Summary
Testes de susceptibilidade antimicrobiana Atualmente, o diagnóstico baseia-se no crescimento planctônico dos isolados em ricas em nutrientes, condições aeróbicas. Aqui, nós utilizamos um meio de escarro alternativa artificial para estudar susceptibilidade antimicrobiana de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa em ambas as condições de aerobiose e microaerofilia mais representativas do pulmão da fibrose cística.
Abstract
Há uma crescente preocupação com a relevância do teste de susceptibilidade aos antimicrobianos in vitro quando aplicado a amostras de P. aeruginosa de fibrose cística (FC) dos pacientes. Os métodos existentes dependem única ou a poucas isolados cresceram em aerobiose e planktonically. Predeterminados cut-off são usados para definir se as bactérias são sensíveis ou resistentes a qualquer antibiótico administrado 1. No entanto, durante infecções pulmonares crônicas na CF, P. populações aeruginosa existir em biofilmes e há evidências de que o ambiente é em grande parte microaerofílica 2. A diferença gritante em condições entre bactérias no pulmão e os que durante os testes de diagnóstico foi posta em causa a relevância, fiabilidade e até mesmo de estes 3 testes.
Médio de expectoração artificial (ASM) é um meio de cultura contendo os componentes da CF expectoração paciente, incluindo aminoácidos, a mucina e DNA livre. P. aeruginosa </ Em> crescimento no crescimento imita ASM durante infecções CF, com a formação de estruturas auto-agregação de biofilme e divergência população 4,5,6. O objetivo deste estudo foi desenvolver um teste de microtitulação placa para estudar a susceptibilidade antimicrobiana de P. aeruginosa com base no crescimento em ASM, que é aplicável a ambas as condições microaerofílicas e aeróbicas.
Um ensaio de ASM foi desenvolvido em um formato de placa de microtitulação. P. biofilmes aeruginosa foram autorizados a desenvolver durante 3 dias antes da incubação com agentes antimicrobianos em diferentes concentrações de 24 horas. Após interrupção do biofilme, a viabilidade das células foi medida por coloração com resazurina. Este ensaio foi utilizado para determinar a concentração mínima inibitória séssil célula (SMIC) de tobramicina para 15 p diferente aeruginosa em condições aeróbias e microaerófilos e valores SMIC foram comparados com aqueles obtidos com o crescimento em caldo padrão. Embora se verifiquealguma evidência de aumento de valores de CIM para isolados cultivados em ASM, quando comparados a suas contrapartes planctônicas, as maiores diferenças foram encontradas com bactérias testadas em condições de microaerofilia, que mostraram uma resistência muito aumentada até um> 128 vezes, para tobramicina no sistema ASM quando em comparação com os ensaios realizados em condições aeróbias.
A falta de associação entre os métodos atuais de testes de suscetibilidade e evolução clínica tem questionado a validade dos métodos atuais 3. Vários modelos in vitro têm sido utilizados previamente para estudar p biofilmes aeruginosa 7, 8. No entanto, estes métodos dependem biofilmes de superfície em anexo, enquanto que os biofilmes ASM assemelham aos observados no pulmão CF 9. Além disso, a concentração de oxigénio reduzido no muco foi mostrado para alterar o comportamento de P. aeruginosa 2 e afetar a susceptibilidade a antibióticos 10. Portanto using ASM em condições de microaerofilia pode proporcionar um ambiente mais realista para se estudar a susceptibilidade antimicrobiana.
Protocol
1. Preparação do meio de escarro Artificial (ASM)
- Adicionar 4 g de DNA do esperma de peixe para 250 ml de água estéril muito lentamente ao longo de um período de várias horas. O DNA leva várias horas para dissolver completamente e pode ser agitada durante a noite à temperatura ambiente.
- Adicionar 5 g de mucina de porco estômago (tipo II) lentamente a 250 ml de água estéril até que a mucina se dissolveu completamente. A solução pode ser agitada durante a noite a 4 ° C.
- Dissolve-se 0,25 g de cada essenciais e não essenciais ácido L-amino, com a excepção de L-tirosina e L-cisteína, em 100 ml de água estéril. Dissolve-se 0,25 g de L-cisteína em 25 ml de hidróxido de potássio 0,5 M (M r 56,11 g / mol) e 0,25 g de L-tirosina em 25 ml de água estéril.
