Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Использование искусственного среднего мокроты для тестирования антибиотиков эффективность против doi: 10.3791/3857 Published: June 5, 2012

Summary

Текущий диагностических антимикробной чувствительности зависит от планктона роста изолятов в богатых питательными веществами, аэробных условиях. Здесь мы используем альтернативные искусственной среде мокроты для изучения антимикробной чувствительности синегнойной палочки биопленки при аэробных и микроаэрофильных условиях более представительным кистозный фиброз легких.

Protocol

1. Подготовка искусственной среде мокроты (ASM)

  1. Добавить 4 г ДНК из спермы рыб в 250 мл стерильной воды очень медленно в течение нескольких часов. ДНК занимает несколько часов до полного растворения и может быть перемешивают в течение ночи при комнатной температуре.
  2. Добавить 5 г муцина из свиного желудка (тип II) медленно в 250 мл стерильной воды до муцина полностью не растворится. Решение может быть перемешивают в течение ночи при 4 ° C.
  3. Растворить 0,25 г каждая существенные и несущественные L-аминокислот, за исключением L-тирозина и L-цистеин, в 100 мл стерильной воды. Растворить 0,25 г L-цистеина в 25 мл 0,5 М гидроксида калия (М т 56,11 г / моль) и 0,25 г L-тирозин в 25 мл стерильной воды.
  4. Растворите 5,9 мг диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA), 5 г NaCl и 2,2 г хлорида калия в 100 мл стерильной воды.
  5. Объединить ДНК, муцин, L-аминокислот, DTPA, NaCl и KCl в 1 литровую бутылку.
  6. Добавьте 5 мл яичного желтка электроннойmulsion и заполнения около 850 мл стерильной воды.
  7. Отрегулируйте рН до 6,9 с 1 M трис (рН 8,5, M т 121,14) и довести объем до 1 литра стерильной водой.
  8. Стерилизовать АНМ по фильтрации с использованием Vacuubrand ME 2 диафрагмы вакуумного насоса и фильтра Millipore Steritop единиц с порами и шеи размером 0,22 мкм и 45 мм соответственно. Каждый блок Steritop фильтр может использоваться повторно сразу в три раза, однако, фильтры нужно промывать два раза стерильной водой перед повторным использованием. Процесс фильтрации происходит медленно и могут быть выполнены в течение 2 дней. Другие версии ASM были разработаны, в которых используется добавление антибиотиков вместо фильтрации 11 Однако, из-за возможных взаимодействий с другими препаратами, мы не рекомендуем этот метод для конкретного приложения.
  9. Без фильтра и фильтруется АНМ должны храниться при температуре 4 ° С в темноте. Использование свежей АНМ рекомендуется однако, это может быть в этих условиях в течение не более одного месяца.

    2. Определение планктонных сидячие Сотовые минимальный метаболический ингибирующая концентрация (PSMIC)

    1. Для определения минимальной концентрации метаболических тормозные (PSMIC) значения за 15 planktonically выросли П. палочки изолятов, микроразведений метода должно быть выполнено, как описано в руководстве Британского общества по антимикробной химиотерапии BSAC 12. Антибиотик выбора, в этом случае сульфатов тобрамицин, серийно разводили в Лурия-Бертани (LB) среды в 96-и иммунологических планшет, чтобы обеспечить надлежащий диапазон концентрации антибиотиков.
    2. Развести ночь культур P. палочки в LB к OD 600 0,05 (± 0,01) и добавить 100 мкл в лунки 96-луночного иммунологических планшет, содержащий 100 мкл серийно разбавляют антибиотик. В этом случае конечной концентрации тобрамицина сульфата составляет от 512 - 0,5 мкг / мл. Восемь серии из Антибiotic концентрация должна быть выполнена.
    3. Отрицательные скважин управления для каждого изолировать должны быть созданы, в котором не антибиотик добавляется. Кроме того, восемь скважин должен содержать только LB для использования в качестве пустой во время ниже по течению анализа (раздел 2.6).
    4. Инкубируйте 96-луночного микропланшет в течение 1 - 2 дня при температуре 37 ° C без встряхивания в аэробных или микроаэрофильных (5% O 2, 10% CO 2, и 85% N 2) условиям. Микроаэрофильных условиях получены с использованием CampyGen газовой генерации пакетов в больших анаэробных банки.
    5. После инкубации бактерий определяется путем измерения оптической плотности бактериальной культуры в каждой лунке при длине волны 600 нм с использованием Fluostar Омега микропланшетов читателя и анализа MARS данных программного обеспечения.
    6. Поглощение из обработанных антибиотиками планктонных культур (антибиотик обработанные клетки планктона) и поглощения от негативного контроля (отрицательный контроль) должны быть исправлены путем вычитанияионов фоне абсорбции, полученной из скважин содержащих LB только (пустой). Процент ингибирования жизнеспособность в дальнейшем рассчитывается как (в среднем антибиотик обработанные клетки планктонных / означает отрицательный контроль) х 100%. PSMIC 90 определяется как концентрации антибиотика вызывает 90% ингибирование планктонных бактерий.
    7. Для определения жизнеспособности бактериальных после лечения антибиотиком выбора, 10 мкл 0,02% (объем / объем) resazurin (разводят в дистиллированной воде) добавляли в каждую лунку и планшеты инкубируют в аэробных условиях в течение 1 - 2 ч при 37 ° C, при встряхивании при 150 оборотах в минуту. Жизнеспособных клеток позволит снизить синего красителя resazurin в розовый флуоресцентный форме resorufin.
    8. После инкубации с resazurin, следить за флуоресценцию каждой скважине при возбуждении длиной волны 540 нм и длиной волны излучения 590 нм в Fluostar Омега микропланшетов читателя. Эти данные должны быть проанализированы, как описано бытьнизкая.

