseudomonas aeruginosa in the cystic fibrosis lung during pulmonary exacerbations. J. Med. Microbiol. 59, 472-481 (2010).
- Fouhy, Y. Diffusible signal factor-dependent cell-cell signaling and virulence in the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia. J. Bacteriol. 189, 4964-4968 (2007).
- Winstanley, C. Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa. Genome Res. 19, 12-23 (2009).
- Carter, M. E. A subtype of a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis epidemic strain exhibits enhanced virulence in a murine model of acute respiratory infection. J. Infect. Dis. 202, 935-942 (2010).
