Summary
Current test diagnostici di sensibilità agli antibiotici si basa sulla crescita planctoniche di isolati in ricchi di nutrienti, le condizioni aerobiche. Qui, ci avvaliamo di un mezzo alternativo sputum artificiale per studiare sensibilità agli antibiotici di Pseudomonas aeruginosa biofilm sia in condizioni aerobiche e microaerofili più rappresentativi del polmone fibrosi cistica.
Abstract
Vi è una crescente preoccupazione per la rilevanza dei test di sensibilità in vitro agli antimicrobici quando applicata a isolati di P. aeruginosa da fibrosi cistica (CF) pazienti. Metodi esistenti contare su uno o alcuni isolati coltivati aerobicamente e planktonically. Predeterminate cut-off sono utilizzati per definire se i batteri sono sensibili o resistenti a qualsiasi antibiotico somministrato 1. Tuttavia, durante le infezioni polmonari croniche in CF, P. popolazioni aeruginosa esistono in biofilm e vi sono prove che l'ambiente è in gran parte microaerofilo 2. La netta differenza di condizioni tra i batteri nel polmone e quelli durante i test diagnostici ha messo in discussione l'affidabilità e la rilevanza anche di questi test 3.
Media espettorato artificiale (ASM) è un terreno di coltura contenente i componenti di espettorato dei pazienti CF, tra cui aminoacidi, mucina e il DNA libero. P. aeruginosa </ Em> Crescita in ASM crescita mimica durante le infezioni CF, con la formazione di auto-aggregazione di strutture biofilm e divergenza della popolazione 4,5,6. Lo scopo di questo studio era di sviluppare un microtitolazione-piastra di analisi per studiare sensibilità agli antibiotici di P. aeruginosa basata sulla crescita in ASM, che è applicabile a queste due condizioni microaerofili e aerobica.
Un saggio di ASM è stato sviluppato in un formato micropiastra. P. biofilm aeruginosa sono stati lasciati sviluppare per 3 giorni prima dell'incubazione con agenti antimicrobici a diverse concentrazioni per 24 ore. Dopo l'interruzione biofilm, la vitalità cellulare è stata misurata mediante colorazione con resazurina. Questo test è stato utilizzato per accertare la sessile concentrazione minima inibitoria delle cellule (SMIC) di tobramicina per 15 differenti P. aeruginosa isolati in condizioni aerobiche e microaerofili SMIC ei valori sono stati confrontati con quelli ottenuti con brodo di crescita standard. Mentre non vi eraalcune prove per i valori di MIC maggiori per isolati coltivati in ASM rispetto ai loro omologhi planctonici, le maggiori differenze sono state trovate con i batteri testati in condizioni microaerofili, che hanno mostrato una resistenza molto aumentata fino ad un> 128 volte, verso tobramicina nel sistema ASM, quando rispetto ai saggi effettuati in condizioni aerobiche.
La mancanza di associazione tra i metodi attuali test di sensibilità e risultati clinici ha messo in dubbio la validità dei metodi attuali 3. Vari modelli in vitro sono stati utilizzati precedentemente per studiare P. biofilm aeruginosa 7, 8. Tuttavia, questi metodi si basa su biofilm di superficie collegati, mentre i biofilm ASM simili a quelli osservati nel polmone CF 9. Inoltre, la concentrazione di ossigeno ridotto nel muco è stato dimostrato che alterano il comportamento di P. aeruginosa 2 e pregiudica la suscettibilità agli antibiotici 10. Pertanto using ASM in condizioni microaerofili può fornire un ambiente più realistico in cui studiare sensibilità agli antibiotici.
Protocol
1. Preparazione del mezzo dell'espettorato artificiale (ASM)
- Aggiungere 4 g di DNA da sperma di pesce a 250 ml di acqua sterile molto lentamente in un periodo di diverse ore. Il DNA richiede diverse ore per sciogliere completamente e può essere agitata per una notte a temperatura ambiente.
- Aggiungere 5 g mucina da suini allo stomaco (tipo II) lentamente a 250 ml di acqua sterile fino a quando la mucina è sciolto completamente. La soluzione può essere agitata per una notte a 4 ° C.
- Sciogliere 0,25 g di ciascun essenziali e non essenziali L-amminoacido, con l'eccezione di L-tirosina e L-cisteina, in 100 ml di acqua sterile. Sciogliere 0,25 g di L-cisteina in 25 ml di idrossido di potassio 0,5 M (M r 56,11 g / mol) e 0,25 g di L-tirosina in 25 ml di acqua sterile.
- Sciogliere 5,9 mg di acido diethylenetriaminepentaacetic (DTPA), 5 g di NaCl e 2,2 g di KCl in 100 ml di acqua sterile.
- Combinare il DNA, mucina, L-amminoacidi, DTPA, NaCl e KCl in una bottiglia 1 litro.
- Aggiungere 5 ml di tuorlo d'uovo emulsion e riempimento a circa 850 ml con acqua sterile.
- Regolare il pH a 6,9 con 1 M Tris (pH 8,5, M r 121,14) e portare il volume di 1 litro con acqua sterile.
- Sterilizzare la ASM per filtrazione usando un ME Vacuubrand 2 pompa da vuoto a membrana e Millipore Steritop unità filtranti con pori e le dimensioni del collo di 0,22 micron e 45 mm, rispettivamente. Ogni unità Steritop filtro può essere riutilizzato immediatamente fino a tre volte, tuttavia, i filtri devono essere risciacquato due volte con acqua sterile prima del riutilizzo. Il processo di filtrazione è lento e può essere effettuata in 2 giorni. Altre versioni di ASM sono stati sviluppati che utilizzano l'aggiunta di antibiotici, invece di filtrazione 11 Tuttavia, a causa di possibili interazioni farmacologiche, si sconsiglia il metodo per questa particolare applicazione.
- Filtrati e filtrata ASM deve essere conservato a 4 ° C al buio. Uso fresco ASM si raccomanda tuttavia, può essere mantenuta in queste condizioni per un massimo di un mese.
2. Determinazione del Sessile concentrazione minima inibitoria cellule planctoniche Metabolica (PSMIC)
- Per determinare la concentrazione minima inibitoria metabolica (PSMIC) i valori per 15 planktonically cresciuta P. aeruginosa isolati, il metodo microdiluizione deve essere eseguita, come descritto nelle linee guida della British Society for Antimicrobial Chemotherapy BSAC 12. L'antibiotico di scelta, in questo caso tobramicina solfato, è diluito in serie Luria-Bertani (LB) in media una piastra a 96 pozzetti microtiter per fornire un intervallo di concentrazione adeguato di antibiotici.
- Diluire culture notte di P. aeruginosa in LB ad una OD 600 di 0,05 (± 0,01) e aggiungere 100 volumi pl ai pozzetti della piastra a 96 pozzetti di microtitolazione contenente 100 pl del antibiotico diluiti serialmente. In questo caso, le concentrazioni finali di tobramicina solfato compresa tra 512-0,5 ug / ml. Otto repliche di ogni antibiotic concentrazione deve essere eseguita.
- Pozzetti di controllo negativi per ogni isolato dovrebbe essere istituito, in cui nessun antibiotico viene aggiunto. Inoltre, dovrebbe contenere otto pozzi LB solo per l'uso come uno sbozzato durante l'analisi a valle (sezione 2.6).
- Incubare le piastre a 96 pozzetti microtiter per 1 - 2 giorni a 37 ° C senza agitazione in condizioni aerobiche o microaerofili (5% O 2, 10% CO 2, e 85% N 2). Condizioni microaerofili sono ottenuti utilizzando CampyGen confezioni di generazione di gas in grandi vasi anaerobici.
- Dopo l'incubazione, la crescita batterica è determinata misurando l'assorbanza della coltura batterica in ciascun pozzetto ad una lunghezza d'onda di 600 nm usando un lettore di micropiastre Fluostar Omega e Analysis Software MARS dati.
- L'assorbimento da parte trattata con antibiotici culture planctonici (A cellule antibiotiche planctonici trattati) e l'assorbimento dai controlli negativi (un controllo negativo) devono essere corretti da sottrarreione di assorbanza ottenuto dal fondo LB pozzetti contenente solo (A vuoto). L'inibizione percentuale di vitalità è successivamente calcolato come (media ± cellule antibiotiche planctonici trattate /, un controllo negativo) x 100%. Il PSMIC 90 è definita come la concentrazione di antibiotico provoca 90% di inibizione della crescita batterica planctonici.
- Per determinare la vitalità batterica dopo il trattamento con l'antibiotico di scelta, 10 pl di 0,02% (v / v) resazurina (diluito in acqua distillata) viene aggiunto a ciascun pozzetto e le piastre vengono incubate in condizioni aerobiche per 1 - 2 ore a 37 ° C, agitando a 150 rpm. Cellule vitali ridurrà il colorante blu resazurina alla forma resorufina rosa fluorescente.
- Dopo l'incubazione con resazurina, monitorare la fluorescenza di ciascun pozzetto utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 540 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 590 nm in un lettore di micropiastre Fluostar Omega. I dati dovrebbero essere analizzati come descritto dibassa.
3. Determinazione del Biofilm Sessile minima concentrazione inibente Cell (BSMIC)
- Pernottamento culture di P. aeruginosa (in questo caso, 15 isolati di P. aeruginosa sono utilizzati) deve essere diluito in LB ad una OD 600 di 0,05 (± 0,01), 1:100 quindi ulteriormente diluita in ASM fresco (volume totale 1,8 ml).
- Le colture diluiti (1,8 ml) deve essere aggiunto a ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti di coltura di tessuti trattati. Tre pozzetti devono contenere ASM solo per l'uso come uno sbozzato durante l'analisi a valle (sezione 3.9).
- Fissare le piastre da 24 pozzetti con laboratorio parafilm e incubare per 3 giorni in condizioni aerobiche o microaerofili a 37 ° C, agitando a 75 rpm. Condizioni microaerofili dovrebbe essere ottenuto utilizzando CampyGen confezioni di generazione di gas in grandi vasi anaerobici.
- Diluire l'antibiotico di scelta, in questo caso tobramicina solfato, di fornire una gamma appropriata di concentrazione in acqua dolceASM. In questo caso, le concentrazioni finali comprese tra 512-1 ug / ml. Aggiungi ciascuna concentrazione dell'antibiotico, in volumi di 200 pl, nei rispettivi pozzetti delle piastre da 24 pozzetti. Quattro repliche di ciascuna concentrazione antibiotica deve essere eseguito. Biofilm non esposte al antibiotico di scelta sono stati utilizzati come controllo negativo.
- Bloccare le piastre a 24 pozzetti con laboratorio parafilm e incubare in condizioni aerobiche o microaerofilo per altre 24 ore a 37 ° C, agitando a 75 rpm.
- Dopo incubazione in presenza dell'antibiotico di scelta, interrompere le biofilm batteriche utilizzando 100 pl di 100 mg / ml cellulasi (diluito in tampone citrato 0,05 M [9,6 g / l Citrate.H 2 0 in acqua e il pH a 4,6 con NaOH] ) e incubare le piastre a 24 pozzetti in condizioni aerobiche a 37 ° C, agitando a 150 rpm per 1 h. Se necessario, biofilm potrebbe essere ulteriormente perturbato pipettando uso in questa fase.
- Per determinare le attività metabolichedelle cellule batteriche rilasciate dai biofilm disgregate, 100 pl di 0,02% (v / v) resazurina (diluito in acqua distillata) deve essere aggiunto a ciascun pozzetto di piastre da 24 pozzetti e incubate per 1 - 2 ore a 37 ° C , agitando a 150 rpm.
- Dopo l'incubazione con resazurina, misurare la fluorescenza di ciascun pozzetto utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 540 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 590 nm in un lettore di micropiastre Omega Fluostar e analisi dei dati MARS Software.
- Fluorescenza dalle trattata con antibiotici biofilm (F trattata con antibiotici biofilm) e fluorescenza dai controlli negativi (controllo negativo F) devono essere corretti per sottrazione di fluorescenza di fondo ottenuto dai pozzetti contenenti solo ASM (F vuoto). L'inibizione percentuale di vitalità è successivamente calcolato come (media di F biofilm trattati con antibiotici / F: controllo negativo) x 100%. Il BSMIC 90 è definita come la terapia anticoncentrazione tic causando il 90% di inibizione dell'attività metabolica.
4. Risultati rappresentativi
Formazione di biofilm ASM è possibile in piccole (2 ml) volumi e le biofilm sono completamente formate entro 3 giorni (Figura 1A). Questo può essere dimostrato rigorosamente pipettando del biofilm, che dovrebbe essere difficile da interrompere. I microcolonie sono paragonabili a quelli cresciuti in volumi maggiori 4 (figura 1B). Figura 2 mostra le principali differenze tra le cellule coltivate planktonically e in un biofilm rilevata da analisi di immagine al microscopio elettronico. Culture biofilm mostrano chiaramente i livelli considerevoli di matrice extracellulare che circonda le cellule e le strutture dei singoli all'interno del biofilm sono difficili da identificare.
Diversi studi suggeriscono che lo stile di vita biofilm può influenzare la suscettibilità agli antibiotici 13, 14. Il nostro piccolo saggio di scala ASM può essere utilizzato per determine la BSMIC di antibiotici multipli per isolati multipli contemporaneamente. Il flusso del saggio è mostrato in Figura 3. L'effetto di antibiotici sulla vitalità cellulare batterica può essere misurata usando il saggio resazurina. Antibiotici, in questo caso tobramicina, può essere aggiunto al biofilm stabilito e incubate per 24 h. Dopo questo il biofilm è interrotta e resazurina viene aggiunto.
Cellule metabolicamente attive può ridurre il colorante resazurina conseguente cambiamento di colore dal blu (resazurina) al rosa (resorufina) 15. Figura 4A mostra un saggio esempio in cui P. aeruginosa è stata incubata con differenti concentrazioni di tobramicina prima interruzione biofilm e aggiunta di resazurina in una piastra di microtitolazione. Il blu non fluorescenti colore indica cellule non vitali, mentre le cellule vitali di ridurre il colorante alla forma rosa fluorescente, resorufina. Lo SMIC può quindi essere calcolata convertendo fluorescenza in percentualerimanente vitalità batterica. Figura 4B mostra la variazione vitalità% con concentrazione crescente tobramicina. 10% di redditività è stato scelto come cut-off al fine di calcolare la SMIC 90.
In condizioni aerobiche, tobramicina SMIC i 90 valori sono superiori per le cellule coltivate come biofilm da quelli delle culture planctonici. La tabella 1 mostra la variazione in PSMIC BSMIC 90 e 90 per tutti gli isolati testati. Tabella 2 mostra che in condizioni aerobiche, un drammatico aumento della resistenza alla tobramicina (2 a> 32 volte maggiore in SMIC) è stato osservato per la maggior parte degli isolati, quando coltivate in ASM (biofilm mode) rispetto a LB (modalità planctonico). Inoltre, biofilm coltivate in condizioni microaerofili esposto uno SMIC maggiore tra 2 e> 128-volte rispetto ai biofilm cresciuti in condizioni aerobiche.
Figura1. Formazione di biofilm di P. aeruginosa in ASM P. ceppo aeruginosa PAO1 forma grumi macroscopicamente visibili (microcolonie) quando coltivate in ASM. A, la formazione di biofilm in 30 ml culture ASM (grande) dopo 7 giorni in crescita tappo a vite in vetro Duran fiaschi. B, la formazione di biofilm in 2 ml culture ASM ( piccola scala) dopo 3 giorni di crescita in piastre da 24 pozzetti di polistirene.
Figura 2. Micrografie TEM di biofilm ASM A / C al microscopio TEM (x; 27.000) cresciuti del PAO1 planktonically e in ASM, rispettivamente, B / D micrografia TEM (x57, 000) di planctonici PAO1grown ed in ASM, rispettivamente. Batteri Planktonically cresciute sono state coltivate per tutta la notte in brodo LB. I biofilm sono state coltivate per 7 giorni in 30 ml culture ASM. Frecce nere fare riferimento a celle all'interno del biofilm e le stelle si riferiscono agli spazi extracellulari. Barre di scala = 1um.
Figura 3. Workflow della ASM test biofilm suscettibilità agli antibiotici.
Figura 4. L'uso della resazurina per la determinazione della suscettibilità di antibiotici sono state incubate cellule batteriche con differenti concentrazioni di antibiotico e l'attività metabolica rimanente è stata determinata utilizzando resazurina. A, il blu non fluorescente forma ossidata di resazurina indica cellule non vitali e si riduce metabolica cellule attive al rosa fluorescente resorufina. B, l'intensità di fluorescenza viene convertito in percentuale di rimanere vitalità batterica. 10% di redditività è stato scelto come cut-off al fine di calcolare la MSMIC90. Clicca qui per visualizzare larger figura.Ceppi PSMIC 90 (pg / ml) 1 BSMIC 90 (pg / ml) 1 Aerobico Microaerofili 2 Aerobico Microaerofili 2 PAO1 4 4 8 > 512 Liverpool Epidemic Strain (LES) isola LESB58 21 8 64 64 128 LES400 22 32 128 8 256 LESB25 16 32 256 512 LESB55 16 64 64 > 512 LESB64 16 64 > 512 > 512 LES431 22 4 8 32 > 512 LESB49 16 64 64 256 LES109 32 128 32 > 512 Non-LES isolati 49461 16 32 16 > 512 59032 0,5 2 4 > 512 59073 > 512 > 512 > 512 > 512 59076 16 32 32 > 512 </ Td> 27 8 16 4 > 512 45 16 32 4 > 512 Tabella 1. Sensibilità di P. aeruginosa alla tobramicina.
1 Per la determinazione del PSMICs e BSMICs tobramicina è stata utilizzata in diluizioni seriali di 2 volte
vanno 512-0,5 mg / ml (n = 8 per ciascuna concentrazione) e 512-1 pg / ml (n = 4 per ciascun
concentrazione), rispettivamente;; PSMICs sono stati determinati usando lo standard
microdiluizione metodo 1.2 condizioni microaerofili erano del 5% O 2, 10% CO 2, e 85% N 2.
Sforzo PSMIC 90/90 BSMIC fold change 1 PSMIC aerobica →
PSMIC microaerofiloBSMIC aerobica →
BSMIC microaerofiloPSMIC aerobica →
BSMIC aerobicaPSMIC microaerofilo →
BSMIC microaerofiloPAO1 0 > 64 2 128 LES isola LESB58 8 2 8 2 LES400 4 32 0,25 2 LESB25 2 2 16 16 LESB55 4 > 8 4 > 8 LESB64 4 ND > 32 > 8 LES431 2 > 16 8 > 64 LESB49 4 4 4 4 LES109 4 16 0 > 4 Non-LES isolati 49461 2 > 32 0 > 16 59032 4 > 128 8 > 256 59073 ND ND ND ND 59076 2 > 16 2 > 16 27 2 > 128 0,5 > 32 45 2 > 128 0,25 > 16 Tabella 2. Fold change di PSMICs e BSMICs alla tobramicina.
1 ND, non determinati, valori in grassetto indicano le modifiche SMIC piega> 10.
Discussion
In questo studio abbiamo utilizzato un nuovo modello in vitro sulla base di ASM per replicare P. biofilm condizioni aeruginosa all'interno del polmone CF 4. Il modello è stato modificato con successo per la piccola, high-throughput test di agenti antimicrobici.
I passaggi critici di questo test sono:
- Preparazione costante dei mezzi di comunicazione ASM e sterilità mantenimento. Abbiamo dedicato lunghe ore per ottimizzare il modo in cui viene aggiunto ogni componente di ottenere risultati riproducibili ogni volta. Filtrazione della ASM è lento, ma è preferibile alla sterilizzazione in autoclave, che può danneggiare il componente mucina. Noi non consigliamo l'aggiunta di antibiotici, come suggerito da altri 11, perché questo può comportare notevoli pressioni selettive, mutazioni di unità, indurre la lisi profago 16 e altera in modo significativo l'espressione di più geni batterici.
- Il dosaggio deve essere ottimizzata in base al volume of ASM utilizzato. Shaking velocità sono aumentati per i minori volumi e di un biofilm più breve ciclo di vita si osserva.
Un'applicazione evidente del modello di piccola scala biofilm ASM è la determinazione più realistica di suscettibilità biofilm BSMIC antimicrobici (90). Nicchie anaerobici e microaerofili sono presenti nel polmone CF e vi sono prove che l'ossigeno è limitata nel profondo del biofilm maturo 2, 17. Qui si dimostra che 10/14 clinica P. aeruginosa isolati da pazienti Sputa CF presentano una notevole (4 - ≥ 128 volte) diminuzione della sensibilità alla tobramicina in condizioni microaerofili in ASM. I risultati di questo studio suggeriscono che antibiotici, come tobramicina, potrebbero essere meno efficaci contro P. aeruginosa nei polmoni CF quelli indicati con i metodi convenzionali test di sensibilità. Questi risultati riflettono gli studi precedenti sulla sensibilità agli antibiotici di biofilm 10. Small-scala saggi ASM quindi fornire una piattaforma semplice, ad alto rendimento per la generazione di significativi dati di sensibilità agli antibiotici per informare meglio le decisioni terapeutiche. Il saggio è limitata nello stesso modo convenzionale test di sensibilità agli antibiotici in singole colonie che vengono prelevati per lo screening che non può essere rappresentativa della popolazione. Tuttavia, riteniamo che un approccio (i) con superficie di crescita non collegato biofilm e (ii) applicabile alle condizioni microaerofili, rappresenta un'alternativa chiara e un potenziale miglioramento dei metodi esistenti. Concludiamo che questo test è un modello adeguato per lo studio P. aeruginosa biofilm popolazioni. Ulteriori test in ambito clinico sarebbe verificare se suscettibilità agli antibiotici basata su biofilm cresciuti P. aeruginosa potrebbe portare a scelte diverse con antibiotici potenzialmente migliori esiti clinici e microbiologici. Indagini simili che utilizzano modelli di biofilm classici hanno dimostrato che i valori BSMIC portarealle raccomandazioni diverse per il trattamento antibiotico 5,17.
Oltre al test per l'efficacia delle agenti anti-infettivi, il sistema ASM rappresenta un buon mercato, un'alternativa semplice e riproducibile per modelli animali per studi come quelli che mirano a comprendere la diversificazione delle P. aeruginosa popolazioni. Abbiamo osservato vasta eterogeneità nelle popolazioni naturali di P. aeruginosa recuperato dal paziente Sputa CF 18, 19. Simile la diversificazione fenotipica e genotipica può essere osservato durante la crescita in ASM 4 (ed i nostri dati non pubblicati), che lo rende un interessante modello in vitro delle condizioni polmonari CF. La relativa semplicità del modello ASM rende facile progettare esperimenti a lungo termine adattamento destinato, ad esempio, a monitorare gli effetti degli antibiotici o altre sollecitazioni su P. aeruginosa popolazione divergenza. Inoltre, altri patogeni batterici possono essere coltivate inASM. Ad esempio, Fouhy et al. ASM 2007 hanno utilizzato per studiare la formazione di biofilm da S. maltophillia 20.
Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Riconosciamo l'appoggio del Regno Unito Istituto Nazionale per la Ricerca sulla Salute, il Dr. Hadwen Trust per la ricerca umanistici, della britannica leader di finanziamento carità di ricerca medica senza animali esclusivamente tecniche di ricerca per sostituire gli esperimenti su animali, e il Wellcome Trust (Grant 089.215). Riconosciamo inoltre Novartis Pharmaceuticals UK Ltd (educazionale di sovvenzione).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA from fish sperm | Sigma-Aldrich | 74782 | |
| Mucin from porcine stomach, type II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| L-Alanine | Acros Organics | 102830250 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | |
| L(+)-Asparagine monohydrate | Acros Organics | 175271000 | |
| L(+)-Aspartic acid | Acros Organics | 105041000 | |
| L-Cysteine | Sigma-Adrich | 168149 | |
| L(+)-Glutamic acid | Acros Organics | 156211000 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| Glycine | Acros Organics | 220911000 | |
| L-Histidine | Sigma-Adrich | H8000 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| L(+)-Lysine monohydrochloride | Acros Organics | 125222500 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| L-Phenylalanine | Acros Organics | 130310250 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| L-Serine | Acros Organics | 132660250 | |
| L-Threonine | Acros Organics | 138930250 | |
| L(-)-Tryptophan | Acros Organics | 140590250 | |
| L-Tyrosine | Acros Organics | 140641000 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500 | |
| Diethylenetriaminepentaacetic acid | Sigma-Aldrich | 32318 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S/3160/60 | |
| KCl | VWR | BDH0258 | |
| KOH | VWR | BDH0262 | |
| Egg yolk emulsion | Sigma-Aldrich | 17148 | |
| ME 2 diaphragm vacuum pump | Vacuubrand | 696126 | |
| Steritop filters (Pore size: 0.22 μm, Neck size: 45 mm) | EMD Millipore | SCGPT10RE | |
| Luria-Bertani medium | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| 96-well microtitre plates | Sarstedt Ltd | 82.1581 | |
| 24-well tissue culture-treated plates | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 3820-024 | |
| CampyGen gas generation packs | Oxford Labware | CN0025 | |
| Microaerophilic chamber | Oxford Labware | HP0011 | |
| Tobramycin sulphate | Sigma-Aldrich | T1783 | |
| Cellulase, from Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | 22178 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | 199303 | |
| Citrate.H20 | VWR | BDH0288 | |
| Fluostar omega microplate reader | BMG-Labtech | SPECTROstar Omega |
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