- Dissolve-se 5,9 mg de ácido dietilenotriaminopenta-acético (DTPA), 5 g de NaCl e 2,2 g de KCl em 100 ml de água estéril.
- Combinar o DNA, mucina, L-aminoácidos, DTPA, NaCl e KCl num frasco de 1 litro.
- Adicionar 5 ml de gema de ovo emulsion e encha até cerca de 850 ml com água estéril.
- Ajustar o pH a 6,9 com Tris 1 M (pH 8,5; M r 121,14) e levar o volume de 1 litro com água estéril.
- Esteriliza-se o ASM por filtração usando um VACUUBRAND ME 2 bomba de vácuo diafragma e unidades Millipore Steritop de filtro com um poro de tamanho e do pescoço de 0,22 e 45 mm, respectivamente. Cada unidade de filtro Steritop pode ser re-utilizado imediatamente até três vezes, no entanto, os filtros têm de ser lavadas duas vezes com água estéril antes da sua reutilização. O processo de filtração é lento e pode ser realizada durante 2 dias. Outras versões da ASM foram desenvolvidos que usam a adição de antibióticos, em vez de filtração 11 No entanto, devido a possíveis interações medicamentosas, não recomendamos o método para esta aplicação em particular.
- Não filtrada e filtrada ASM devem ser armazenadas a 4 ° C no escuro. Usando ASM fresco é recomendado no entanto, pode ser mantida sob estas condições durante um período máximo de um mês.
2. Determinação da Célula Sessile Concentração Inibitória Mínima Planktonic metabólica (PSMIC)
- Para determinar a concentração inibitória mínima metabólica (PSMIC) valores para 15 p planktonically crescido aeruginosa, o método de microdiluição deve ser realizada, como descrito nas orientações da British Society for Antimicrobial Chemotherapy BSAC 12. O antibiótico de escolha, neste sulfato de tobramicina caso, é diluído em série em meio Luria-Bertani (LB) meio de uma placa de 96 poços de microtitulação para proporcionar uma gama adequada de concentrações de antibiótico.
- Diluir as culturas durante a noite de P. aeruginosa em LB para uma densidade óptica 600 de 0,05 (± 0,01) e adicionar 100 volumes ul às cavidades da placa de microtitulação de 96 poços contendo 100 uL do antibiótico diluídas em série. Neste caso, as concentrações finais de tobramicina sulfato variou entre 512-0,5 ug / ml. Oito repetições de cada antibconcentração iotic deve ser realizada.
- Poços de controlo negativo para cada isolado deve ser criado, em que nenhum antibiótico é adicionado. Além disso, oito poços deve conter LB apenas para utilização como um branco durante a análise de jusante (Secção 2.6).
- Incubar as placas de 96 poços de microtítulo durante 1 - 2 dias a 37 ° C sem agitação em condições aeróbias ou microaerófilos (5% de O 2, 10% de CO 2, e 85% de N 2). Microaerofilia são obtidos utilizando embalagens de gás CampyGen geração em grandes jarras de anaerobiose.
- Após a incubação, o crescimento bacteriano é determinada medindo a absorvância da cultura bacteriana em cada poço a um comprimento de onda de 600 nm, utilizando um leitor de microplacas Fluostar Omega eo MARS Software de Análise de Dados.
- Absorção a partir de culturas tratadas com antibiótico planctônicas (um antibiótico células planctônicas tratados) e absorção a partir do controlo negativo (um controlo negativo) deve ser corrigido por subtrairião da absorvância de fundo obtido a partir do LB poços contendo apenas (Um espaço em branco). A percentagem de inibição da viabilidade é subsequentemente calculada como (média ± antibióticas células planctônicas tratados / média Um controle negativo) x 100%. O PSMIC 90 é definida como a concentração do antibiótico causando inibição de 90% do crescimento bacteriano planctônico.
- Para determinar a viabilidade bacteriana após o tratamento com o antibiótico de escolha, 10 ul de 0,02% (v / v) resazurina (diluído em água destilada) é adicionado a cada poço e as placas são incubadas sob condições aeróbias durante 1 - 2 h, a 37 ° C, agitando a 150 rpm. As células viáveis irá reduzir o corante azul resazurina para a forma resorufina rosa fluorescente.
- Após incubação com resazurina, monitorizar a fluorescência de cada poço utilizando um comprimento de onda de excitação de 540 nm e um comprimento de onda de emissão de 590 nm, em um Omega Fluostar leitor de microplacas. Os dados devem ser analisados como descrito serbaixo.
3. Determinação do biofilme Sessile Concentração Inibitória Mínima Célula (BSMIC)
- Culturas durante a noite de P. aeruginosa (neste caso, 15 isolados de P. aeruginosa são usados) deve ser diluído em LB para uma densidade óptica 600 de 0,05 (± 0,01), 1:100, em seguida, ainda mais diluída em ASM fresco (volume total de 1,8 ml).
- As culturas diluídas (1,8 ml) deve ser adicionado a cada poço de uma placa de cultura de 24 poços tecido tratado. Três poços devem conter ASM apenas para utilização como um branco durante a análise de jusante (Secção 3.9).
- Fixar as placas de 24 poços com laboratório parafilme e incubar durante 3 dias sob condições aeróbicas ou microaerofílica a 37 ° C, enquanto agitação a 75 rpm. Microaerofilia devem ser obtidas usando compressas de gás CampyGen geração em grandes jarras de anaerobiose.
- Diluir o antibiótico de escolha, neste sulfato de tobramicina caso, para proporcionar uma gama de concentração apropriada em frescoASM. Neste exemplo, as concentrações finais variaram entre 512-1 ug / ml. Adicionar a cada concentração do antibiótico, em volumes de 200 ul, aos poços apropriados de as placas de 24 poços. Quatro repetições de cada concentração do antibiótico deverá ser executado. Biofilmes não expostas ao antibiótico de escolha foram utilizados como controlo negativo.
- Fixar as placas de 24 poços com laboratório parafilme e incubar em condições aeróbias ou microaerófilos para um 24 h mais a 37 ° C, agitando a 75 rpm.
- Após a incubação na presença do antibiótico de escolha, romper os biofilmes bacterianas usando 100 ul de 100 mg / ml de celulase (diluído em tampão de citrato 0,05 M [9,6 g / l Citrate.H 2 0 em água e pH para 4,6 com NaOH] ) e incubar as placas de 24 poços, em condições aeróbicas a 37 ° C, agitando a 150 rpm durante 1 h. Se necessário, biofilmes poderia ser ainda mais perturbada por pipetagem manual nesta fase.
- Para determinar as atividades metabólicasdas células bacterianas libertadas pelos biofilmes rompidas, 100 ul de 0,02% (v / v) resazurina (diluído em água destilada) deve ser adicionado a cada poço das placas de 24 poços e incubadas durante 1-2 horas a 37 ° C , agitando a 150 rpm.
- Após incubação com resazurina, medir a fluorescência de cada poço utilizando um comprimento de onda de excitação de 540 nm e um comprimento de onda de emissão de 590 nm, em um leitor de microplacas Omega Fluostar eo MARS Software de Análise de Dados.
- Fluorescência a partir dos biofilmes tratadas com antibiótico (F tratadas com antibiótico biofilmes) e de fluorescência a partir dos controlos negativos (F controlo negativo) deve ser corrigido por subtracção da fluorescência de fundo obtidas a partir dos poços contendo apenas ASM (F em branco). A percentagem de inibição da viabilidade é subsequentemente calculada como (média de F antibióticas biofilmes tratados / média de controlo negativo F) x 100%. A 90 BSMIC é definida como a antibioconcentração tic causando inibição de 90% da atividade metabólica.
4. Os resultados representativos
Formação de biofilmes ASM é possível em pequenas (2 ml) e os volumes de biofilmes são completamente formado dentro de 3 dias (Figura 1A). Isto pode ser demonstrado por pipetagem rigorosamente o biofilme, o qual deve ser difícil de romper. Os microcolônias são comparáveis às cultivadas em volumes maiores 4 (Figura 1B). A Figura 2 mostra grandes diferenças entre as células cultivadas planktonically e em um biofilme como detectado por análise de imagem microscópica de electrões. Culturas de biofilme mostram claramente níveis consideráveis de matriz extracelular que rodeia as células e estruturas individuais dentro do biofilme são difíceis de identificar.
Vários estudos sugerem que o estilo de vida biofilme podem influenciar a susceptibilidade antimicrobiana 13, 14. Nosso ensaio em pequena escala ASM pode ser usado para Determine o BSMIC de antibióticos múltiplos para múltiplos isolados, ao mesmo tempo. O fluxo de trabalho do ensaio é mostrado na Figura 3. O efeito dos antibióticos sobre a viabilidade celular bacteriana pode ser medida utilizando o ensaio de resazurina. Antibióticos, neste caso tobramicina, pode ser adicionado ao biofilme estabelecida e incubou-se durante 24 h. Após este biofilme o é interrompido e resazurina é adicionado.
Células metabolicamente activas podem reduzir o corante resazurina resultando numa alteração de cor de azul (resazurina) para rosa (resorufina) 15. Figura 4A mostra um ensaio de exemplo em que p aeruginosa foram incubados com diferentes concentrações de tobramicina antes perturbação do biofilme e adição de resazurina em uma placa de microtitulação. A cor não fluorescente azul indica células não-viáveis, enquanto que as células viáveis reduzir o corante para a forma-de-rosa fluorescente, resorufina. A SMIC pode então ser calculada através da conversão de fluorescência em percentagemresidual viabilidade bacteriana. Figura 4B mostra a alteração em% de viabilidade com a concentração de tobramicina crescente. Viabilidade de 10% foi escolhido como um cut-off, a fim de calcular a 90 SMIC.
Em condições aeróbicas, os tobramicina SMIC 90 valores são maiores para as células cultivadas como um biofilme do que os de culturas planctônicas. A Tabela 1 mostra a variação na PSMIC 90 e BSMIC 90 para todos os isolados testados. A Tabela 2 mostra que, sob condições aeróbicas, um aumento dramático na resistência a tobramicina (2 a> aumento de 32 vezes na SMIC) foi observada para a maioria dos isolados, quando cultivada em ASM (biofilme modo) em comparação com LB (modo planctônicas). Além disso, biofilmes crescidas sob condições microaerofílicas exibiram um aumento de SMIC entre 2 e> 128 vezes quando comparado com biofilmes crescidas sob condições aeróbias.
Figura1. Formação de biofilme de P. aeruginosa em ASM P. aeruginosa cepa PAO1 forma touceiras macroscopicamente visíveis (microcolônias) quando cultivadas em ASM. A formação de biofilmes, em 30 ml culturas ASM (grande escala), após crescimento de 7 dias em vidro com tampa de rosca Duran frascos. B, a formação de biofilmes em 2 ml culturas ASM ( em pequena escala) após 3 dias de crescimento em placas de 24 poços de poliestireno.
Figura 2. Micrografias TEM de biofilmes ASM A / C TEM Micrografia (x; 27.000) de PAO1 crescido planktonically e em ASM, respectivamente, B / D TEM micrografia (x57, 000) de plâncton PAO1grown e em ASM, respectivamente. Bactérias Planktonically cultivadas foram cultivadas durante a noite em caldo LB. Os biofilmes foram cultivados por 7 dias em 30 culturas ml ASM. Setas pretas referem-se às células dentro do biofilme e estrelas referem-se a espaços extracelulares. Barras de escala = 1iM.
Figura 3. Fluxo de trabalho do ASM ensaio de susceptibilidade antimicrobiana de biofilme.
Figura 4. A utilização de resazurina para a determinação da susceptibilidade aos antibióticos As células bacterianas foram incubadas com diferentes concentrações do antibiótico e da actividade metabólica restante foi determinado utilizando resazurina. A, A forma não fluorescente azul oxidada da resazurina indica células não-viáveis e é reduzida por metabólica células activas para rosa fluorescente resorufina. B, a intensidade de fluorescência é convertida em percentagem de viabilidade bacteriana restante. Viabilidade de 10% foi escolhido como ponto de corte, a fim de calcular o MSMIC90. Clique aqui para ver larfigura ger.Cepas PSMIC 90 (ug / ml) 1 BSMIC 90 (ug / ml) 1 Aeróbico 2 microaerofilia Aeróbico 2 microaerofilia PAO1 4 4 8 > 512 Liverpool Epidemia Strain (LES) isolados LESB58 21 8 64 64 128 LES400 22 32 128 8 256 LESB25 16 32 256 512 LESB55 16 64 64 > 512 LESB64 16 64 > 512 > 512 LES431 22 4 8 32 > 512 LESB49 16 64 64 256 LES109 32 128 32 > 512 Non-LES isolados 49461 16 32 16 > 512 59032 0,5 2 4 > 512 59073 > 512 > 512 > 512 > 512 59076 16 32 32 > 512 </ Td> 27 8 16 4 > 512 45 16 32 4 > 512 Tabela 1. Suscetibilidade de P. aeruginosa à tobramicina.
1 Para a determinação de PSMICs e tobramicina BSMICs foi utilizado em duas diluições em série
variando de 512-0,5 ug / ml (n = 8 para cada concentração) e 512-1 ug / ml (n = 4 para cada
concentração), respectivamente;; PSMICs foram determinadas usando o padrão
método de microdiluição 1.2 condições microaerofílicas foram de 5% de O 2, 10% de CO 2, e 85% de N2.
Tensão PSMIC 90/90 BSMIC mudança dobra 1 PSMIC aeróbico →
Microaerofilia PSMICBSMIC aeróbico →
Microaerofilia BSMICPSMIC aeróbico →
BSMIC aeróbicaPSMIC microaerofilia →
Microaerofilia BSMICPAO1 0 > 64 2 128 LES isola LESB58 8 2 8 2 LES400 4 32 0,25 2 LESB25 2 2 16 16 LESB55 4 > 8 4 > 8 LESB64 4 ND > 32 > 8 LES431 2 > 16 8 > 64 LESB49 4 4 4 4 LES109 4 16 0 > 4 Non-LES isolados 49461 2 > 32 0 > 16 59032 4 > 128 8 > 256 59073 ND ND ND ND 59076 2 > 16 2 > 16 27 2 > 128 0,5 > 32 45 2 > 128 0,25 > 16 Tabela 2. Mudança de dobra PSMICs e BSMICs à tobramicina.
1 ND, não determinadas, valores em negrito indicam SMIC mudanças vezes> 10.
Discussion
Neste estudo foi utilizado um novo modelo in vitro com base em ASM para replicar P. aeruginosa condições de biofilme dentro do pulmão 4 CF. O modelo foi modificado com sucesso em pequena escala, o teste de alto rendimento de agentes antimicrobianos.
Os passos críticos deste ensaio são:
- Preparação consistente dos meios de comunicação ASM e esterilidade manutenção. Temos dedicado longas horas para optimizar a forma em que cada componente é adicionado para obter resultados reprodutíveis de cada vez. A filtração do ASM é lento, mas é preferível a autoclavagem, o que pode danificar o componente de mucina. Isso não se recomenda a adição de antibióticos, como sugerido por outros 11 porque este pode impor consideráveis pressões selectivas, mutações de unidade, induzem a lise profago 16 e alterar significativamente a expressão de vários genes bacterianos.
- O ensaio deve ser optimizada de acordo com o volume of ASM utilizado. Velocidades de agitação são aumentadas para volumes menores e menor biofilme ciclo de vida é observado.
Uma aplicação óbvia do modelo de biofilme em pequena escala ASM é a determinação mais realista do biofilme susceptibilidades antimicrobianas (BSMIC 90). Nichos anaeróbios e microaerófilos estão presentes no pulmão CF e há evidências de que o oxigénio é limitada no fundo de biofilmes madura 2, 17. Aqui demonstramos que 10/14 P. clínica aeruginosa de paciente com FC apresentam um escarro (4 - ≥ vezes 128) considerável diminuição na sensibilidade à tobramicina em condições de microaerofilia em ASM. Os resultados deste estudo sugerem que os antibióticos, tais como a tobramicina, pode ser menos eficaz contra P. infecções aeruginosa no pulmão CF do que os indicados por métodos de ensaio convencionais susceptibilidade. Estes resultados refletem estudos anteriores sobre a susceptibilidade antimicrobiana de biofilmes 10. Pequeno-escala ensaios ASM, assim, proporcionar uma plataforma de transferência simples de alta para gerar dados significativos de susceptibilidade aos antimicrobianos para informar melhor as decisões terapêuticas. O ensaio é limitada da mesma maneira como os testes de susceptibilidade aos antibióticos convencionais em que as colónias únicas são escolhidas para o rastreio que não pode ser representativa de toda a população. No entanto, acreditamos que uma abordagem (i) utilizando superfície não-crescimento do biofilme em anexo e (ii) aplicáveis a condições microaerofílicas, representa uma alternativa clara e uma melhoria potencial aos métodos existentes. Concluímos que este ensaio é de um modelo adequado para estudar p biofilme populações aeruginosa. Mais testes em ambientes clínicos seria verificar se as suscetibilidades aos antibióticos baseado em biofilme cresceu P. aeruginosa pode levar a diferentes opções de antibióticos com potencial melhora nos resultados microbiológicos e clínicos. Estudos similares com modelos clássicos de biofilme demonstraram que valores BSMIC levarpara diferentes recomendações para o tratamento antibiótico 5,17.
Além dos testes para a eficácia dos agentes anti-bacterianos, o sistema ASM representa uma alternativa barata, simples e reprodutível de modelos animais para estudos como os que visam a compreensão da diversificação de P. populações aeruginosa. Observamos grande heterogeneidade em populações naturais de P. aeruginosa recuperado de paciente com FC escarros 18, 19. Diversificação fenotípica e genotípica semelhante pode ser observada durante o crescimento em ASM 4 (e os nossos dados não publicados), tornando-se uma atraente modelo in vitro das condições pulmonares FC. A relativa simplicidade do modelo ASM torna mais fácil para conceber experiências de longo prazo de adaptação como objectivo, por exemplo, no controlo dos efeitos dos antibióticos ou outras tensões sobre P. divergência população aeruginosa. Além disso, outros agentes patogénicos bacterianos podem ser cultivadas emASM. Por exemplo, Fouhy et al. Usaram ASM 2007 para estudar a formação de biofilme por S. maltophillia 20.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos o apoio do Reino Unido National Institute for Health Research, o Dr. Hadwen confiança para Pesquisa Humana, o financiamento do Reino Unido caridade líder investigação médica exclusivamente técnicas de pesquisa sem animais para substituir a experimentação animal, eo Wellcome Trust (Grant 089.215). Reconhecemos também a Novartis Pharmaceuticals UK Ltd (educacional irrestrita de subvenção).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA from fish sperm | Sigma-Aldrich | 74782 | |
| Mucin from porcine stomach, type II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| L-Alanine | Acros Organics | 102830250 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | |
| L(+)-Asparagine monohydrate | Acros Organics | 175271000 | |
| L(+)-Aspartic acid | Acros Organics | 105041000 | |
| L-Cysteine | Sigma-Adrich | 168149 | |
| L(+)-Glutamic acid | Acros Organics | 156211000 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| Glycine | Acros Organics | 220911000 | |
| L-Histidine | Sigma-Adrich | H8000 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| L(+)-Lysine monohydrochloride | Acros Organics | 125222500 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| L-Phenylalanine | Acros Organics | 130310250 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| L-Serine | Acros Organics | 132660250 | |
| L-Threonine | Acros Organics | 138930250 | |
| L(-)-Tryptophan | Acros Organics | 140590250 | |
| L-Tyrosine | Acros Organics | 140641000 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500 | |
| Diethylenetriaminepentaacetic acid | Sigma-Aldrich | 32318 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S/3160/60 | |
| KCl | VWR | BDH0258 | |
| KOH | VWR | BDH0262 | |
| Egg yolk emulsion | Sigma-Aldrich | 17148 | |
| ME 2 diaphragm vacuum pump | Vacuubrand | 696126 | |
| Steritop filters (Pore size: 0.22 μm, Neck size: 45 mm) | EMD Millipore | SCGPT10RE | |
| Luria-Bertani medium | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| 96-well microtitre plates | Sarstedt Ltd | 82.1581 | |
| 24-well tissue culture-treated plates | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 3820-024 | |
| CampyGen gas generation packs | Oxford Labware | CN0025 | |
| Microaerophilic chamber | Oxford Labware | HP0011 | |
| Tobramycin sulphate | Sigma-Aldrich | T1783 | |
| Cellulase, from Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | 22178 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | 199303 | |
| Citrate.H20 | VWR | BDH0288 | |
| Fluostar omega microplate reader | BMG-Labtech | SPECTROstar Omega |
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