    3. Определение концентрации биопленки сидячие минимальных ингибирующих Cell (BSMIC)

    1. Ночь культуры P. палочки (в данном случае, 15 изолятов P. палочки используются) следует развести в LB к OD 600 0,05 (± 0,01), то дальнейшее разбавленной 1:100 в свежем ASM (общий объем 1,8 мл).
    2. Разведенный культур (1,8 мл) следует добавить в каждую лунку 24-луночного культуры тканей лечение пластины. Три скважины должно содержать АНМ только для использования в качестве пустой во время ниже по течению анализа (раздел 3.9).
    3. Безопасность 24-луночных планшетах с лабораторными парафильмом и инкубировать в течение 3 дней в аэробных или микроаэрофильных условиях при 37 ° C, при встряхивании при 75 оборотах в минуту. Микроаэрофильных условия должны быть получены с помощью CampyGen газовой генерации пакетов в больших анаэробных банки.
    4. Развести антибиотик выбора в этом случае сульфатов тобрамицин, чтобы обеспечить соответствующий диапазон концентрации в преснойASM. В этом случае конечной концентрации колебались от 512 - 1 мкг / мл. Добавить каждой концентрации антибиотика, в объеме 200 мкл, в лунки 24-луночных планшетах. Четыре серии из концентрации антибиотика должны быть выполнены. Биопленки не подвергается антибиотик выбора были использованы в качестве отрицательного контроля.
    5. Безопасность 24-луночных планшетах с лабораторными парафильмом и инкубировать в аэробных или микроаэрофильных условия для еще 24 ч при температуре 37 ° C, при встряхивании при 75 оборотах в минуту.
    6. После инкубации в присутствии антибиотика выбора, нарушить бактериальную биопленку с использованием 100 мкл 100 мг / мл целлюлозы (разбавленный в 0,05 М буфера цитрата [9,6 г / л Citrate.H 2 0 в воде и рН до 4,6 с NaOH] ) и инкубировать 24-луночных планшетах в аэробных условиях при 37 ° C, при встряхивании на 150 оборотов в минуту в течение 1 часа. При необходимости, биопленки могут быть дополнительно нарушается ручной пипетирования на данном этапе.
    7. Для определения метаболической активностибактериальных клеток освобождается от нарушена биопленки, 100 мкл 0,02% (объем / объем) resazurin (разводят в дистиллированной воде) должны быть добавлены в каждую лунку 24-луночных планшетах и ​​инкубировали в течение 1 - 2 ч при 37 ° C , при встряхивании при 150 оборотах в минуту.
    8. После инкубации с resazurin, измерять флуоресценцию каждой лунки использованием длины волны возбуждения 540 нм и длиной волны излучения 590 нм в Fluostar Омега микропланшетов читателя и анализа MARS данных программного обеспечения.
    9. Флуоресценции от обработанный антибиотиком биопленки (F, обработанный антибиотиком, биопленки) и флуоресценции от негативного контроля (F отрицательного контроля) должна быть исправлена ​​путем вычитания фоновой флуоресценции получены из скважин содержащих только ASM (F пустым). Процент ингибирования жизнеспособность в дальнейшем рассчитывается как (в среднем лечение антибиотиками F биопленки / F означает отрицательный контроль) х 100%. BSMIC 90 определяется как antibioтик концентрация, вызывающая 90% подавление метаболической активности.

    4. Представитель Результаты

    ASM образование биопленки можно в небольших (2 мл) объемы и биопленки полностью сформирован в течение 3 дней (рис. 1А). Это может быть продемонстрировано с помощью пипетки строго биопленки, которые должны быть трудно нарушить. Микроколоний сопоставимы с выращивается в больших объемах 4 (рис. 1б). На рисунке 2 показаны основные различия между клеток, выращенных planktonically и в биопленки, которая была определена на электронно-микроскопического анализа изображений. Биопленки культур ясно показывают значительное уровня внеклеточного матрикса окружающие клетки и отдельных структур в биопленки трудно определить.

    Некоторые исследования показывают, что биопленки образа жизни могут повлиять на антимикробную чувствительность 13, 14. Наш небольшой масштаб АНМ анализ может быть использован для Определяетrmine BSMIC нескольких антибиотиков для нескольких штаммов одновременно. Рабочий процесс анализа показано на рисунке 3. Влияние антибиотиков на бактериальные жизнеспособность клеток может быть измерена с помощью анализа resazurin. Антибиотики в данном случае тобрамицин, могут быть добавлены к установленному биопленки и инкубировали в течение 24 часов. После этого биопленки нарушается и resazurin добавляется.

    Метаболическую активность клеток может уменьшить resazurin красителя в результате изменения цвета от синего (resazurin) до розового (resorufin) 15. Рисунок 4а показан пример анализа, в котором П. палочки инкубировали с различными концентрациями тобрамицин до нарушения биопленки и добавления resazurin в планшета. Синий без флуоресцентного цвета указывает нежизнеспособных клеток, в то время как жизнеспособных клеток уменьшить красителя розового флуоресцентного форме, resorufin. МРОТ может быть вычислена путем преобразования флуоресценции в процентахОстальные бактериальной устойчивости. рисунок 4B показывает изменение в% жизнеспособность при увеличении концентрации тобрамицин. 10% жизнеспособность была выбрана в качестве отсечения для расчета МРОТ 90.

    В аэробных условиях, тобрамицин МРОТ 90 значений выше для клеток, выращенных в биопленки, чем планктона культур. В таблице 1 показаны изменения в PSMIC 90 и BSMIC 90 для всех изолятов испытания. Таблица 2 показывает, что в аэробных условиях, резкое увеличение сопротивления тобрамицин (2> 32 кратное увеличение МРОТ) наблюдается для большинства изолятов при выращивании в ASM (биопленки режим) по сравнению с LB (планктонные режим). Кроме того, биопленок, выращенных в условиях микроаэрофильных выставлены увеличился МРОТ от 2 до> 128 раз по сравнению с биопленок, выращенных в аэробных условиях.

    Рисунок 1
    Рисунок1. Биопленки из палочки в П. П. АНМ палочки штамма PAO1 является макроскопически видимых скоплений (микроколонии) при выращивании в ASM., образование биопленки в 30 мл АНМ культуры (крупный), после 7 дней роста винтовой крышкой стеклянной колбы Duran. B, формирование биопленок в 2 мл АНМ культур ( мелкие) после 3 дней роста в 24-луночных полистирола.

    Рисунок 2
    Рисунок 2. ПЭМ микрофотографии АНМ биопленки А / С ТЕМ микроскопа (х, 27 000) из PAO1 выросли planktonically и АНМ соответственно, B / D ПЭМ микрофотографии (x57, 000) PAO1grown планктонных и АНМ соответственно. Planktonically выращивают бактерии выращивали в течение ночи в LB бульоне. Биопленки культивировали в течение 7 дней в 30 мл АНМ культур. Черные стрелки ссылаться на ячейки в биопленки и звезды относятся к внеклеточного пространства. Масштаб баров = 1мкм.

    Рисунок 3
    Рисунок 3. Workflow АНМ биопленки антимикробной чувствительности анализа.

    Рисунок 4
    Рисунок 4. Использование resazurin для определения антибиотиков восприимчивости бактериальные клетки инкубировали с различными концентрациями антибиотика, а остальные метаболической активности определяли с помощью resazurin., Синий, не люминесцентные окисленной форме resazurin указывает нежизнеспособных клеток и уменьшается метаболический активные клетки розового флуоресцентного resorufin. B, интенсивность флуоресценции преобразуется в процентах оставшихся бактериальной устойчивости. 10% жизнеспособность была выбрана в качестве отсечения для расчета MSMIC90. Щелкните здесь для просмотра LARгер фигуры.

    Деформации PSMIC 90 (мкг / мл) 1 BSMIC 90 (мкг / мл) 1
    Аэробный Микроаэрофильных 2 Аэробный Микроаэрофильных 2
    PAO1 4 4 8 > 512
    Ливерпуль эпидемии штамма (LES) изолирует
    LESB58 21 8 64 64 128
    LES400 22 32 128 8 256
    LESB25 16 32 256 512
    LESB55 16 64 64 > 512
    LESB64 16 64 > 512 > 512
    LES431 22 4 8 32 > 512
    LESB49 16 64 64 256
    LES109 32 128 32 > 512
    Non-ЛЕ изолятов
    49461 16 32 16 > 512
    59032 0,5 2 4 > 512
    59073 > 512 > 512 > 512 > 512
    59076 16 32 32 > 512 </ TD>
    27 8 16 4 > 512
    45 16 32 4 > 512

    Таблица 1. Восприимчивость к П. палочки тобрамицин.

    1 Для определения PSMICs и BSMICs тобрамицин использовался в 2 раза серийных разведений
    от 512 - 0,5 мкг / мл (n = 8 для каждой концентрации) и 512 - 1 мкг / мл (п = 4 для каждого
    концентрации), соответственно;; PSMICs определяли с помощью стандартных
    микроразведений метода 1.

    2 микроаэрофильных условиях на 5% O 2, 10% CO 2, и 85% N 2.

    Напрягать PSMIC 90 / BSMIC 90 раз изменения 1
    PSMIC аэробных
    PSMIC микроаэрофильных
    BSMIC аэробных
    BSMIC микроаэрофильных
    PSMIC аэробных
    BSMIC аэробных
    PSMIC микроаэрофильных
    BSMIC микроаэрофильных
    PAO1 0 > 64 2 128
    LES изолирует
    LESB58 8 2 8 2
    LES400 4 32 0,25 2
    LESB25 2 2 16 16
    LESB55 4 > 8 4 > 8
    LESB64 4 ND > 32 > 8
    LES431 2 > 16 8 > 64
    LESB49 4 4 4 4
    LES109 4 16 0 > 4
    Non-ЛЕ изолятов
    49461 2 > 32 0 > 16
    59032 4 > 128 8 > 256
    59073 ND ND ND ND
    59076 2 > 16 2 > 16
    27 2 > 128 0,5 > 32
    45 2 > 128 0,25 > 16

    Таблица 2. Fold изменения PSMICs и BSMICs в тобрамицин.

    1 Н.Д., не определено, значения жирным шрифтом указывают МРОТ раза изменений> 10.

Discussion

В этом исследовании мы использовали новые модели в пробирке на основе ASM повторить P. палочки биопленки условиях в течение 4-х легких при МВ. Эта модель была успешно изменено для малых, высокой пропускной способности тестирования антимикробных препаратов.

Важных шагов этого анализа являются:

  1. В соответствии подготовке АНМ средств массовой информации и поддержания стерильности. Мы посвятили много времени на оптимизацию, каким образом каждый компонент добавляется чтобы получить воспроизводимые результаты каждый раз. Фильтрация АНМ медленно, но предпочтительнее автоклавирование, которая может привести к повреждению компонентов муцина. Мы не советуем добавлением антибиотиков, как это было предложено другими 11, поскольку это может наложить значительные селективного давления, привод мутаций, вызывает лизис профага 16 и существенно изменить выражение несколько бактериальных генов.
  2. Анализ должен быть оптимизирован в соответствии с объемом ое ASM используется. Тряска скорости увеличиваются на меньшие объемы и короткие биопленки жизненного цикла наблюдается.

Очевидное применение мелких АНМ модель биопленки является более реалистичным определением биопленки антимикробной восприимчивости (BSMIC 90). Анаэробные и микроаэрофильных ниши находятся в легких при МВ и есть доказательства того, что кислород ограничено глубоко внутри зрелых биопленок 2, 17. Здесь мы показываем, что 10/14 клинических P. палочки изолятов CF больной мокрота демонстрируют значительное (4 - ≥ 128 раз) снижение чувствительности к тобрамицин микроаэрофильных условиях в ASM. Результаты этого исследования показывают, что антибиотики, такие как тобрамицин, могут быть менее эффективными в отношении P. палочки инфекции в легких при МВ, чем указано с помощью традиционных методов тестирования восприимчивости. Эти результаты отражают предыдущие исследования по антимикробной чувствительности биопленки 10. Малыемасштаб АНМ анализов таким образом, обеспечить простой высокой платформе пропускную способность для создания значимых данных антибиотиков восприимчивость, чтобы лучше информировать терапевтических решений. Анализ ограничен тем же способом, как и обычные антибиотики тестирования чувствительности в том, что одной колонии выбрали для обследования, которые не могут быть репрезентативными для всего населения. Тем не менее, мы считаем, что подход (я) с использованием не-поверхность прилагается рост биопленки и (II), применимые к микроаэрофильных условиях, представляет собой явную альтернативу и потенциал улучшения существующих методов. Мы считаем, что этот анализ является подходящей моделью для изучения П. населения палочки биопленки. Дальнейшие испытания в клинических условиях было удостовериться в том, антибиотик восприимчивости на основе биопленки выращенных P. палочки может привести к различным антибиотикам выбор с потенциально улучшить микробиологические и клинические исходы. Подобные исследования с использованием классических моделей биопленки показал, что BSMIC значения приводятразличные рекомендации по антибиотикотерапии 5,17.

В дополнение к тестированию на эффективность борьбы с инфекционными агентами, АНМ система представляет собой дешевый, простой и воспроизводимой альтернатива моделей на животных для исследований, таких как те, которые направлены на понимание диверсификации P. палочки населения. Мы наблюдали обширный неоднородность в природных популяциях P. палочки оправился от CF больной мокрота 18, 19. Подобные фенотипической и генотипической диверсификации можно наблюдать во время роста в АНМ 4 (и наши неопубликованные данные), что делает его привлекательным в пробирке модель CF условиях легкого. Относительная простота АНМ модель позволяет легко разрабатывать долгосрочные эксперименты адаптации, направленные, например, при мониторинге воздействия антибиотиков или других нагрузок на П. расхождение палочки населения. Кроме того, другие бактериальные патогены могут быть выращены вASM. Например, Fouhy соавт. 2007 году использовать ASM изучить формирование биопленок С. maltophillia 20.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы признаем, поддержку Великобритании Национальный институт исследований в области здравоохранения, д-ра Hadwen целевого исследования гуманной, ведущих медицинских Великобритании благотворительная финансирования научных исследований исключительно неживотного методы исследования, чтобы заменить эксперименты на животных, и Wellcome Trust (грант 089215). Мы также признаем, Novartis Pharmaceuticals Ltd в Великобритании (неограниченного образовательного гранта).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA from fish sperm Sigma-Aldrich 74782
Mucin from porcine stomach, type II Sigma-Aldrich M2378
L-Alanine Acros Organics 102830250
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006
L(+)-Asparagine monohydrate Acros Organics 175271000
L(+)-Aspartic acid Acros Organics 105041000
L-Cysteine Sigma-Adrich 168149
L(+)-Glutamic acid Acros Organics 156211000
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126
Glycine Acros Organics 220911000
L-Histidine Sigma-Adrich H8000
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000
L(+)-Lysine monohydrochloride Acros Organics 125222500
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625
L-Phenylalanine Acros Organics 130310250
L-Proline Sigma-Aldrich P0380
L-Serine Acros Organics 132660250
L-Threonine Acros Organics 138930250
L(-)-Tryptophan Acros Organics 140590250
L-Tyrosine Acros Organics 140641000
L-Valine Sigma-Aldrich V0500
Diethylenetriaminepentaacetic acid Sigma-Aldrich 32318
NaCl Fisher Scientific S/3160/60
KCl VWR BDH0258
KOH VWR BDH0262
Egg yolk emulsion Sigma-Aldrich 17148
ME 2 diaphragm vacuum pump Vacuubrand 696126
Steritop filters (Pore size: 0.22 μm, Neck size: 45 mm) EMD Millipore SCGPT10RE
Luria-Bertani medium Sigma-Aldrich L2897
96-well microtitre plates Sarstedt Ltd 82.1581
24-well tissue culture-treated plates Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. 3820-024
CampyGen gas generation packs Oxford Labware CN0025
Microaerophilic chamber Oxford Labware HP0011
Tobramycin sulphate Sigma-Aldrich T1783
Cellulase, from Aspergillus niger Sigma-Aldrich 22178
Resazurin Sigma-Aldrich 199303
Citrate.H20 VWR BDH0288
Fluostar omega microplate reader BMG-Labtech SPECTROstar Omega

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Andrews, J. M. BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8). J. Antimicrob. Chemother. 64, 454-489 (2009).
  2. Worlitzsch, D. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J. Clin. Invest. 109, 317-325 (2002).
  3. Smith, A. L., Fiel, S. B., Mayer-Hamblett, N., Ramsey, B., Burns, J. L. Susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa isolates and clinical response to parenteral antibiotic administration: lack of association in cystic fibrosis. Chest. 123, 1495-1502 (2003).
  4. Sriramulu, D. D., Lunsdorf, H., Lam, J. S., Romling, U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J. Med. Microbiol. 54, 667-676 (2005).
  5. Garbe, J. Characterization of JG024, a pseudomonas aeruginosa PB1-like broad host range phage under simulated infection conditions. BMC Microbiol. 10, 301 (2010).
  6. Naughton, S. Pseudomonas aeruginosa AES-1 exhibits increased virulence gene expression during chronic infection of cystic fibrosis lung. PLoS One. 6, e24526 (2011).
  7. Moskowitz, S. M., Foster, J. M., Emerson, J. C., Gibson, R. L., Burns, J. L. Use of Pseudomonas biofilm susceptibilities to assign simulated antibiotic regimens for cystic fibrosis airway infection. J. Antimicrob. Chemother. 56, 879-886 (2005).
  8. Field, T. R., White, A., Elborn, J. S., Tunney, M. M. Effect of oxygen limitation on the in vitro antimicrobial susceptibility of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa grown planktonically and as biofilms. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 24, 677-687 (2005).
  9. Bjarnsholt, T. Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients. Pediatr. Pulmonol. 44, 547-558 (2009).
  10. Hill, D. Antibiotic susceptibilities of Pseudomonas aeruginosa isolates derived from patients with cystic fibrosis under aerobic, anaerobic, and biofilm conditions. J. Clin. Microbiol. 43, 5085-5090 (2005).
  11. Fung, C. Gene expression of Pseudomonas aeruginosa in a mucin-containing synthetic growth medium mimicking cystic fibrosis lung sputum. J. Med. Microbiol. 59, 1089-1100 (2010).
  12. Andrews, J. M. BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8). The Journal of antimicrobial chemotherapy. 64, 454-489 (2009).
  13. Rybtke, M. T. The implication of Pseudomonas aeruginosa biofilms in infections. Inflamm Allergy Drug Targets. 10, 141-157 (2011).
  14. Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm. Pharmacol. Ther. 21, 595-599 (2008).
  15. Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. J. Immunol. Methods. 170, 211-224 (1994).
  16. Fothergill, J. L. Effect of antibiotic treatment on bacteriophage production by a cystic fibrosis epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 426-428 (2011).
  17. Singh, P. K. Quorum-sensing signals indicate that cystic fibrosis lungs are infected with bacterial biofilms. Nature. 407, 762-764 (2000).
  18. Mowat, E. Pseudomonas Aeruginosa Population Diversity and Turnover in Cystic Fibrosis Chronic Infections. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. (2011).
  19. Fothergill, J. L., Mowat, E., Ledson, M. J., Walshaw, M. J., Winstanley, C. Fluctuations in phenotypes and genotypes within populations of Pseudomonas aeruginosa in the cystic fibrosis lung during pulmonary exacerbations. J. Med. Microbiol. 59, 472-481 (2010).
  20. Fouhy, Y. Diffusible signal factor-dependent cell-cell signaling and virulence in the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia. J. Bacteriol. 189, 4964-4968 (2007).
  21. Winstanley, C. Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa. Genome Res. 19, 12-23 (2009).
  22. Carter, M. E. A subtype of a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis epidemic strain exhibits enhanced virulence in a murine model of acute respiratory infection. J. Infect. Dis. 202, 935-942 (2010).
Использование искусственного среднего мокроты для тестирования антибиотиков эффективность против<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; В условиях более актуальными для кистозного фиброза легких
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Kirchner, S., Fothergill, J. L., Wright, E. A., James, C. E., Mowat, E., Winstanley, C. Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung. J. Vis. Exp. (64), e3857, doi:10.3791/3857 (2012).More

Kirchner, S., Fothergill, J. L., Wright, E. A., James, C. E., Mowat, E., Winstanley, C. Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung. J. Vis. Exp. (64), e3857, doi:10.3791/3857 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter