Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Het gebruik van kunstmatige Sputum Middelgrote tot antibiotica werkzaamheid te testen tegen doi: 10.3791/3857 Published: June 5, 2012

Summary

De huidige diagnostische antimicrobiële gevoeligheid testen is gebaseerd op de groei van plankton isolaten in voedselrijk, aërobe omstandigheden. Hier maken we gebruik van een alternatieve kunstmatige sputum medium om antimicrobiële gevoeligheid van Pseudomonas aeruginosa biofilms te bestuderen onder zowel aërobe en Microaërofiele voorwaarden meer representatief zijn voor de cystic fibrosis long.

Abstract

Er is een groeiende bezorgdheid over de relevantie van in vitro antimicrobiële gevoeligheid testen wanneer toegepast op isolaten van P. aeruginosa bij cystic fibrosis (CF) patiënten. Bestaande methoden rekenen op enkele of een paar isolaten aëroob en planktonically gegroeid. Vooraf bepaalde cut-offs worden gebruikt om te bepalen of de bacteriën gevoelig zijn voor of tegen een bepaald antibioticum 1. Echter, tijdens chronische longinfecties bij CF, P. aeruginosa populaties bestaan ​​in biofilms en er is bewijs dat de omgeving voor een groot deel Microaërofiele 2. Het grote verschil in voorwaarden tussen bacteriën in de longen en die tijdens het diagnostisch onderzoek is in twijfel getrokken de betrouwbaarheid en ook de relevantie van deze tests 3.

Kunstmatige sputum medium (ASM) is een kweekmedium dat de componenten van de CF-patiënt sputum, zoals aminozuren, mucine en gratis DNA. P. aeruginosa </ Em> de groei in ASM mimiek groei in CF-infecties, met de vorming van zelf-aggregatie van biofilm structuren en de bevolking divergentie 4,5,6. Het doel van deze studie was om een microtiterplaat-plate assay voor antimicrobiële resistentie van P. te bestuderen ontwikkelen aeruginosa gebaseerd op groei in ASM, die van toepassing is zowel Microaërofiele en aërobe omstandigheden.

Een ASM-test werd ontwikkeld in een microtiterplaat formaat. P. aeruginosa biofilms mochten ontwikkelen 3 dagen incubatie met antimicrobiële agentia op verschillende concentraties 24 uur. Na de biofilm verstoring, werd levensvatbaarheid van de cellen gemeten door kleuring met resazurin. Deze test werd gebruikt om de vastzittende cel minimale remmende concentratie (SMIC) van tobramycine vast te stellen voor 15 verschillende P. aeruginosa isolaten onder aërobe en Microaërofiele voorwaarden en SMIC waarden werden vergeleken met die verkregen met standaard bouillon groei. Hoewel erenig bewijs voor een hogere MIC-waarden voor isolaten gekweekt in ASM in vergelijking met hun planktonische tegenhangers, werden de grootste verschillen gevonden met bacteriën getest in Microaërofiele voorwaarden, die een veel grotere weerstand toonde aan tot een> 128 maal, in de richting tobramycine in de ASM-systeem bij het opzichte assays in aërobe omstandigheden plaatsvinden.

Het gebrek aan samenhang tussen de huidige gevoeligheid testmethoden en de klinische uitkomst heeft vraagtekens gezet bij de validiteit van de huidige methoden 3. Verschillende in vitro modellen eerder gebruikt P. bestuderen aeruginosa biofilms 7, 8. Echter, deze methoden vertrouwen op het oppervlak van bijgevoegde biofilms, terwijl de ASM biofilms lijken op die waargenomen in de CF long 9. Bovendien is verminderd zuurstofconcentratie in het slijm is weergegeven het gedrag van P. veranderen aeruginosa 2 invloed antibiotica gevoeligheid 10. Daarom using ASM onder Microaërofiele omstandigheden kunnen zorgen voor een meer realistische omgeving om in te antimicrobiële gevoeligheid te bestuderen.

