Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

استخدام متوسط ​​البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة doi: 10.3791/3857 Published: June 5, 2012

Summary

التشخيص الحالية اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات يعتمد على نمو العوالق من العزلات في المغذيات الظروف، غنية الهوائية. هنا، ونحن توظيف بديل المتوسطة البلغم الاصطناعية لدراسة قابلية مضادات الميكروبات من الأغشية الحيوية الزائفة الزنجارية تحت كل الظروف الهوائية وmicroaerophilic أكثر تمثيلا في الرئة التليف الكيسي.

Abstract

هناك قلق متزايد حول أهمية في الفحوص المختبرية قابلية مضادات الميكروبات عند تطبيقها على عزلات من P. الزنجارية من المرضى الكيسي (CF) التليف. الأساليب الحالية تعتمد على واحد أو عدد قليل العزلات نمت هوائيا وplanktonically. وتستخدم سلفا انقطاع لتحديد ما إذا كانت بكتيريا حساسة أو مقاومة للمضادات الحيوية أي يعطى 1. ومع ذلك، أثناء التهابات الرئة المزمنة في قوات التحالف، P. السكان الزنجارية موجودة في الأغشية الحيوية، وهناك أدلة على أن البيئة هي microaerophilic إلى حد كبير 2. ودعت الفرق صارخ في ظروف بين بكتيريا في الرئة، وهؤلاء خلال الاختبارات التشخيصية في مسألة مدى ملاءمة والموثوقية وحتى هذه الاختبارات 3.

اصطناعية المتوسطة البلغم (ASM) هو وسيلة الثقافة التي تحتوي على مكونات من البلغم مريض التليف الكيسي، بما في ذلك الأحماض الأمينية، والميوسين والحمض النووي الحرة. ب. الزنجارية </ م> نمو في نمو يقلد ASM خلال العدوى CF، مع تشكيل هياكل بيوفيلم الذاتي في مجموعها، واختلاف عدد السكان 4،5،6. وكان الهدف من هذه الدراسة لتطوير فحص microtitre لوحة لدراسة قابلية مضادات الميكروبات من P. الزنجارية على أساس النمو في ASM، والتي تنطبق على كل الشروط microaerophilic والهوائية.

وقد وضعت لفحص ASM في شكل لوحة microtitre. P. وسمح الزنجارية الأغشية الحيوية لتطوير لمدة 3 أيام قبل الحضانة مع العوامل المضادة للجراثيم في تركيزات مختلفة لمدة 24 ساعة. بعد انقطاع بيوفيلم، وقد تم قياس بقاء الخلية بواسطة تلطيخ مع ريسازورين. وقد استخدم هذا الاختبار للتأكد من الحد الأدنى خلية تركيز المثبطة لاطئة (SMIC) من توبراميسين لمدة 15 P. مختلفة وتمت مقارنة عزلات الزنجارية في ظل ظروف جوية وmicroaerophilic والقيم SMIC لتلك التي حصلت مع مرق نمو قياسية. في حين كان هناكوبعض الأدلة على القيم هيئة التصنيع العسكري المتزايد للعزلة التي تزرع في ASM بالمقارنة مع نظرائهم من العوالق، وجدت اكبر الخلافات مع بكتيريا اختبارها في ظروف microaerophilic، الذي أظهر مقاومة كبيرة ليصل إلى أضعاف 128>، نحو توبراميسين في النظام عندما ASM بالمقارنة مع فحوصات أجريت في ظروف هوائية.

وشكك في عدم وجود ارتباط بين الأساليب الحالية اختبارات الحساسية والنتائج السريرية من صحة الأساليب الحالية 3. وقد استخدمت عدة نماذج في المختبر من قبل لدراسة P. الأغشية الحيوية الزنجارية 7 و 8. ومع ذلك، هذه الأساليب تعتمد على الأغشية الحيوية سطح المرفقة، في حين أن الأغشية الحيوية ASM تشبه تلك التي لوحظت في الرئة CF 9. وبالإضافة إلى ذلك، وقد تبين انخفاض تركيز الأكسجين في مخاط لتغيير سلوك P. الزنجارية (2) وتؤثر على قابلية المضادات الحيوية 10. النقيب ولقد ز ASM في ظل ظروف microaerophilic توفير بيئة أكثر واقعية للدراسة حساسية الجراثيم للأدوية.

Protocol

1. إعداد متوسطة البلغم الاصطناعي (ASM)

  1. إضافة 4 غرام من الحمض النووي من الحيوانات المنوية السمك في الماء 250 مل العقيمة ببطء شديد على مدى عدة ساعات. الحمض النووي تستغرق عدة ساعات إلى حل تماما، ويمكن أن يحرك بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  2. إضافة 5 الميوسين ز من معدة الخنزير (النوع الثاني) ببطء إلى 250 مل من الماء المعقم حتى الميوسين قد حلت تماما. يمكن أن يحرك حل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  3. حل 0،25 غرام من كل الأحماض الأمينية الأساسية L-وغير الضرورية، مع استثناء من التيروزين-L و L-السيستين، في 100 مل ماء معقم. حل 0،25 غرام من السيستين-L في 25 مل من هيدروكسيد البوتاسيوم 0.5 M (M ص ز / مول 56.11) و 0.25 غرام من التيروزين-L في ماء معقم 25 مل.
  4. حل 5،9 ملغ حامض diethylenetriaminepentaacetic (DTPA)، و 5 غ من كلوريد الصوديوم وز 2.2 من بوكل في 100 مل من الماء المعقم.
  5. الجمع بين الحمض النووي، والميوسين والأحماض الأمينية L-، DTPA، كلوريد الصوديوم وبوكل في زجاجة 1 لتر.
  6. أضف 5 مل من صفار البيض هmulsion والتعبئة إلى حوالي 850 مل مع الماء المعقم.
  7. ضبط درجة الحموضة إلى 6.9 مع تريس M 1 (درجة الحموضة 8.5؛ م ص 121.14)، وتحقيق وحدة التخزين إلى 1 ليتر مع الماء المعقم.
  8. تعقيم ASM عن طريق الترشيح باستخدام Vacuubrand لي 2 مضخة فراغ الحجاب الحاجز وحدات ميليبور Steritop فلتر مع حجم المسام والعنق من 0.22 ميكرون و 45 ملم على التوالي. ويمكن لكل وحدة تصفية Steritop إعادة استخدامها على الفور ما يصل إلى ثلاثة أضعاف، إلا أن المرشحات بحاجة الى تشطف مرتين مع الماء المعقم قبل إعادة استخدامها. عملية الترشيح بطيء ويمكن أن يؤديها أكثر من 2 أيام. وقد تم تطوير إصدارات أخرى من ASM التي تستخدم بالإضافة إلى ذلك من المضادات الحيوية بدلا من ترشيح 11 ولكن نظرا لتفاعلات العقاقير ممكن، ونحن لا ننصح هذا الأسلوب لتطبيق معين.
  9. يجب أن يتم تخزينها دون تدخل وتصفيتها ASM في 4 درجات مئوية في الظلام. استخدام ASM الطازجة ويوصى مع ذلك، يمكن الاحتفاظ به في ظل هذه الظروف لمدة أقصاها شهر واحد.

    2. تحديد الحد الأدنى العوالق خلية مثبت مباشرة بالقاعدة تركيز المثبطة الأيض (PSMIC)

    1. لتحديد الحد الأدنى من تركيز المثبطة الأيض (PSMIC) القيم لمدة 15 P. نمت planktonically العزلات الزنجارية، ينبغي أن يقوم على طريقة microdilution، على النحو المبين في المبادئ التوجيهية للجمعية البريطانية لBSAC العلاج الكيماوي مضادات الميكروبات 12. المضادات الحيوية من خيار، في هذه الحالة كبريتات توبراميسين، يتم تخفيف متسلسل في لوريا، Bertani (LB) المتوسطة الحجم في لوحة 96-microtitre جيد لتقديم مجموعة مناسبة من تركيزات المضادات الحيوية.
    2. تمييع الثقافات بين عشية وضحاها من P. الزنجارية في LB إلى 600 من OD 0.05 (± 0.01) وإضافة 100 مجلدا ميكروليتر إلى آبار لوحة microtitre 96-جيد يحتوي على 100 ​​ميكرولتر من المضادات الحيوية تضعف متسلسل. في هذه الحالة، وتراوحت التركيزات النهائية للكبريتات توبراميسين بين 512 حتي 0،5 ميكروغرام / مل. ثمانية مكررات من كل antibينبغي أن يقوم تركيز iotic.
    3. يجب تعيين آبار مراقبة سلبية على كل ما يصل عزل، حيث يتم إضافة أي مضاد حيوي. أيضا، يجب أن تحتوي على ثمانية آبار LB فقط لاستخدامها بوصفها فارغة خلال تحليل المصب (القسم 2.6).
    4. احتضان لوحات 96-microtitre جيدا لمدة 1 - 2 أيام في 37 درجة مئوية دون أن تهتز في ظل ظروف جوية أو microaerophilic (5٪ O و 10٪ CO و 85٪ N 2). ويتم الحصول على شروط Microaerophilic باستخدام حزم CampyGen توليد الغاز في الجرار اللاهوائية كبير.
    5. بعد الحضانة، ويتم تحديد نمو البكتيريا عن طريق قياس الامتصاصية للثقافة البكتيرية في كل بئر في الطول الموجي 600 نانومتر باستخدام أوميغا Fluostar microplate قارئ وتحليل بيانات برامج المريخ.
    6. ينبغي تصحيح امتصاص من ثقافات العوالق المضادات الحيوية المعالجة (مضاد حيوي خلايا العوالق المعالجة) والامتصاص من الضوابط سلبي (A سيطرة السلبية) التي طرحايون لامتصاص خلفية تم الحصول عليها من الآبار التي تحتوي على LB فقط (فارغ). ويحسب لاحقا إلى تثبيط النسبة المئوية للبقاء كما (يعني مضاد حيوي خلايا العوالق المعالجة / يعني سيطرة سلبية) 100٪ س. يتم تعريف PSMIC 90 وتركيز المضادات الحيوية تسبب تثبيط 90٪ من نمو العوالق البكتيرية.
    7. لتحديد الجدوى الجرثومية بعد العلاج مع المضادات الحيوية من خيار، و 10 ميكرولتر من 0.02٪ (V / V) يضاف ريسازورين (المخفف في الماء المقطر) إلى كل جيدا ويتم تحضين لوحات تحت الظروف الهوائية لمدة 1 - 2 في ساعة 37 درجة سي، في حين تهتز عند 150 دورة في الدقيقة. وخلايا قابلة للحياة تقلل من صبغة زرقاء ريسازورين إلى النموذج resorufin فلوري وردي.
    8. بعد حضانة مع ريسازورين، ورصد مضان من كل بئر باستخدام الطول الموجي الإثارة من 540 نيوتن متر، وطول موجة من الانبعاثات من 590 نانومتر في القارئ Fluostar microplate أوميغا. وينبغي تحليل البيانات كما هو موضح يكونمنخفض.

    3. تقرير من تركيز بيوفيلم خلية مثبت مباشرة بالقاعدة المثبطة الدنيا (BSMIC)

    1. بين عشية وضحاها ثقافات P. يجب تخفيفه الزنجارية (في هذه الحالة، يتم استخدام 15 عزلات من الزنجارية P.) في LB إلى 600 من OD 0.05 (± 0.01)، ثم 1:100 المخفف في مزيد من ASM الطازجة (إجمالي حجم 1.8 مل).
    2. ينبغي أن يضاف الثقافات المخفف (1.8 مل) إلى كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة 24-جيدا المعالجة. وينبغي أن تحتوي على ثلاثة آبار ASM فقط لاستخدامها بوصفها فارغة خلال تحليل المصب (القسم 3.9).
    3. تأمين 24 لوحات بشكل جيد مع parafilm المختبرات والحضانة لمدة 3 أيام في ظل ظروف جوية أو microaerophilic على 37 درجة مئوية، في حين تهتز في 75 دورة في الدقيقة. وينبغي الحصول على شروط Microaerophilic باستخدام CampyGen حزم توليد الغاز في الجرار اللاهوائية كبير.
    4. تمييع للمضادات الحيوية في الاختيار، في هذه الحالة كبريتات توبراميسين، لتوفير مجموعة وتركيز مناسب في الطازجASM. في هذه الحالة، وتراوحت تركيزات النهائي بين 512-1 ميكروغرام / مل. إضافة كل تركيز من المضادات الحيوية، في وحدات التخزين من 200 ميكرولتر، إلى الآبار الملائمة لوحات 24 أيضا. أربع مكررات لكل تركيز المضادات الحيوية يجب أن يؤديها. واستخدمت الأغشية الحيوية لم تتعرض للمضادات الحيوية من خيار كوسيلة لمراقبة سلبية.
    5. تأمين 24 لوحات بشكل جيد مع parafilm مختبر واحتضانها في ظل ظروف جوية أو microaerophilic عن 24 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية، في حين تهتز في 75 دورة في الدقيقة.
    6. بعد حضانة في وجود المضادات الحيوية في الاختيار، تعطيل الأغشية الحيوية البكتيرية باستخدام 100 ميكرولتر من 100 ملغ / مل سلولاز (المخفف في 0.05 العازلة سترات M [9.6 غرام / لتر Citrate.H 2 0 في الماء ودرجة الحموضة إلى 4.6 مع هيدروكسيد الصوديوم] )، واحتضان لوحات 24-جيدا في ظل ظروف جوية على 37 درجة مئوية، في حين تهتز عند 150 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة. إذا لزم الأمر، يمكن أن الأغشية الحيوية عطلت المزيد من pipetting دليل في هذه المرحلة.
    7. لتحديد الأنشطة الأيضيةمن الخلايا البكتيرية التي صدرت من الأغشية الحيوية تعطلت، وينبغي أن 100 ميكرولتر من 0.02٪ (V / V) تضاف ريسازورين (المخفف في الماء المقطر) إلى كل بئر من لوحات 24 جيدا وحضنت لمدة 1 - 2 في ساعة 37 درجة مئوية ، في حين تهتز عند 150 دورة في الدقيقة.
    8. بعد حضانة مع ريسازورين، قياس مضان من كل بئر باستخدام الطول الموجي الإثارة من 540 نيوتن متر، وطول موجة من الانبعاثات من 590 نانومتر في القارئ Fluostar microplate أوميغا وتحليل بيانات برامج المريخ.
    9. ينبغي تصحيح مضان من الأغشية الحيوية المضادات الحيوية المعالجة (F المعالجة بالمضادات الحيوية الأغشية الحيوية)، ومضان من الضوابط السلبية (F سيطرة سلبية) من قبل الطرح للمضان الخلفية التي تم الحصول عليها من الآبار التي تحتوي على ASM فقط (F فارغة). ويحسب لاحقا إلى تثبيط النسبة المئوية للبقاء كما (يعني من الأغشية الحيوية المضادات الحيوية تعالج F / F يعني سيطرة سلبية) 100٪ س. وتعرف ال 90 BSMIC كما antibioعرة تركيز مما تسبب تثبيط 90٪ من النشاط الأيضي.

    4. ممثل النتائج

    ASM تشكيل بيوفيلم هو ممكن في مجلدات (2 مل) صغيرة ويتم تشكيلها بشكل كامل الأغشية الحيوية في غضون 3 أيام (الشكل 1A). يمكن البرهنة عن طريق pipetting بدقة بيوفيلم، الذي ينبغي أن يكون من الصعب تعطيل. وmicrocolonies هي مماثلة لتلك التي تزرع في كميات أكبر 4 (الشكل 1B). ويبين الشكل 2 اختلافات كبيرة بين الخلايا المزروعة وplanktonically في بيوفيلم كما الكشف عنها بواسطة الإلكترون تحليل الصور المجهرية. الثقافات بيوفيلم تبين بوضوح مستويات كبيرة من المصفوفة خارج الخلية المحيطة الخلايا والهياكل الفردية داخل بيوفيلم يصعب التعرف عليها.

    العديد من الدراسات تشير إلى أن نمط الحياة يمكن أن تؤثر على قابلية بيوفيلم مضادات الميكروبات 13 و 14. ويمكن استخدام بلدنا الصغير فحص ASM النطاق لdetermine في BSMIC من المضادات الحيوية متعددة للعزلة متعددة في نفس الوقت. ويرد على سير العمل في الفحص في الشكل 3. ويمكن قياس تأثير المضادات الحيوية على بقاء الخلية البكتيرية باستخدام مقايسة ريسازورين. المضادات الحيوية، في هذه الحالة يمكن توبراميسين، يمكن ان تضاف الى بيوفيلم المنشأة وحضنت لمدة 24 ساعة. بعد أن يتم تعطيل هذا بيوفيلم ويضاف ريسازورين.

    يمكن للخلايا نشطة أيضي لحد من صبغ ريسازورين مما أدى إلى تغير لونها من اللون الأزرق (ريسازورين) إلى وردي (resorufin) 15. الشكل 4A يظهر فحص سبيل المثال، في الذي P. وقد حضنت الزنجارية مع تركيزات مختلفة من توبراميسين قبل انقطاع بيوفيلم وإضافة ريسازورين في لوحة microtitre. الأزرق غير فلوري اللون يشير إلى غير قابل للحياة الخلايا، في حين أن خلايا قابلة للحياة تقلل من الصبغة على شكل فلوري وردي، resorufin. ويمكن بعد ذلك SMIC تحسب عن طريق تحويل النسبة المئوية إلى مضانالباقية بقاء البكتيرية. الشكل 4B يظهر التغيير في جدوى٪ مع تركيز توبراميسين متزايد. وقد تم اختيار البقاء بنسبة 10٪ كما وقف انتاج المواد الانشطارية لحساب ال 90 SMIC.

    في ظل ظروف جوية، وSMIC توبراميسين 90 قيم أعلى للخلايا نمت باعتبارها بيوفيلم من تلك الثقافات من العوالق. ويبين الجدول 1 اختلاف في PSMIC 90 و BSMIC 90 لجميع العزلات المختبرة. ويبين الجدول 2 أنه في ظل الظروف الهوائية، لوحظ وجود زيادة كبيرة في مقاومة توبراميسين (2 إلى زيادة 32> أضعاف في SMIC) بالنسبة لمعظم العزلات عندما نمت في ASM (بيوفيلم واسطة) مقارنة LB (الوضع العوالق). وبالإضافة إلى ذلك، عرضت الأغشية الحيوية نما في ظل ظروف microaerophilic 1 SMIC زيادة تتراوح بين 2 و> 128 أضعاف بالمقارنة مع الأغشية الحيوية نما في ظل ظروف جوية.

    الشكل 1
    الرقم1. تشكيل بيوفيلم من الزائفة الزنجارية في P. ASM سلالة الزنجارية PAO1 تشكل كتلا مرئية ظاهريا (microcolonies) عندما تزرع في ASM. وتشكيل بيوفيلم، في الثقافات ASM 30 مل (على نطاق واسع) بعد نمو 7 ايام في زجاج المسمار قبعة دوران B. القوارير، تشكيل بيوفيلم في الثقافات 2 مل ASM ( على نطاق صغير) بعد نمو 3 أيام في لوحات البوليسترين 24 أيضا.

    الشكل 2
    الشكل 2. الميكروسكوب تيم من الأغشية الحيوية ASM A / C تيم مجهرية (خ. 27000) من PAO1 نمت وplanktonically في ASM، على التوالي، B / D تيم مجهرية (x57، 000) من العوالق وPAO1grown في ASM على التوالي،. تم الانتهاء من زراعة البكتيريا نما Planktonically بين عشية وضحاها في مرق LB. تم الانتهاء من زراعة الأغشية الحيوية لمدة 7 أيام في الثقافات ASM 30 مل. السهام السوداء تشير إلى خلايا داخل بيوفيلم والنجوم تشير إلى مساحات خارج الخلية. الحانات نطاق = 1ميكرون.

    الشكل (3)
    الشكل 3. سير العمل لفحص بيوفيلم حساسية الميكروبات ASM.

    الشكل 4
    الشكل 4. استخدام ريسازورين لتحديد قابلية للمضادات الحيوية وحضنت الخلايا البكتيرية مع تركيزات مختلفة من المضادات الحيوية وكان مصمما على النشاط الأيضي المتبقية باستخدام ريسازورين ألف، واللون الأزرق غير فلوري شكل المؤكسد من ريسازورين يشير إلى غير قابل للحياة الخلايا ويتم تخفيض بواسطة التمثيل الغذائي خلايا نشطة لوردي فلوري B. resorufin، يتم تحويل كثافة الإسفار في النسبة المئوية للبقاء البكتيريا المتبقية. وقد تم اختيار البقاء بنسبة 10٪ كما وقف انتاج المواد الانشطارية من أجل حساب MSMIC90. انقر هنا لعرض لارGER شخصية.

    سلالات PSMIC 90 (ميكروغرام / مل) 1 BSMIC 90 (ميكروغرام / مل) 1
    الهوائية Microaerophilic 2 الهوائية Microaerophilic 2
    PAO1 4 4 8 > 512
    ليفربول وباء سلالة (ليه) يعزل
    LESB58 21 8 64 64 128
    LES400 22 32 128 8 256
    LESB25 16 32 256 512
    LESB55 16 64 64 > 512
    LESB64 16 64 > 512 > 512
    LES431 22 4 8 32 > 512
    LESB49 16 64 64 256
    LES109 32 128 32 > 512
    غير ليه عزلات
    49461 16 32 16 > 512
    59032 0.5 2 4 > 512
    59073 > 512 > 512 > 512 > 512
    59076 16 32 32 > 512 </ TD>
    27 8 16 4 > 512
    45 16 32 4 > 512

    الجدول رقم 1. قابلية الزائفة الزنجارية إلى توبراميسين.

    وقد استخدم (1) لتحديد PSMICs وتوبراميسين BSMICs في 2 أضعاف التخفيفات المسلسل
    تتراوح بين 512 حتي 0،5 ميكروغرام / مل (ن = 8 لكل تركيز) و 512-1 ميكروغرام / مل (ن = 4 لكل
    تركيز)، على التوالي؛؛ تم تحديد PSMICs باستخدام معيار
    طريقة microdilution 1.

    وكانت الظروف Microaerophilic 2 5 O 2٪، 10٪ CO و 85٪ N 2.

    توتر PSMIC 90/90 BSMIC التغيير أضعاف 1
    PSMIC الهوائية
    PSMIC microaerophilic
    BSMIC الهوائية
    BSMIC microaerophilic
    PSMIC الهوائية
    BSMIC الهوائية
    PSMIC microaerophilic
    BSMIC microaerophilic
    PAO1 0 > 64 2 128
    ليه يعزل
    LESB58 8 2 8 2
    LES400 4 32 0.25 2
    LESB25 2 2 16 16
    LESB55 4 > 8 4 > 8
    LESB64 4 ND > 32 > 8
    LES431 2 > 16 8 > 64
    LESB49 4 4 4 4
    LES109 4 16 0 > 4
    غير ليه عزلات
    49461 2 > 32 0 > 16
    59032 4 > 128 8 > 256
    59073 ND ND ND ND
    59076 2 > 16 2 > 16
    27 2 > 128 0.5 > 32
    45 2 > 128 0.25 > 16

    الجدول 2. التغيير حظيرة PSMICs وBSMICs إلى توبراميسين.

    1 ND، لم تحدد، والقيم في جريئة توضح التغييرات أضعاف SMIC> 10.

Discussion

في هذه الدراسة استخدمنا رواية في المختبر على أساس نموذج ASM لتكرار P. شروط بيوفيلم الزنجارية في 4 الرئة CF. تم تعديل نموذج ناجح لصغار التجارب الإنتاجية العالية، من العوامل المضادة للجراثيم.

الخطوات الحاسمة لهذا الفحص هي:

  1. يتفق إعداد وسائل الإعلام ASM والعقم الحفاظ. لقد كرسنا ساعات طويلة لتحقيق الاستفادة المثلى من الطريقة التي يتم إضافة كل مكون من أجل تحقيق نتائج استنساخه في كل مرة. في ترشيح ASM بطيء ولكن من الأفضل جهاز الأوتوكليف، والتي قد تؤدي إلى تلف عنصر الميوسين. نحن لا ننصح بإضافة المضادات الحيوية، وعلى النحو الذي اقترحه 11 آخرين لأن ذلك قد فرض ضغوطا كبيرة انتقائي، والطفرات محرك، حث تحلل طليعة العاثية 16 و تغيير كبير في التعبير عن الجينات البكتيرية متعددة.
  2. وينبغي أن يكون الأمثل للفحص وفقا لحجم سو تستخدم ASM. وزادت سرعة اهتزاز لأصغر وحدات التخزين ولكن لوحظ أنه أقصر بيوفيلم دورة الحياة.

تطبيق واضح لنموذج صغير الحجم بيوفيلم ASM هو تحديد أكثر واقعية من حساسيات بيوفيلم المضادة للجراثيم (BSMIC 90). محاريب اللاهوائية وmicroaerophilic موجودة في الرئة CF وهناك أدلة على أن يقتصر الأوكسجين في أعماق الأغشية الحيوية ناضجة 2 و 17. هنا علينا أن نبرهن على 10/14 P. السريرية العزلات الزنجارية من CF المريض sputa يحمل كبير (4 - ≥ 128 أضعاف) انخفاض في الحساسية للتوبراميسين في ظل ظروف microaerophilic في ASM. نتائج هذه الدراسة تشير إلى أن المضادات الحيوية، مثل توبراميسين، قد يكون أقل فعالية ضد P. التهابات في الرئة الزنجارية CF مما تشير إليه الأساليب التقليدية اختبار الحساسية. وتعكس هذه النتائج دراسات سابقة على حساسية الجراثيم للأدوية من الأغشية الحيوية 10. الصغيرةالمقايسات ASM نطاق بالتالي لا تقدم بسيط منصة إنتاجية عالية لتوليد بيانات ذات مغزى حساسية للمضادات الحيوية لإبلاغ قرارات أفضل العلاجية. ويقتصر الفحص بنفس الطريقة التقليدية مثل اختبارات الحساسية للمضادات الحيوية في تلك المستعمرات واحدة يتم انتقاؤها للفحص والتي قد لا تكون ممثلة لجميع السكان. ومع ذلك، فإننا نعتقد أن هذا النهج (ط) باستخدام غير سطح نمو بيوفيلم المرفقة و (ب) تنطبق على ظروف microaerophilic، يمثل بديلا واضحا، وتحسين القدرة على الطرق الحالية. نخلص إلى أن هذا الاختبار هو نموذج مناسب لدراسة P. السكان الزنجارية بيوفيلم. وإجراء مزيد من التجارب السريرية في التأكد مما إذا كانت حساسيات المضادات الحيوية على أساس بيوفيلم، نمت P. ويمكن أن يؤدي إلى الزنجارية الخيارات للمضادات الحيوية المختلفة مع تحسن النتائج المحتملة الميكروبيولوجية والسريرية. وأظهرت تحقيقات مماثلة باستخدام نماذج بيوفيلم القيم الكلاسيكية التي تؤدي BSMICإلى توصيات مختلفة لتلقي العلاج بالمضادات الحيوية 5،17.

بالإضافة إلى اختبار لمدى فعالية المضادة للعدوى وكلاء، ونظام ASM يمثل رخيصة، والبديل بسيطة وقابلة للتكرار لنماذج حيوانية للدراسات مثل تلك التي تهدف إلى فهم تنوع P. الزنجارية السكان. لاحظنا عدم التجانس واسعة في مجال السكان الطبيعي من P. الزنجارية تعافى من CF المريض sputa 18 و 19. ويمكن ملاحظة مماثلة تنويع المظهري والوراثي في النمو خلال ASM 4 (والبيانات المتوفرة لدينا غير منشورة)، مما يجعلها جذابة في نموذج المختبر من الشروط الرئة CF. البساطة النسبية للنموذج ASM يجعل من السهل تصميم تجارب التكيف على المدى الطويل تهدف، على سبيل المثال، في رصد آثار من المضادات الحيوية أو غيرها من الضغوط على بي. الزنجارية اختلاف عدد السكان. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تزرع مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى فيASM. على سبيل المثال، Fouhy وآخرون استخدموا 2007 ASM لدراسة تشكيل بيوفيلم من قبل س. maltophillia 20.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نحن نعترف بدعم من المعهد الوطني للمملكة المتحدة لبحوث الصحة، والدكتور Hadwen الثقة للبحوث الإنسانية، الرائدة في المملكة المتحدة خيرية للابحاث الطبية تمويل التقنيات حصرا البحوث غير الحيوانية لتحل محل التجارب على الحيوانات، ويلكوم ترست (جرانت 089215). نعترف أيضا شركة نوفارتيس للادوية المحدودة في المملكة المتحدة (منحة تربوية غير المقيد).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA from fish sperm Sigma-Aldrich 74782
Mucin from porcine stomach, type II Sigma-Aldrich M2378
L-Alanine Acros Organics 102830250
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006
L(+)-Asparagine monohydrate Acros Organics 175271000
L(+)-Aspartic acid Acros Organics 105041000
L-Cysteine Sigma-Adrich 168149
L(+)-Glutamic acid Acros Organics 156211000
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126
Glycine Acros Organics 220911000
L-Histidine Sigma-Adrich H8000
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000
L(+)-Lysine monohydrochloride Acros Organics 125222500
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625
L-Phenylalanine Acros Organics 130310250
L-Proline Sigma-Aldrich P0380
L-Serine Acros Organics 132660250
L-Threonine Acros Organics 138930250
L(-)-Tryptophan Acros Organics 140590250
L-Tyrosine Acros Organics 140641000
L-Valine Sigma-Aldrich V0500
Diethylenetriaminepentaacetic acid Sigma-Aldrich 32318
NaCl Fisher Scientific S/3160/60
KCl VWR BDH0258
KOH VWR BDH0262
Egg yolk emulsion Sigma-Aldrich 17148
ME 2 diaphragm vacuum pump Vacuubrand 696126
Steritop filters (Pore size: 0.22 μm, Neck size: 45 mm) EMD Millipore SCGPT10RE
Luria-Bertani medium Sigma-Aldrich L2897
96-well microtitre plates Sarstedt Ltd 82.1581
24-well tissue culture-treated plates Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. 3820-024
CampyGen gas generation packs Oxford Labware CN0025
Microaerophilic chamber Oxford Labware HP0011
Tobramycin sulphate Sigma-Aldrich T1783
Cellulase, from Aspergillus niger Sigma-Aldrich 22178
Resazurin Sigma-Aldrich 199303
Citrate.H20 VWR BDH0288
Fluostar omega microplate reader BMG-Labtech SPECTROstar Omega

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Andrews, J. M. BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8). J. Antimicrob. Chemother. 64, 454-489 (2009).
  2. Worlitzsch, D. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J. Clin. Invest. 109, 317-325 (2002).
  3. Smith, A. L., Fiel, S. B., Mayer-Hamblett, N., Ramsey, B., Burns, J. L. Susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa isolates and clinical response to parenteral antibiotic administration: lack of association in cystic fibrosis. Chest. 123, 1495-1502 (2003).
  4. Sriramulu, D. D., Lunsdorf, H., Lam, J. S., Romling, U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J. Med. Microbiol. 54, 667-676 (2005).
  5. Garbe, J. Characterization of JG024, a pseudomonas aeruginosa PB1-like broad host range phage under simulated infection conditions. BMC Microbiol. 10, 301 (2010).
  6. Naughton, S. Pseudomonas aeruginosa AES-1 exhibits increased virulence gene expression during chronic infection of cystic fibrosis lung. PLoS One. 6, e24526 (2011).
  7. Moskowitz, S. M., Foster, J. M., Emerson, J. C., Gibson, R. L., Burns, J. L. Use of Pseudomonas biofilm susceptibilities to assign simulated antibiotic regimens for cystic fibrosis airway infection. J. Antimicrob. Chemother. 56, 879-886 (2005).
  8. Field, T. R., White, A., Elborn, J. S., Tunney, M. M. Effect of oxygen limitation on the in vitro antimicrobial susceptibility of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa grown planktonically and as biofilms. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 24, 677-687 (2005).
  9. Bjarnsholt, T. Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients. Pediatr. Pulmonol. 44, 547-558 (2009).
  10. Hill, D. Antibiotic susceptibilities of Pseudomonas aeruginosa isolates derived from patients with cystic fibrosis under aerobic, anaerobic, and biofilm conditions. J. Clin. Microbiol. 43, 5085-5090 (2005).
  11. Fung, C. Gene expression of Pseudomonas aeruginosa in a mucin-containing synthetic growth medium mimicking cystic fibrosis lung sputum. J. Med. Microbiol. 59, 1089-1100 (2010).
  12. Andrews, J. M. BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8). The Journal of antimicrobial chemotherapy. 64, 454-489 (2009).
  13. Rybtke, M. T. The implication of Pseudomonas aeruginosa biofilms in infections. Inflamm Allergy Drug Targets. 10, 141-157 (2011).
  14. Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm. Pharmacol. Ther. 21, 595-599 (2008).
  15. Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. J. Immunol. Methods. 170, 211-224 (1994).
  16. Fothergill, J. L. Effect of antibiotic treatment on bacteriophage production by a cystic fibrosis epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 426-428 (2011).
  17. Singh, P. K. Quorum-sensing signals indicate that cystic fibrosis lungs are infected with bacterial biofilms. Nature. 407, 762-764 (2000).
  18. Mowat, E. Pseudomonas Aeruginosa Population Diversity and Turnover in Cystic Fibrosis Chronic Infections. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. (2011).
  19. Fothergill, J. L., Mowat, E., Ledson, M. J., Walshaw, M. J., Winstanley, C. Fluctuations in phenotypes and genotypes within populations of Pseudomonas aeruginosa in the cystic fibrosis lung during pulmonary exacerbations. J. Med. Microbiol. 59, 472-481 (2010).
  20. Fouhy, Y. Diffusible signal factor-dependent cell-cell signaling and virulence in the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia. J. Bacteriol. 189, 4964-4968 (2007).
  21. Winstanley, C. Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa. Genome Res. 19, 12-23 (2009).
  22. Carter, M. E. A subtype of a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis epidemic strain exhibits enhanced virulence in a murine model of acute respiratory infection. J. Infect. Dis. 202, 935-942 (2010).
استخدام متوسط ​​البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في شروط أكثر ملاءمة لالرئة التليف الكيسي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirchner, S., Fothergill, J. L., Wright, E. A., James, C. E., Mowat, E., Winstanley, C. Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung. J. Vis. Exp. (64), e3857, doi:10.3791/3857 (2012).More

Kirchner, S., Fothergill, J. L., Wright, E. A., James, C. E., Mowat, E., Winstanley, C. Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung. J. Vis. Exp. (64), e3857, doi:10.3791/3857 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter