Summary
目前的诊断药敏试验依靠浮游株生长在营养丰富，有氧条件下的。在这里，我们采用了一种替代人工痰媒介研究的肺囊肿性纤维化的代表都需氧和微需氧条件下绿脓杆菌生物膜药敏。
Abstract
有越来越多的关注， 在体外药敏试验的相关性应用于体育株时从囊性纤维化（CF）患者的铜绿 。现有的方法依赖于单一或少数菌株生长的需氧和planktonically。预定截止权衡，以确定是否细菌敏感或耐药的任何特定的抗生素1。然而，在慢性肺部感染的CF， 体育绿脓杆菌人口生物膜中存在，并有证据表明，环境主要是微需氧2。在肺和那些在诊断测试中的细菌之间的情况形成了鲜明的差异已成为问题的可靠性，甚至相关的这些测试3。
人工的痰介质（ASM）的体育是一种文化中的CF病人痰的组成部分，包括氨基酸，黏蛋白及游离DNA。 绿脓杆菌</ EM>增长过程中的CF感染，形成自我聚集的生物膜结构和人口的分歧4,5,6，在增长的ASM模仿。本研究的目的是要制定一个酶标板法研究P.药敏绿脓杆菌在ASM，这是适用于微需氧和有氧条件下生长的基础。
一个ASM法在微孔板格式。 体育绿脓杆菌生物膜被允许开发，连续3天在不同浓度的抗菌药物孵化前24小时。生物膜破坏后，细胞活力测定与刃天青染色。此法被用来确定为15个不同的体育妥布霉素柄细胞的最低抑菌浓度（中芯国际）需氧和微需氧的条件下，中芯国际值绿脓杆菌株相比，那些与标准肉汤增长得到。虽然一些证据增加浮游同行相比，他们的成长中的ASM株的MIC值，细菌在微需氧的条件，这表明大大增加抗> 128倍，对妥布霉素，在ASM系统测试时被发现的最大区别相比，在有氧条件下进行检测。
当前药敏试验方法和临床疗效之间缺乏关联3当前方法的有效性提出质疑。几个在体外模型已被用于先前研究体育绿脓杆菌生物膜7，8。然而，这些方法依赖于表面附着生物膜，而ASM生物膜像那些在CF肺9观察。此外，粘液减少氧浓度已经证明，以改变对体育的行为绿脓杆菌 2，影响抗生素的敏感性10。因此如胶似漆Ğ微需氧条件下，ASM可以提供一个更现实的环境中学习药敏。
Protocol
1。制备人工痰中等（ASM）的
- 4克鱼精子DNA加入250毫升无菌水，过几个小时内非常缓慢。的DNA需要几个小时才能完全溶解，并可以在室温下搅拌过夜。
- 从猪胃（II型）慢慢到250毫升的无菌水加入5Ğ粘液，直到粘蛋白完全溶解。该解决方案可在4搅拌过夜°C。
- L-酪氨酸，L-半胱氨酸的异常，在100毫升无菌水溶解0.25克，每必要和非必要的L-氨基酸。溶于25毫升0.5 M的氢氧化钾（M R 56.11克/摩尔）和L-酪氨酸0.25克25毫升无菌水0.25ĞL-半胱氨酸。
- 溶于5.9毫克二乙三胺五乙酸（DTPA），5 g氯化钠，氯化钾2.2克，100毫升无菌水。
- 结合的DNA，粘蛋白，L-氨基酸，胺，氯化钠，氯化钾，在1升瓶。
- 加入5毫升蛋黄émulsion和填充到约850毫升无菌水。
- 调整pH值至6.9，用1 M的Tris（pH值8.5; 121.14 M R），并用无菌水使体积为1升。
- 1 VACUUBRAND ME 2隔膜真空泵，微孔过滤Steritop单位使用0.22微米和45毫米的孔隙和颈部大小，分别过滤消毒的ASM。可以重新每个Steritop过滤装置，立即使用了三次，但过滤器必须用无菌水冲洗，再利用前的两倍。过滤过程是缓慢的，可超过2天进行。其他版本的ASM已经开发使用添加抗生素，而不是过滤11然而，由于药物的相互作用可能，我们不建议这个特定的应用程序的方法。
- 过滤和过滤的ASM，应保存在4°C，在黑暗中。建议使用新鲜的ASM然而，在这些条件下可以保存最多的一个月。
2。测定浮游固着细胞的最低代谢抑菌浓度（PSMIC）
- 为了确定代谢的最低抑制浓度为15 planktonically增长的体育 （PSMIC） 假单胞菌株，应稀释法，如抗菌化疗BSAC传输12英国社会的指导方针。抗生素的选择，在这种情况下，妥布霉素硫酸，连续稀释卢里亚-Bertani（LB）培养基中提供适当的抗生素浓度范围在96孔微孔板。
- 稀释隔夜文化体育绿脓杆菌在LB 0.05外径600（±0.01），添加100μL量的96孔的微孔板板含有100μL连续稀释抗生素的水井。在这种情况下，硫酸妥布霉素最终浓度介于512 - 0.5微克/毫升。八复制的每个antibiotic浓度应执行。
- 每个隔离应设立阴性对照井，没有添加抗生素。此外，八口井应该包含只使用空白作为一个在下游分析（2.6节）的LB。
- 在37°C孵育96以及酶标板1 - 2天，无晃动好氧或微需氧（10％的CO 2，O 2 5％和85％N2）条件下。微需氧条件得到大型厌氧罐中使用CampyGen气代包。
- 孵化之后，通过测量使用Fluostar欧米茄酶标仪和火星的数据分析软件的600纳米波长的吸光度在每口井的细菌培养，确定细菌的生长。
- 从抗生素治疗浮游文化（一抗生素治疗的浮游细胞 ）和阴性对照（ 阴性对照 ）吸收的吸收，应予以纠正减去从井的LB（ 空白 ）获得的背景吸收的离子。其后的生存能力的抑制率（指抗生素治疗的浮游细胞 /平均阴性对照 ）×100％计算。 PSMIC 90被定义为造成90％的浮游细菌生长的抑制浓度抗生素。
- 以确定细菌的生存能力后选择抗生素治疗，10微升0.02％（V / V），刃天青（蒸馏水稀释），每孔加入板块在有氧条件下孵育1 - 2小时37° C，而在150转摇。活菌粉红色荧光的试卤灵形式将减少刃天青蓝色染料。
- 孵化与刃天青，监测每口井使用540纳米的激发波长和发射波长在Fluostar欧米茄酶标仪590 nm的荧光。所述是应分析数据低。
3。生物膜固着细胞的最低抑菌浓度测定（BSMIC）
- 隔夜文化体育绿脓杆菌 （在这种情况下，用于15株绿脓杆菌 ）应在LB稀释到0.05 OD 600（±0.01），然后再稀释1:100新鲜的ASM（总容积1.8毫升）。
- 应该被添加到每个井的24孔组织培养处理板（1.8毫升）稀释文化。 3口井应该包含ASM只使用空白作为一个在下游分析（3.9节）。
- 争取3天需氧或微需氧条件下的实验室封口膜和孵育24孔板，在37°C，而在75转摇。微需氧条件下，应使用在大型的厌氧罐气体CampyGen代包。
- 稀释抗生素的选择，在这种情况下，妥布霉素硫酸，提供适当的浓度范围内新鲜ASM的。在这种情况下，终浓度为512 - 1微克/毫升之间。体积200μL，加入每个浓度的抗生素，在24孔板相应的井。四个每个抗生素浓度应执行的复制。生物膜接触到抗生素的选择，被用来作为阴性对照。
- 需氧或微需氧条件下为24小时，在37°C下安全实验室封口膜和孵育24孔板，同时摇转75。
- 孵化后在选择抗生素的存在，扰乱使用细菌生物膜100毫克/毫升纤维素（0.05 M的柠檬酸缓冲液稀释100μL[9.6克/升Citrate.H 2 0在水和pH值用NaOH 4.6] ）和有氧条件下孵化的24孔板，在37°C，而在150 rpm下振荡1小时。如果需要，生物膜可以进一步打乱手动移液器在这个阶段。
- 要确定的代谢活动释放破坏生物膜细菌细胞，刃天青（蒸馏水稀释）100微升0.02％（V / V）应添加到每个井的24孔板，在37°C孵育1 - 2小时，同时震动150转。
- 孵化与刃天青，测量每口井使用540纳米的激发波长和发射波长590纳米在Fluostar欧米茄酶标仪和火星的数据分析软件的荧光。
- 抗生素治疗生物膜（ 抗生素治疗生物膜 ）和阴性对照（ 阴性对照 ）的荧光的荧光应包含的ASM井获得的背景荧光纠正减法（六空白 ）。其后的生存能力的抑制率（平均抗生素治疗生物膜的F /均值F 阴性对照 ）×100％计算。 BSMIC 90定义为antibio抽动浓度造成90％的代谢活性的抑制。
4。代表结果
ASM生物膜的形成是可能的小卷（2毫升），生物膜得到充分形成3天之内（ 图1A）。这可以证明，通过严格的吹打生物膜，这应该是很难破坏。 microcolonies是与生长量较大（ 图1B）。图2显示了增长planktonically和生物膜的电子显微图像分析检测细胞之间的重大分歧。生物膜文化清楚地表明，外周围的基质细胞和生物膜内的个体结构相当的水平难以确定。
一些研究表明，生物膜的生活方式可以影响药敏13，14。我们的小规模的ASM检测可以用来DETE的rmine BSMIC的同时多株多种抗生素。检测的工作流程如图3所示。抗生素对细菌细胞活力的影响，可以采用刃天青检测。抗生素，在这种情况下，妥布霉素，可以添加到既定的生物膜和培养24小时。在此之后，生物膜被破坏和刃天青添加。
代谢活跃的细胞，可以减少刃天青染料从蓝色的颜色变化（刃天青）粉色（试卤灵）15。 图4A显示了一个例子法在体育绿脓杆菌培养生物膜破坏和刃天青此外，在微孔板前不同浓度妥布霉素。蓝色的非荧光色表示非活菌，而活菌粉红色荧光的形式，试卤灵减少染料。中芯国际，然后可以通过荧光转换成百分比计算其余细菌的生存能力。 图4B显示％的可行性与妥布霉素浓度增加的变化。 10％的生存能力被选为截断，以计算中芯国际90。
在有氧条件下，妥布霉素中芯国际90值较高的生物膜比浮游文化作为一种细胞生长。表1显示，所有菌株在PSMIC 90和BSMIC 90的变化。表2表明，在有氧条件下，在阻力急剧增加，妥布霉素（2>中芯国际的32倍）观察到的大多数菌株生长在ASM（生物膜模式）时相比，LB（浮游生物模式）。此外，微需氧条件下生长的生物膜展出时增加2至128倍的中芯国际相比，在有氧条件下生长的生物膜。
图1。在ASM 体育绿脓杆菌生物膜形成绿脓杆菌株PAO1 一个 30毫升的ASM文化，形成生物膜（大型）经过7天 的螺丝帽玻璃杜兰瓶，B，在2毫升的ASM文化的形成生物膜的生长（形成肉眼可见团块（microcolonies）的ASM中成长。小规模的），后3天，在24孔聚苯乙烯板的增长。
图2。 TEM照片的ASM生物膜的A / C的TEM照片（27,000）PAO1种植planktonically在ASM，分别为B / D型的TEM照片（X57，000）的PAO1grown浮游和ASM中，分别。 planktonically生长的细菌，在LB培养基中培养过夜。生物膜培养7天，30毫升的ASM文化。黑色箭头指细胞内的生物膜和恒星是指外空间。比例尺= 1微米。
图3。 ASM的生物膜药敏检测的工作流程。
图4。刃天青为使用抗生素敏感性测定细菌细胞培养，用不同浓度的抗生素和余下的代谢活性测定用刃天青。，蓝色荧光非氧化刃天青的形式表示非活细胞代谢减少粉红色荧光的试卤灵，B的活性细胞，荧光强度转换成百分比剩余细菌的生存能力。 10％的存活率，选择作为切断以计算MSMIC90， 点击这里查看LAR蒙古包的身影。株 PSMIC 90（微克/毫升）1 BSMIC 90（微克/毫升）1 有氧 微需氧2 有氧 微需氧2 PAO1 4 4 8 > 512 利物浦流行株（LES）的隔离 LESB58 21 8 64 64 128 LES400 22 32 128 8 256 LESB25 16 32 256 512 LESB55 16 64 64 > 512 LESB64 16 64 > 512 > 512 LES431 22 4 8 32 > 512 LESB49 16 64 64 256 LES109 32 128 32 > 512 非涡株 ， 49461 16 32 16 > 512 59032 0.5 2 4 > 512 59073 > 512 > 512 > 512 > 512 59076 16 32 32 > 512 </ TD> 27 8 16 4 > 512 45 16 32 4 > 512 表1。药敏绿脓杆菌妥布霉素。
测定的PSMICs和BSMICs妥布霉素1 2倍系列稀释
范围从512 - 0.5微克/毫升（每个浓度= 8），512 - 1微克/毫升（n = 4时为每个
浓度），分别;; PSMICs人使用标准的确定
稀释法1。O 2的 5％，10％的CO 2，85％N 2微需氧条件。
应变 90 / PSMIC BSMIC 90倍的变化1 PSMIC 有氧 →
PSMIC 微需氧BSMIC 有氧 →
BSMIC 微需氧PSMIC 有氧 →
BSMIC 有氧PSMIC 微需氧 →
BSMIC 微需氧PAO1 0 > 64 2 128 就业辅导组隔离 LESB58 8 2 8 2 LES400 4 32 0.25 2 LESB25 2 2 16 16 LESB55 4 > 8 4 > 8 LESB64 4 ND折价 > 32 > 8 LES431 2 > 16 8 > 64 LESB49 4 4 4 4 LES109 4 16 0 > 4 非涡株 ， 49461 2 > 32 0 > 16 59032 4 > 128 8 > 256 59073 ND折价 ND折价 ND折价 ND折价 59076 2 > 16 2 > 16 27 2 > 128 0.5 > 32 45 2 > 128 0.25 > 16 表2。倍数变化的PSMICs和妥布霉素BSMICs的。
1钕，没有确定值，大胆表明中芯国际的褶皱变化> 10。
Discussion
在这项研究中，我们采用体外模型基于一种新的ASM上复制体育在CF肺4 绿脓杆菌生物膜条件。该模型已成功修改为小规模，高通量检测的抗菌药物。
此法的关键步骤是：
- 一致的ASM媒体和保持无菌准备。我们致力于优化，其中每个组件被添加的方式实现可重复性的结果每次长时间。过滤的ASM是缓慢的，但最好是消毒，这可能破坏黏液的组成部分。我们不建议抗生素此外，其他11建议，因为这可能会施加相当的选择性压力，驱动突变，诱发噬菌体裂解16多个细菌基因的表达显着改变。
- 该法应根据体积Ø优化f的ASM使用。摇动的速度增加量较小，观察生物膜生命周期较短。
明显的应用是一个小规模的ASM生物膜模型的生物膜抗菌（BSMIC 90） 的敏感性更现实的决心。厌氧和微需氧龛是在目前的CF肺部，并有证据显示，被限制在2生物膜成熟，17深氧气。在这里，我们表明，临床体育 10/14从CF患者痰铜绿假单胞菌株 ASM中的微需氧条件下表现出了相当大（4 - ≥128倍）妥布霉素的敏感性下降。这项研究的结果表明，妥布霉素如抗生素，可能不太对体育的有效绿脓杆菌，比常规药敏试验方法在CF肺部感染。这些结果反映了10生物膜药敏以往的研究。小规模的ASM检测，从而提供一个简单的高通量平台，产生有意义的药敏数据，以更好地告知治疗的决定。该法被限制在以同样的方式作为常规药敏试验，单菌落筛选，可能无法代表整个人口的回升。然而，我们认为，办法（一）使用非表面附着生物膜的生长和（二）适用于微需氧条件，代表一个明确的选择和一个潜在的改善现有方法。我们得出这样的结论：该法是一个合适的模型来研究体育绿脓杆菌生物膜人口。在临床上的进一步测试将确定是否生物膜生长的体育基础的抗生素敏感性绿脓杆菌可能导致不同的微生物学和临床疗效与可能改善抗生素的选择。使用经典的生物膜模型的类似调查显示，导致BSMIC值抗生素治疗5,17不同的建议。
此外抗感染药物的有效性测试，ASM系统是一种廉价，动物模型，简单和可重复性的研究，如那些旨在了解体育多元化的替代绿脓杆菌人口。我们已经看到在自然种群广泛的异质性体育绿脓杆菌恢复CF病人痰18，19。在ASM 4（未发表资料）增长过程中，可以观察到类似的表型和基因型多样化，使得它在体外的CF肺部疾病模型的吸引力。 ASM模型相对简单，可以很容易地设计长期适应实验旨在监测P.抗生素或其他压力的影响，例如， 绿脓杆菌人口的分歧。此外，可以种植在其他细菌病原体ASM的。 Fouhy 等。例如，2007年用于ASM研究与生物膜形成maltophillia 20。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们承认，英国国家健康研究学会，博士Hadwen信托人文研究，英国领先的医学研究慈善机构的资金完全非动物研究技术，以取代动物实验，和威康信托基金会（格兰特089215）的支持。我们也承认，诺华制药公司（英国）有限公司（无限制教育补助金）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA from fish sperm | Sigma-Aldrich | 74782 | |
| Mucin from porcine stomach, type II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| L-Alanine | Acros Organics | 102830250 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | |
| L(+)-Asparagine monohydrate | Acros Organics | 175271000 | |
| L(+)-Aspartic acid | Acros Organics | 105041000 | |
| L-Cysteine | Sigma-Adrich | 168149 | |
| L(+)-Glutamic acid | Acros Organics | 156211000 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| Glycine | Acros Organics | 220911000 | |
| L-Histidine | Sigma-Adrich | H8000 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| L(+)-Lysine monohydrochloride | Acros Organics | 125222500 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| L-Phenylalanine | Acros Organics | 130310250 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| L-Serine | Acros Organics | 132660250 | |
| L-Threonine | Acros Organics | 138930250 | |
| L(-)-Tryptophan | Acros Organics | 140590250 | |
| L-Tyrosine | Acros Organics | 140641000 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500 | |
| Diethylenetriaminepentaacetic acid | Sigma-Aldrich | 32318 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S/3160/60 | |
| KCl | VWR | BDH0258 | |
| KOH | VWR | BDH0262 | |
| Egg yolk emulsion | Sigma-Aldrich | 17148 | |
| ME 2 diaphragm vacuum pump | Vacuubrand | 696126 | |
| Steritop filters (Pore size: 0.22 μm, Neck size: 45 mm) | EMD Millipore | SCGPT10RE | |
| Luria-Bertani medium | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| 96-well microtitre plates | Sarstedt Ltd | 82.1581 | |
| 24-well tissue culture-treated plates | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 3820-024 | |
| CampyGen gas generation packs | Oxford Labware | CN0025 | |
| Microaerophilic chamber | Oxford Labware | HP0011 | |
| Tobramycin sulphate | Sigma-Aldrich | T1783 | |
| Cellulase, from Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | 22178 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | 199303 | |
| Citrate.H20 | VWR | BDH0288 | |
| Fluostar omega microplate reader | BMG-Labtech | SPECTROstar Omega |
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