Protocol

1. Voorbereiding van Kunstmatige Sputum Medium (ASM)

  1. Voeg 4 g DNA van vis sperma 250 ml steriel water langzaam over een periode van verschillende uren. De DNA duurt verscheidene uren volledig oplossen en onmiddellijk kan worden bij kamertemperatuur geroerd.
  2. Voeg 5 g mucine van varkens maag (type II) langzaam naar 250 ml steriel water tot de mucine volledig is opgelost. De oplossing kan een nacht te roeren bij 4 ° C.
  3. Los 0,25 g per essentiële en niet-essentiële L-aminozuur, met uitzondering van L-tyrosine en L-cysteïne, in 100 ml steriel water. Los 0,25 g L-cysteïne in 25 ml 0,5 M kaliumhydroxide (M r 56,11 g / mol) en 0,25 g L-tyrosine in 25 ml steriel water.
  4. Los 5,9 mg diethyleentriaminepenta-azijnzuur (DTPA), 5 g NaCl en 2,2 g KCl in 100 ml steriel water.
  5. Meng de DNA mucine, L-aminozuren, DTPA, NaCl en KCl in een fles van 1 liter.
  6. Voeg 5 ml eigeel emulsion en vullen tot ongeveer 850 ml met steriel water.
  7. Pas de pH tot 6,9 met 1 M Tris (pH 8,5; M r 121,14) toe en breng het volume op 1 liter met steriel water.
  8. Steriliseer de ASM door middel van filtratie met behulp van een Vacuubrand ME 2 membraan vacuümpomp en Millipore Steritop filter units met een porie en nek afmeting van 0,22 pm en 45 mm, respectievelijk. Elke Steritop filter unit kan onmiddellijk worden hergebruikt tot drie keer, maar de filters moeten twee keer worden gespoeld met steriel water voor hergebruik. Het filtratieproces is langzaam en kan worden uitgevoerd gedurende 2 dagen. Andere versies van ASM ontwikkeld die gebruik maken van de toevoeging van antibiotica in plaats van filtratie 11 echter, als gevolg van mogelijke interacties tussen geneesmiddelen, raden wij de methode voor deze specifieke toepassing.
  9. Ongefilterde en gefiltreerd ASM worden bewaard bij 4 ° C in het donker. Het gebruik van vers ASM wordt echter aanbevolen kan worden gehouden onder deze omstandigheden maximaal een maand.

    2. Bepaling van de Planktonische Wintereik Cell Minimum Metabolic remmende concentratie (PSMIC)

    1. Om de minimale metabole remmende concentratie (PSMIC) waarden voor 15 planktonically gegroeid P. vast te stellen aeruginosa isolaten, de microverdunningsplaten methode moet worden uitgevoerd, zoals beschreven in de richtlijnen van de British Society for Antimicrobial Chemotherapie BSAC 12. De keuze antibioticum, in dit geval tobramycine sulfaat wordt serieel verdund in Luria-Bertani (LB) medium in een 96-wells microtiterplaat met een breed scala van antibioticaconcentraties voorzien.
    2. Verdun 's nachts culturen van P. aeruginosa in LB een OD 600 0,05 (± 0,01) en voeg 100 ul volume aan de putjes van de 96-well microtiter plaat met 100 ul van de serieel verdunde antibioticum. In dit geval, de eindconcentraties van tobramycine sulfaat varieerde tussen 512 tot 0,5 ug / ml. Acht herhalingen van elke ANTIBiotic concentratie moet worden uitgevoerd.
    3. Putjes voor negatieve controle voor elk isolaat moeten worden opgezet, waarin geen antibioticum wordt toegevoegd. Ook moet acht putjes bestaan ​​LB gebruikt als blanco stroomafwaarts (sectie 2.6).
    4. Incubeer de 96-well microtiter platen 1-2 dagen bij 37 ° C zonder schudden onder aërobe en Microaërofiele (5% O2, 10% CO2 en 85% N2) omstandigheden. Microaërofiele voorwaarden wordt verkregen met behulp van CampyGen gas generatie verpakkingen in grote anaerobe pot.
    5. Na incubatie wordt bacteriële groei bepaald door de absorptie van de bacteriecultuur in elk putje met een golflengte van 600 nm met een Omega Fluostar microplaat lezer en de MARS Gegevensanalyse Software.
    6. Absorptie van antibiotica behandelde planktonische culturen (A antibiotica behandeld planktonische cellen) en absorptie van de negatieve controles (A negatieve controle) moet worden gecorrigeerd door af te trekkenion van de achtergrond extinctie van de putjes met LB alleen (A blanco). Het percentage remming van de levensvatbaarheid wordt vervolgens berekend als (gemiddeld een antibioticum behandeld planktonische cellen /: een negatieve controle) x 100%. De PSMIC 90 wordt gedefinieerd als de concentratie die antibioticum 90% remming van planktonische bacteriële groei.
    7. Om bacteriële leefbaarheid bepalen na behandeling met het antibioticum keuze 10 ul 0,02% (v / v) resazurin (opgelost in gedestilleerd water) toegevoegd aan elk putje en de platen geïncubeerd onder aerobe omstandigheden voor 1-2 uur bij 37 ° C onder schudden bij 150 rpm. Levensvatbare cellen vermindert de blauwe resazurin kleurstof aan de roze fluorescerende resorufin vorm.
    8. Na incubatie met resazurin, toezicht houden op de fluorescentie van elk putje met een golflengte van 540 nm en een emissie golflengte van 590 nm in een Fluostar Omega microplaat lezer. De gegevens worden geanalyseerd zoals beschreven islaag.

    3. Bepaling van de Biofilm Wintereik Cell Minimaal Remmende Concentratie (BSMIC)

    1. Overnachting culturen van P. aeruginosa (in dit geval 15 isolaten van P. aeruginosa worden) worden verdund in LB met een OD van 0,05 600 (± 0,01) en verder verdund 1:100 in verse ASM (totaal volume 1,8 ml).
    2. De verdunde cultures (1,8 ml) worden toegevoegd aan elk putje van een 24-wells weefselkweekplaten behandeld plaat. Drie putjes ASM bestaan ​​voor gebruik als een blanco stroomafwaarts analyse (punt 3.9).
    3. Zet de 24-well platen met laboratorium parafilm en incubeer 3 dagen onder aërobe en Microaërofiele omstandigheden bij 37 ° C onder schudden bij 75 rpm. Microaërofiele voorwaarden dienen te worden verkregen met behulp van CampyGen gas generatie verpakkingen in grote anaerobe pot.
    4. Verdun het antibioticum keuze, in dit geval tobramycine sulfaat, een passende concentratiebereik voorzien in versASM. In dit geval eindconcentraties varieerde 512-1 ug / ml. Voeg elke concentratie van het antibioticum, in hoeveelheden van 200 pi, de geschikte putjes van platen met 24 putjes. Vier herhalingen van elke antibiotica concentratie moet worden uitgevoerd. Biofilms niet blootgesteld aan de antibiotische keuze werden gebruikt als negatieve controle.
    5. Zet de 24-well platen met laboratorium parafilm en incubeer onder aërobe en Microaërofiele voorwaarden voor een verdere 24 uur bij 37 ° C onder schudden bij 75 rpm.
    6. Na incubatie in de aanwezigheid van het antibioticum keuze, kan het bacteriële biofilms met 100 ul van 100 mg / ml cellulase (verdund in 0,05 M citraatbuffer [9,6 g / l Citrate.H 2 0 in water en pH 4,6 met NaOH] ) en incubeer de 24-well platen onder aërobe omstandigheden bij 37 ° C onder schudden bij 150 rpm gedurende 1 uur. Indien nodig, kunnen biofilms verder worden verstoord door het manueel pipetteren in dit stadium.
    7. Om de metabolische activiteiten te bepalenvan de bacteriecellen vrijkomt uit de verstoord biofilm, 100 ul 0.02% (v / v) resazurin (opgelost in gedestilleerd water) worden toegevoegd aan elk putje van de 24 putjes en geïncubeerd voor 1-2 uur bij 37 ° C onder schudden bij 150 rpm.
    8. Na incubatie met resazurin, het meten van de fluorescentie van elk putje met een golflengte van 540 nm en een emissie golflengte van 590 nm in een Fluostar Omega microplaat lezer en de MARS data analyse software.
    9. Fluorescentie van het antibioticum behandelde biofilms (F antibiotica behandelde biofilms) en fluorescentie van de negatieve controles (F negatieve controle) wordt gecorrigeerd door aftrekking van de achtergrond fluorescentie verkregen uit de putjes die ASM alleen (F blanco). Het percentage remming van de levensvatbaarheid wordt vervolgens berekend als (gemiddelde van F antibiotica behandeld biofilms / gemiddelde F negatieve controle) x 100%. De BSMIC 90 wordt gedefinieerd als de antibiotic concentratie die 90% remming van de metabole activiteit.

    4. Representatieve resultaten

    ASM biofilmvorming kan in kleine (2 ml) en de toevoeging biofilms volledig gevormd binnen de 3 dagen (figuur 1A). Dit kan worden aangetoond door streng pipetteren de biofilm, dat moet moeilijk te verstoren. De microkolonies zijn vergelijkbaar met die gekweekt in grotere hoeveelheden 4 (figuur 1b). Figuur 2 grote verschillen tussen cellen planktonically en in een biofilm gekweekt zoals gedetecteerd door elektronenmicroscopische afbeelding analyse. Biofilm culturen duidelijk aanzienlijke niveaus van extracellulaire matrix rondom de cellen en de individuele structuren binnen de biofilm zijn moeilijk te identificeren.

    Verschillende studies suggereren dat de biofilm levensstijl kan antimicrobiële gevoeligheid 13, 14 beïnvloeden. De kleine schaal ASM assay kan worden zonnepaneel zelfsrmine de BSMIC van meerdere antibiotica meerdere isolaten tegelijk. De werkstroom van de test is in figuur 3. Het effect van antibiotica op de bacteriële levensvatbaarheid van de cellen kan worden gemeten met behulp van de resazurin test. Antibiotica, in dit geval tobramycine, worden toegevoegd aan de bekende biofilm en gedurende 24 uur. Hierna wordt de biofilm wordt verstoord en resazurin wordt toegevoegd.

    Metabolisch actieve cellen kan de kleurstof resazurin resulteert in een kleurverandering van blauw (resazurin) naar roze (resorufin) 15. Figuur 4A toont een voorbeeld assay waarin P. aeruginosa werd geïncubeerd met verschillende concentraties tobramycine voor biofilm verstoring en toevoeging van resazurin in een microtiterplaat. De blauwe niet-fluorescerende kleur geeft aan niet-levensvatbare cellen, terwijl levensvatbare cellen de kleurstof te reduceren tot de roze tl-vorm, resorufin. De SMIC kan dan worden berekend door het omzetten van fluorescentie in percentageresterende bacteriële leefbaarheid. Figuur 4B toont de verandering in% levensvatbaarheid bij toenemende tobramycine. 10% levensvatbaarheid werd gekozen als een cut-off om het minimumloon verdienen 90 te berekenen.

    Onder aërobe omstandigheden, de tobramycine SMIC 90 waarden zijn hoger voor de cellen gekweekt als een biofilm dan die van planktonische culturen. Tabel 1 toont de variatie in PSMIC 90 en 90 BSMIC alle geteste stammen. Uit tabel 2 blijkt dat onder aërobe omstandigheden een dramatische toename in resistentie tegen tobramycine (2> 32-voudige toename in SMIC) werd waargenomen voor de meeste isolaten wanneer gekweekt in ASM (biofilm) vergeleken met LB (plankton mode). Bovendien biofilms gekweekt onder omstandigheden Microaërofiele vertoonden een verhoogd SMIC tussen 2 en> 128-voudige opzichte van biofilm gekweekt onder aërobe omstandigheden.

    Figuur 1
    Figuur1. Biofilmvorming van P. aeruginosa in ASM P. aeruginosa stam PAO1 vormt macroscopisch zichtbaar pollen (microkolonies) wanneer ze groeien in ASM. A, vorming van biofilm in 30 ml ASM culturen (grootschalige) na 7 dagen de groei in de schroefdop glas Duran kolven. B, biofilmvorming in 2 ml ASM culturen ( kleinschalige) na 3 dagen groei in 24-well polystyreenplaten.

    Figuur 2
    Figuur 2. TEM microfoto van ASM biofilms A / C TEM microscoop (x; 27.000) van PAO1 gegroeid planktonically en in ASM, respectievelijk, B / D TEM microfoto (x57, 000) van PAO1grown planktonische en in ASM, respectievelijk. Planktonically gegroeid bacteriën werden gedurende de nacht gekweekt in LB-bouillon. Biofilms werden gekweekt gedurende 7 dagen in 30 ml ASM culturen. Zwarte pijlen verwijzen naar cellen in de biofilm en de sterren verwijzen naar extracellulaire ruimtes. Schaal bars = 1urn.

    Figuur 3
    Figuur 3. Workflow van de ASM biofilm antimicrobiële gevoeligheid test.

    Figuur 4
    Figuur 4. Gebruik van resazurin voor het bepalen van antibiotica gevoeligheid Bacteriële cellen werden geïncubeerd met verschillende concentraties van het antibioticum de resterende metabolische activiteit werd bepaald met behulp resazurin. A De blauwe niet fluorescerende geoxideerde vorm van resazurin geeft niet-levensvatbare cellen en gereduceerd door metabolische actieve cellen tot roze fluorescerende resorufin. B, wordt fluorescentie-intensiteit omgezet in percentage van de resterende bacteriële levensvatbaarheid. 10% levensvatbaarheid werd gekozen als cut-off om de MSMIC90 te berekenen. Klik hier om lar te bekijkenger figuur.

    Stammen PSMIC 90 (ug / ml) 1 BSMIC 90 (ug / ml) 1
    Aerobic Microaërofiele 2 Aerobic Microaërofiele 2
    PAO1 4 4 8 > 512
    Liverpool Epidemic Strain (LES) isoleert
    LESB58 21 8 64 64 128
    LES400 22 32 128 8 256
    LESB25 16 32 256 512
    LESB55 16 64 64 > 512
    LESB64 16 64 > 512 > 512
    LES431 22 4 8 32 > 512
    LESB49 16 64 64 256
    LES109 32 128 32 > 512
    Niet-LES isolaten
    49461 16 32 16 > 512
    59032 0,5 2 4 > 512
    59073 > 512 > 512 > 512 > 512
    59076 16 32 32 > 512 </ Td>
    27 8 16 4 > 512
    45 16 32 4 > 512

    Tabel 1. Gevoeligheid van P. aeruginosa voor tobramycine.

    1 Voor de bepaling van PSMICs en BSMICs tobramycine werd gebruikt in 2-voudige seriële verdunningen
    variërend 512 tot 0,5 pg / ml (n = 8 voor elke concentratie) en 512-1 pg / ml (n = 4 voor elk
    concentratie), respectievelijk; PSMICs werden bepaald met behulp van de standaard
    microverdunningsplaten methode 1.

    2 Microaërofiele omstandigheden waren 5% O 2, 10% CO2 en 85% N2.

    Spannen PSMIC 90 / BSMIC 90 voudige verandering 1
    PSMIC aërobe
    PSMIC Microaërofiele
    BSMIC aërobe
    BSMIC Microaërofiele
    PSMIC aërobe
    BSMIC aërobe
    PSMIC Microaërofiele
    BSMIC Microaërofiele
    PAO1 0 > 64 2 128
    LES isoleert
    LESB58 8 2 8 2
    LES400 4 32 0,25 2
    LESB25 2 2 16 16
    LESB55 4 > 8 4 > 8
    LESB64 4 ND > 32 > 8
    LES431 2 > 16 8 > 64
    LESB49 4 4 4 4
    LES109 4 16 0 > 4
    Niet-LES isolaten
    49461 2 > 32 0 > 16
    59032 4 > 128 8 > 256
    59073 ND ND ND ND
    59076 2 > 16 2 > 16
    27 2 > 128 0,5 > 32
    45 2 > 128 0,25 > 16

    Tabel 2. Vouw de verandering van PSMICs en BSMICs voor tobramycine.

    1 ND, niet bepaald; waarden in vet geven aan SMIC fold change van> 10.

Discussion

In deze studie hebben we gebruik gemaakt van een nieuw in vitro model op basis van ASM aan P. repliceren aeruginosa biofilm omstandigheden binnen de CF long 4. Het model is met succes aangepast voor kleinschalige, high-throughput testen van antimicrobiële middelen.

De kritische stappen van deze test zijn:

  1. Consistente voorbereiding van de ASM media en het onderhoud van steriliteit. We hebben besteed vele uren op een optimale manier waarop elke component wordt toegevoegd om reproduceerbare resultaten. Filtratie van de ASM is traag, maar is te verkiezen boven autoclaveren, die de mucine component kan beschadigen. Wij raden de toevoeging van antibiotica, zoals voorgesteld door anderen 11, omdat dit kan opleggen aanzienlijke selectieve druk, aandrijving mutaties, braken profaag lysis 16 en een significante verandering van de expressie van meerdere bacteriële genen.
  2. De test worden geoptimaliseerd het volume of ASM gebruikt. Shaking snelheden worden verhoogd voor kleinere volumes en een kortere biofilm levenscyclus wordt waargenomen.

Een voor de hand liggende toepassing van het kleinschalige ASM biofilm model is de meer realistische bepaling van de biofilm antimicrobiële gevoeligheid (BSMIC 90). Anaërobe en Microaërofiele niches aanwezig zijn in de CF long-en zijn er aanwijzingen dat zuurstof diep is beperkt tot volwassen biofilms 2, 17. Hier laten we zien dat de 10/14 klinische P. aeruginosa isolaten van CF-patiënt sputa vertonen een aanzienlijke (4 - ≥ 128 maal) afname van de gevoeligheid voor tobramycine onder Microaërofiele omstandigheden in ASM. De resultaten van deze studie blijkt dat antibiotica zoals tobramycine, kan minder effectief tegen P. aeruginosa infecties in de CF long dan wordt aangegeven door middel van conventionele gevoeligheid testmethoden. Deze resultaten wijzen eerdere studies over de antimicrobiële gevoeligheid van biofilms 10. Small-schaal ASM testen dus een eenvoudige high throughput platform voor het genereren van zinvolle antibiotica gevoeligheid van gegevens beter te informeren therapeutische beslissingen. De test wordt beperkt dezelfde wijze als conventioneel antibioticum gevoeligheidstests dat afzonderlijke kolonies worden opgenomen voor het screenen die niet representatief voor de gehele populatie. Toch zijn wij van mening dat een aanpak die (i) het gebruik van niet-oppervlak aangesloten biofilm groei en (ii) van toepassing zijn op Microaërofiele omstandigheden, een duidelijk alternatief en een mogelijke verbetering van bestaande methoden vertegenwoordigt. We concluderen dat deze test is een geschikt model om P. te bestuderen aeruginosa biofilm populaties. Nader onderzoek in een klinische context zou worden nagegaan of antibiotica gevoeligheden op basis van biofilm-grown P. aeruginosa kan leiden tot verschillende antibiotica keuzes met potentieel verbeterde microbiologische en klinische uitkomsten. Vergelijkbare onderzoeken met behulp van klassieke biofilm modellen hebben aangetoond dat BSMIC waarden leidenverschillende aanbevelingen voor de behandeling met antibiotica 5,17.

Naast het testen van de effectiviteit van anti-infectieuze middelen, de ASM systeem is een goedkope, eenvoudige en reproduceerbare alternatief voor dierlijke modellen voor studies, zoals die gericht op het begrijpen van de diversificatie van P. aeruginosa populaties. Wij zien veel heterogeniteit in natuurlijke populaties van P. aeruginosa hersteld van CF-patiënt sputa 18, 19. Vergelijkbare fenotypische en genotypische diversificatie kunnen worden waargenomen tijdens de groei in ASM 4 (en onze niet-gepubliceerde gegevens), waardoor het een aantrekkelijk in vitro model van de CF-longaandoeningen. De relatieve eenvoud van het model ASM eenvoudig te ontwerpen langdurige aanpassing experimenten gericht, bijvoorbeeld op de effecten van de antibiotica of andere spanningen op blz. aeruginosa bevolking divergentie. Bovendien kunnen andere bacteriële pathogenen worden gekweekt inASM. Bijvoorbeeld, Fouhy et al.. 2007 gebruik hebben gemaakt van ASM om biofilmvorming te bestuderen door S. maltophillia 20.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Wij erkennen de steun van het Verenigd Koninkrijk Nationaal Instituut voor Gezondheidsonderzoek, de Dr Hadwen Trust for Humane Research, toonaangevende medische van het Verenigd Koninkrijk onderzoek liefdadigheidsinstelling die uitsluitend niet-dierlijke onderzoekstechnieken ter vervanging van dierproeven, en de Wellcome Trust (Grant 089215). We hebben ook erkennen Novartis Pharmaceuticals Ltd Verenigd Koninkrijk (onbeperkte educatieve subsidie).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA from fish sperm Sigma-Aldrich 74782
Mucin from porcine stomach, type II Sigma-Aldrich M2378
L-Alanine Acros Organics 102830250
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006
L(+)-Asparagine monohydrate Acros Organics 175271000
L(+)-Aspartic acid Acros Organics 105041000
L-Cysteine Sigma-Adrich 168149
L(+)-Glutamic acid Acros Organics 156211000
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126
Glycine Acros Organics 220911000
L-Histidine Sigma-Adrich H8000
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000
L(+)-Lysine monohydrochloride Acros Organics 125222500
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625
L-Phenylalanine Acros Organics 130310250
L-Proline Sigma-Aldrich P0380
L-Serine Acros Organics 132660250
L-Threonine Acros Organics 138930250
L(-)-Tryptophan Acros Organics 140590250
L-Tyrosine Acros Organics 140641000
L-Valine Sigma-Aldrich V0500
Diethylenetriaminepentaacetic acid Sigma-Aldrich 32318
NaCl Fisher Scientific S/3160/60
KCl VWR BDH0258
KOH VWR BDH0262
Egg yolk emulsion Sigma-Aldrich 17148
ME 2 diaphragm vacuum pump Vacuubrand 696126
Steritop filters (Pore size: 0.22 μm, Neck size: 45 mm) EMD Millipore SCGPT10RE
Luria-Bertani medium Sigma-Aldrich L2897
96-well microtitre plates Sarstedt Ltd 82.1581
24-well tissue culture-treated plates Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. 3820-024
CampyGen gas generation packs Oxford Labware CN0025
Microaerophilic chamber Oxford Labware HP0011
Tobramycin sulphate Sigma-Aldrich T1783
Cellulase, from Aspergillus niger Sigma-Aldrich 22178
Resazurin Sigma-Aldrich 199303
Citrate.H20 VWR BDH0288
Fluostar omega microplate reader BMG-Labtech SPECTROstar Omega

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Andrews, J. M. BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8). J. Antimicrob. Chemother. 64, 454-489 (2009).
  2. Worlitzsch, D. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J. Clin. Invest. 109, 317-325 (2002).
  3. Smith, A. L., Fiel, S. B., Mayer-Hamblett, N., Ramsey, B., Burns, J. L. Susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa isolates and clinical response to parenteral antibiotic administration: lack of association in cystic fibrosis. Chest. 123, 1495-1502 (2003).
  4. Sriramulu, D. D., Lunsdorf, H., Lam, J. S., Romling, U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J. Med. Microbiol. 54, 667-676 (2005).
  5. Garbe, J. Characterization of JG024, a pseudomonas aeruginosa PB1-like broad host range phage under simulated infection conditions. BMC Microbiol. 10, 301 (2010).
  6. Naughton, S. Pseudomonas aeruginosa AES-1 exhibits increased virulence gene expression during chronic infection of cystic fibrosis lung. PLoS One. 6, e24526 (2011).
  7. Moskowitz, S. M., Foster, J. M., Emerson, J. C., Gibson, R. L., Burns, J. L. Use of Pseudomonas biofilm susceptibilities to assign simulated antibiotic regimens for cystic fibrosis airway infection. J. Antimicrob. Chemother. 56, 879-886 (2005).
  8. Field, T. R., White, A., Elborn, J. S., Tunney, M. M. Effect of oxygen limitation on the in vitro antimicrobial susceptibility of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa grown planktonically and as biofilms. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 24, 677-687 (2005).
  9. Bjarnsholt, T. Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients. Pediatr. Pulmonol. 44, 547-558 (2009).
  10. Hill, D. Antibiotic susceptibilities of Pseudomonas aeruginosa isolates derived from patients with cystic fibrosis under aerobic, anaerobic, and biofilm conditions. J. Clin. Microbiol. 43, 5085-5090 (2005).
  11. Fung, C. Gene expression of Pseudomonas aeruginosa in a mucin-containing synthetic growth medium mimicking cystic fibrosis lung sputum. J. Med. Microbiol. 59, 1089-1100 (2010).
  12. Andrews, J. M. BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8). The Journal of antimicrobial chemotherapy. 64, 454-489 (2009).
  13. Rybtke, M. T. The implication of Pseudomonas aeruginosa biofilms in infections. Inflamm Allergy Drug Targets. 10, 141-157 (2011).
  14. Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm. Pharmacol. Ther. 21, 595-599 (2008).
  15. Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. J. Immunol. Methods. 170, 211-224 (1994).
  16. Fothergill, J. L. Effect of antibiotic treatment on bacteriophage production by a cystic fibrosis epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 426-428 (2011).
  17. Singh, P. K. Quorum-sensing signals indicate that cystic fibrosis lungs are infected with bacterial biofilms. Nature. 407, 762-764 (2000).
  18. Mowat, E. Pseudomonas Aeruginosa Population Diversity and Turnover in Cystic Fibrosis Chronic Infections. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. (2011).
  19. Fothergill, J. L., Mowat, E., Ledson, M. J., Walshaw, M. J., Winstanley, C. Fluctuations in phenotypes and genotypes within populations of Pseudomonas aeruginosa in the cystic fibrosis lung during pulmonary exacerbations. J. Med. Microbiol. 59, 472-481 (2010).
  20. Fouhy, Y. Diffusible signal factor-dependent cell-cell signaling and virulence in the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia. J. Bacteriol. 189, 4964-4968 (2007).
  21. Winstanley, C. Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa. Genome Res. 19, 12-23 (2009).
  22. Carter, M. E. A subtype of a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis epidemic strain exhibits enhanced virulence in a murine model of acute respiratory infection. J. Infect. Dis. 202, 935-942 (2010).
Het gebruik van kunstmatige Sputum Middelgrote tot antibiotica werkzaamheid te testen tegen<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In Voorwaarden relevanter voor de Cystic Fibrosis Lung
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirchner, S., Fothergill, J. L., Wright, E. A., James, C. E., Mowat, E., Winstanley, C. Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung. J. Vis. Exp. (64), e3857, doi:10.3791/3857 (2012).More

Kirchner, S., Fothergill, J. L., Wright, E. A., James, C. E., Mowat, E., Winstanley, C. Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung. J. Vis. Exp. (64), e3857, doi:10.3791/3857 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter