Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Выражение и очистка муковисцидоза трансмембранного регулятора проводимости белка в Saccharomyces CEREVISIAE

Published: March 10, 2012 doi: 10.3791/3860
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Faculty of Life Sciences, University of Manchester

Summary

Попытки выразить муковисцидоз трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) в

Abstract

Муковисцидоз трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) является хлорид канала, что, когда мутировал, может привести к муковисцидозом в humans.There Поэтому значительный интерес в этом белке, но усилия, чтобы изучить его структуру и деятельность были затруднены трудности выражения и очистка достаточного количества белка 1-3. Как и во многих «трудных» эукариотических мембранных белков, экспрессия в быстрорастущий организм является желательным, но сложно, и в дрожжей S. CEREVISIAE, до сих пор низкие суммы были получены и быстрой деградации рекомбинантного белка наблюдается 4-9. Белки участвуют в обработке рекомбинантный CFTR у дрожжей были описаны 6-9. В этом докладе мы описываем методологию для выражения CFTR в дрожжах и очистки в значительных количествах. В протоколе описывается, как ранее проблемы протеолиза могут быть преодолены, и как выражение уровняCFTR может быть значительно улучшена путем изменения условий роста клеток и контроля индукции условий, в частности срок до клетки урожая. Reagants, связанных с этим протоколом (мышиные CFTR-экспрессирующих клеток дрожжей или дрожжевого плазмид) будет распространяться через американского Муковисцидоз Фонда, который является спонсором исследований. Статьи о дизайне и синтез CFTR конструкцию, занятых в этом отчет будет опубликован отдельно (Urbatsch И.,. Тибодо, П. и др., не опубликовано). В этой статье мы расскажем нашим методом, начиная с преобразованием дрожжевых клеток с CFTR построить - содержащие дрожжи плазмиды (рис. 1). Конструкция имеет зеленый флуоресцентный белок (GFP), слитый с последовательностью гена CFTR на С-конце и следует система, разработанная Дрю и соавт. (2008) 10. GFP позволяет выражения и очистки CFTR, которым необходимо следовать относительно легко. Юпитер визуализировать protocол заканчивается после подготовки микросом из дрожжевых клеток, хотя мы и включают несколько предложений для очистки белка из микросом. Читатели, возможно, хотели бы добавить свои изменения в микросом процедуры очистки, в зависимости от окончательного эксперимента будет осуществляться с белком и местным оборудованием к ним. Дрожжей выразил CFTR белка может быть частично очищают с использованием ионов металлов аффинной хроматографии, используя внутренние теги очистки polyhistidine. После гель-хроматографии дает белок, который оказывается> 90% чистоты, если судить по SDS-PAGE и Кумасси окрашивания геля.

Protocol

1. Подготовка средств массовой информации и буферы

  1. YNB: за один литр, приостановить 6,9 г дрожжей азотистого основания без аминокислот и 0,77 г смеси без добавки урацил в 1 л воды. Автоклав. Хранить при температуре 4 ° C.
  2. YNBA: Для 400 мл, приостановить 2,76 г дрожжей азотистого основания без аминокислот, 0,38 г смеси без добавки урацил и 8g бактериологического агара в 350 мл воды. Автоклав. Смешайте 8 г сахара с 50 мл воды и тепла мягко до полного растворения. Стерилизовать через 0,2 мкм фильтр и добавить к YNBA в то время как расплавленный агар. Хранить при комнатной температуре.
  3. 20% глюкозы в среде: на 500 мл, смешайте 100 г сахара 500 мл YNB мягко и тепло до полного растворения. Пройдите через 0,2 мкм фильтр в стерильные бутылки Duran. Хранить при комнатной температуре.
  4. 20% галактозы среды: На 2 литра, смешать 400 г галактозы с 2l YNB мягко и тепло до полного растворения. Пройдите через 0,2 мкм фильтр в стерильные бутылки Duran. Хранить при комнатной температурепературы.
  5. Ингибитор протеазы акций: CFTR очень чувствительны к протеолизу 4. Авторы обнаружили следующие ингибиторы, чтобы быть эффективным в ограничении протеолиза, хотя читатели, возможно, пожелают адаптировать этот список, чтобы удовлетворять свои собственные потребности. Хранить в 100 мкл аликвоты при -20 ° C уменьшить замораживания-оттаивания проблем. Все ингибиторы должны быть разбавлены со склада решения рабочей концентрации, как показано ниже:
Ингибитор Со концентрации Массоподготовки Рабочая концентрация
AEBSF 200 мМ Растворить в 1 мл 48mg дистиллированной воды 0,2 мМ
Benzamidine 300 мМ Растворите 36 мг в 1 мл дистиллированной воды 0.3 мМ
Химостатина 4 мМ Растворите 2,5 мг в 1 мл сухой DMSO 4 мкМ
E-64 7 мМ Растворите 2,5 мг в 1 мл дистиллированной воды 7 мкм
Leupeptin 20 мМ Растворите 10 мг в 1 мл дистиллированной воды 20 мкМ
Пепстатина 15 мМ Растворите 10 мг в 1 мл сухой ДМСО 15 мкМ
PMSF 1 M Растворить в 1 мл 174mg сухой ДМСО 1 мМ
  1. DVB-T (1 М): растворить 154 мг в 1 мл дитиотреитола дистиллированной воды. Хранить при температуре -20 ° C. Использование в разведении 1:1000 в буфер указано.
  2. ЭДТА (0,5 М): Смешайте 29,22 г этилендиаминтетрауксусной кислоты с 100 мл воды. Добавить 10 N NaOH по капле, пока все не растворится ЭДТА и рН достигает 8. Сделать до 200 мл воды и пройти через фильтр 0,2 мкм в стерильные бутылки Duran. Хранить при комнатной температуре.
  3. CRB (300 мМ Трис-HCl,рН 7,4, 0,56 M сорбит, 1 мМ ЭДТА): Растворить 18,17 г Трис-базой в 350 мл воды и регулировать рН до 7,4 добавлением HCl. Добавить 51,35 г сорбита и сделать объем до 500 мл воды. Автоклав. Добавить 1 мл маточного раствора ЭДТА и хранить при температуре 4 ° C.
  4. CFTR буфера (50 мМ Трис, рН 8,0, 10% об / глицерин): Растворить 6,06 г трис-базой в 500 мл воды. Отрегулируйте рН до 8 с HCl, добавить 100 мл глицерина и составляют до 1 л воды. Автоклав и хранить при температуре 4 ° C.
  5. 2 раза нагрузку красителя: 50 мМ Трис-HCl (рН 7,6), 5% глицерина, 5 мМ ЭДТА (рН 8,0), 0,02% бромфенола синий, 4% SDS, 0,05 М DTT. Сделайте 10 мл аликвоты и хранят при температуре -20 ° C.

2. Скрининг Трансформанты

Этот протокол предполагает, что CFTR-GFP-8His слияние ген был вставлен в дрожжевой плазмиды вниз по течению GAL1 промоутер галактозы (рис.1) и, что плазмиды была преобразована в FGY217 клеток, Pep4 удаление мутант S.cerevisiae 10 и соавт. (2008) 10.

  1. Возьмите 5-10 хорошо разделенных колоний от преобразования пластины. Передача каждой колонии в отдельный стерильный 50 мл Сокол пробирку, содержащую 9 мл YNB и 1 мл 20% глюкозы в среде. На этом этапе важно, чтобы конечная концентрация 2% глюкозы (вес / объем) в культуре для поддержания роста клеток. Рост ночь в течение 16 часов при 250 оборотах в минуту, 30 ° С в орбитальное вращение инкубатора.
  2. Сделать глицерин запасов для каждого из экранированного колонии. Асептических условиях добавляют 0,8 мл ночной культуры в 0,2 мл стерильного глицерина в маркированных завинчивающейся флаконов, вихревые кратко и хранить при температуре -80 ° C.
  3. Развести оставшейся ночь культур до конечного объема 50 мл в YNB, в том числе 250 мл 20% глюкозы в среде.На этом этапе важно, чтобы разбавить концентрацию глюкозы примерно на 0,1% (в / в) в культуре, потому что высокий уровень глюкозы может подавлять GAL1 промоутер 10. Рост культуры в маркированных 250 мл коническую тупик колбы для OD 600 0,7-0,8 при 250 оборотах в минуту, 30 ° С в орбитальное вращение инкубатора.
  4. Вызвать культуры добавлением 5 мл 20% галактозы средних каждой колбы и расти в течение 16 часов.
  5. Подтвердите выражение CFTR с помощью флуоресцентной микроскопии. Возьмите по 100 мкл культуры и добавить 100 мкл глицерина ограничить подвижность клетки в растворе. Анализ клеток на Delta видение РТ восстановление микроскоп (или аналогичный), с использованием синего лазера под FITC фильтра (длина волны возбуждения 490 нм и длине волны излучения 528-538 нм). Положительное выражение CFTR-GFP белок слияния должна быть видна в виде кольца флуоресценции в плазматической мембране клеток дрожжей. Непреобразованных дрожжевые клетки могут быть использованы в качестве контроля.
  6. Трансферкультур в 50 мл пробирки Falcon. Урожай клеток путем центрифугирования при 3500 мкг, 4 ° C в течение 10 минут в центрифуге верхней скамье. Несмотря на то, центрифуга работает, подготовить 2 мл микроцентрифужную труб с винтовой крышкой, содержащей приблизительно 500 мкл кислоты вымытые стеклянные бусы и место на льду. Откажитесь от супернатантов и ресуспендируют каждый шарик в 500-800 мкл ледяной CRB с ингибиторы протеазы. Передача суспензии микроцентрифужную пробирки, содержащие шарики и держать на льду.
  7. Лизировать клетки энергично встряхивая / встряхивая каждый микроцентрифужную трубку в течение 10 периодов по 30 секунд, опираясь на льду между периодами. Beadbeater могут быть использованы в качестве альтернативы, например, beadbeater BioSpec мини течение 3 мин.
  8. Поместите трубы в настольный микроцентрифужную и центрифуги в 3500 мкг, 4 ° С в течение 5 минут. Передача супернатантах содержащие сырой населения мембран для очистки микроцентрифужную труб и место на льду. Добавить 500 мкл свежей ледяной сотрудничестваЛ.Д. CRB с ингибиторами протеаз в каждую пробирку и повторить процесс накопления мембран.
  9. Сбор сырья мембран вращается на максимальной скорости, 4 ° С в настольный микроцентрифужную в течение 2 часов. Удалите супернатант и ресуспендируют каждый шарик в 50 мкл ледяного буфера CFTR.
  10. В чистых труб микроцентрифужную, смешать 15 мкл каждой подвески с 15 мкл 2x красителя нагрузки с помощью пипетки вверх и вниз. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут. Не кипятите образцов, так как это вызовет CFTR и других мембранных белков с образованием SDS-нерастворимые агрегаты, а также естественные свойства GFP тегов.
  11. Загрузите образцы вместе с PageRuler Plus prestained стандартам белка (Fermentas) на 4-20% Tris / глицин градиент геля (NUSEP) и работать на 150 В в течение 40 минут или пока краска фронта находится в нижней части геля.
  12. Определить самого высокого выражения клеток в геле флуоресценции. Место в флуоресценции системы визуализации, такие как тайфун сканера. Сканирование и гельпеть синего лазера на длине волны возбуждения 488 нм и длиной волны излучения 526 нм. CFTR-GFP слияния должна быть видна на около 220 кДа. Там также будет слабым флуоресцентные группы видны около 70 кДа, который, вероятно, внутренней дрожжи FAD-содержащий белок оболочки (например, янтарной дегидрогеназы подразделения) 11,12.
  13. Пятно гель Кумасси, destain и сканирования геля для сравнения с флуоресценцией сканирования с помощью удобного просмотра изображений программное обеспечение. Кумасси окрашенного геля позволяет относительно оценки CFTR-GFP уровни экспрессии в различных клоновых линий после нормализации количества общего белка загружены на каждой дорожке геля.
  14. Подряд из самых высоких выражения линии клеток из глицерина акций (2.2) на свежий YNBA пластину и инкубировать при температуре 30 ° С в течение 2-3 дней. Эта плита может быть сохранен в течение 2 недель при температуре 4 ° C.

3. Крупномасштабные ферментер КультЮр

  1. Подготовить заранее культур для брожения. Очистите 1 см 2 площадь клеток из YNBA пластины (2.13) с помощью стерильной петли и добавить 45 мл YNB и 5 мл 20% глюкозы в среде, такой, что OD 600 составляет около 0,1. Рост в 250 мл коническую тупик колбы на 250 оборотов в минуту, 30 ° С в орбитальное вращение инкубаторе до OD 600 достигает 1.
  2. Разделить культуры между двумя 2 л Эрленмейера тупик колб каждый из которых содержит 450 мл YNB и 25 мл 20% раствора глюкозы среде. Рост их на 250 оборотов в минуту, 30 ° С в орбитальное вращение инкубатор до OD 600 достигает 1,2.
  3. Хотя эти предварительные культур растет, создана для брожения. Сделать 11.2l из YNB, как описано в 1.1, но растворяются дополнительные 8,28 г YNB и 0,95 г выпадают добавка, чтобы компенсировать добавлением глицерина при индукции. Асептических условиях добавить 11,2 л YNB и 75 мл 20% раствора глюкозы среднего стерильный сосуд 20л ферментер и настройки рабочей температуры в30 ° C.
  4. Асептических добавить precultures в ферментер и установить скорости перемешивания примерно 800 оборотов в минуту и ​​поддерживает температуру на 30 ° C. Сжатый воздух должен поступать примерно в 15 дм 3 мин -1. После брожения культура достигает OD 600 1,2, вызывают на асептически добавить 1,5 л YNB 20% раствор галактозы и 1,2 л глицерина. Уменьшить температуру до 25 ° C и роста культуры в течение 16 часов.
  5. Передача ферментер содержимое в охлажденный 1л горшки центрифуг на льду с использованием перистальтического насоса. Урожай клеток путем центрифугирования при 3500 мкг, 4 ° С в течение 30 минут в большом ротором мощностью (например, 6 л). Ресуспендируют клеток в 150 мл ледяной CRB с ингибиторами протеазы. С этого момента, все работы должны проводиться при температуре 4 ° C.
  6. Лизировать клетки, проходя через постоянное клетки разрушителя системы в 4 прохода 25, 30, 32 и 35 кПа, собирая лизата на льду в каждом конкретном случае. Кроме того, использование шарика Беатег (Биоспек) с равным объемом кислотно-промытый 0,5 мм, стеклянные бусы и агитировать за 3 минуты на полной мощности. Передача лизата на 50 мл Сокол труб и гранулах клетки мусора путем центрифугирования при 3500 мкг, 4 ° С в течение 15 минут в настольной центрифуге.
  7. Перенести супернатант в охлажденной пробирки. Центрифуга при 14000 х г, 4 ° С в течение 30 минут в центрифугу для удаления митохондрий.
  8. Передача супернатанта охлажденной ультрацентрифуге труб. Центрифуга на 200 000 мкг, 4 ° C в течение 90 минут в ультрацентрифуге собрать микросомах.
  9. Тщательно слейте и выбросьте супернатант и добавить 2 мл ледяного буфера CFTR с ингибиторами протеазы и 1 мМ DTT в каждую пробирку. Осторожно ресуспендирования гранулы помощью кисти, долить каждый трубки с CFTR буфера и перемешать использованием вихревой смеситель.
  10. Центрифуга подвески на 200 000 мкг, 4 ° C в течение 60 минут в ультрацентрифуге, удалите супернатант и ресуспендируют окатышей в 2 мл ледяного буфера CFTR Wго ингибиторов протеазы (Без DVB-T) с помощью кисти.
  11. Бассейн ресуспендированного микросомах, настроить конечный объем до 50 мл буфера CFTR и хорошо перемешать. Резервный 1 мл аликвоту для SDS-PAGE гель анализа, как описано в 2.9 - 2.11. Микросомах теперь может быть флэш заморожены в жидком азоте и хранили при -80 ° C до необходимости.
  12. CFTR могут быть извлечены из микросом с помощью одного из следующих моющих средств: литий perfluorooctonoate кислоты (LiPFO), tetradecanoly-лиза-фосфатидилглицерина (LPG14), н-додецил-β-D-maltoside (DDM). Смешать микросом с CFTR буфера, ингибиторы протеаз и 5% моющего средства (в / в). Если DDM используется, добавить 300 мМ NaCl в буфере. Перемешивать при температуре 4 ° С в течение 15 минут на трубке ротатора.
  13. Центрифуга образцы в 100000 мкг, 4 ° С в течение 1 часа в ультрацентрифуге. Сохраните супернатант и взять небольшую аликвоту для SDS-PAGE гель анализа. CFTR теперь могут быть очищены от solublised материала иммобилизованных металлааффинной хроматографии затем размер хроматографии.

4. Представитель Результаты

Трансформация дрожжей с CFTR содержащие плазмиды не является 100% эффективным. Представитель небольшой экран CFTR выражение в отдельных колоний от преобразования эксперимент даст около 1 в 4 колониях выражение белка. Типичный результат с экрана из 5 колоний взял с плиты показано на панели рис. 3. Одна из колоний показывает сильный уровень экспрессии гена CFTR-гибридного белка GFP, которая обычно проходит между 250 и 130 кДа маркеров кДа, как показано на рисунке. CFTR-GFP флуоресценции уровни значительно различаются между экспериментами с колонией 4 на рис. 3 содержит по меньшей мере в 10 раз больше, чем флуоресценция внутренней флуоресцентной полосой около 70kDa. Если уровни экспрессии гена CFTR-GFP представляется, дают меньше, чем флуоресценция 70 кДа группы, то, вероятно, стоит повторного преобразования и выбора колониис более высоким уровнем CFTR-GFP выражения. Как показано на рис. 3А, вряд ли, даже с высоким уровнем экспрессии гена CFTR-GFP, что CFTR-GFP группа будет заметной в клеточного экстракта путем окрашивания Кумасси.

После выбора колонии были выращены в больших масштабах эксперимента, и микросомах изоляции, наличие CFTR-GFP в микросомах должны быть оценены, как показано на рис. 3B. Результаты этого эксперимента имеют важное значение не только для оценки эффективности индукции выражение, но и проверить, что микросом была подготовлена ​​тщательно и протеолиза была сведена к минимуму. Результаты, показанные на рис. 3Б означает, что в этом эксперименте CFTR-GFP выражении несколько ниже (если судить по отношению к внутренним 70kDa группа), чем в небольшой эксперимент показан на панели А. Однако это впечатление смещены переоблучения детектор флуоресценции в этом измерения. Это объясняется тем, что экспериментатор checkiнг на наличие протеолитических фрагментов CFTR построить. Существует ряд доказательств, в этом эксперименте для некоторых флуоресцентных протеолитических фрагментов между 130 и 100 кДа маркеров кДа, но они очень слабы по сравнению с полнометражным CFTR-GFP группы. С ингибиторами протеазы описаны здесь, мы находим немного свидетельств протеолитической деградации CFTR после клетки поломки. Если значительная протеолиза наблюдается, мы рекомендуем делать свежие решения ингибитор протеазы акций. Мы также обнаружили, что коммерческие таблетки ингибитор протеазы коктейль не столь эффективны для этой системы. Рост клеток за 16 часов (после индукции) приведет к снижению CFTR выражение, как показано на рисунке 4. Вероятно, это связано с оборота белка, возможно, из-за регуляция качества дрожжевой белок механизма контроля 6-9,13. Поэтому целесообразно, чтобы контролировать уровень CFTR выражение после индукции галактозы, если это возможно, в качестве оптимального времени для сбора клеток мау варьироваться от одной лаборатории в другую.

Рисунок 1
Рисунок 1. CFTR конструкция содержащие дрожжи плазмиды. CFTR-GFP-8His слияния вставляется в 2μ p424GAL1 вектор экспрессии под контролем галактозы (GAL1) промотора. Вектор содержит урацил маркер выделения (УРА) и ген устойчивости к ампициллину (Amp).

Рисунок 2
Рисунок 2. Блок-схема обобщения визуализировать протокола.

Рисунок 3
Рисунок 3. Представитель SDS-PAGE гелей выражение CFTR и очистки. Группа показывает пять случайно выбранных трансформированных колоний (полосы 1-5), которые были обследованы на выражение CFTR. Группа B показывает, микросом, которые были изолированы от 15л FERMвведите культуры. Группа C показывает очищенный мышиных CFTR, полученные после двухступенчатой ​​очистки методом аффинной хроматографии затем размер хроматографии. Все гели показано при освещении условия возбуждения флуоресценции от области GFP (слева) и после Кумасси пятно (справа). Относительное расположение молекулярного веса стандарты перечислены слева (кДа).

Рисунок 4
Рисунок 4. Представитель данных для выражения CFTR у дрожжей. Группа показывает время-курс CFTR выражение после индукции галактозы. Клеточные экстракты анализировали с помощью SDS-PAGE и флуоресценции GFP для CFTR белка GFP-группа была интегрирована. Группа B показаны типичные результаты для флуоресцентной микроскопии GFP-экспрессирующие клетки 16 часов после индукции. Как правило, лишь небольшая часть клеток выразить CFTR на высоком уровне.

Discussion

Эта статья относится к способу выражения мышиный белок CFTR в клетках дрожжей, которые должны содействовать проведению исследований на муковисцидоз. Цель состоит в том, чтобы связать эту бумагу с выходом мышиной ДНК CFTR конструкцию, которая будет доступна через кистозный фиброз Foundation ( http://www.cff.org/research/CFFT/ ). Другие ортологи будут доступны позже. Трансформация клеток дрожжей с CFTR содержащие вектор прост, но очень важно для выявления колоний выражения высокого уровня CFTR. Переменный уровень экспрессии могут возникнуть в результате нескольких факторов, но число копий плазмиды в клетки, вероятно, объясняет в значительной степени вариации. Критические шаги, описанные здесь, должны позволять производство CFTR-экспрессирующих клеток дрожжей и CFTR содержащих микросомальных мембран. После преобразований, роста заготовки и лизис дрожжевых клеток были освоены, purification белка должно быть возможно, и на рисунке 3 мы дали пример чистоты, которые должны быть достигнуты в этом случае в качестве полезного ориентира. Это не наше намерение в этой рукописи предоставить подробную методику для очистки белков. Однако, есть некоторые критические вниз стадий очистки, которые являются специфическими для S.cerevisae система выражения, такие как лизис клеток и микросом очистки, и они были включены в подробности в этой рукописи. Следует отметить, однако, что кроме этих двух методов мы использовали альтернативные методы клетки дрожжей нарушения могут быть использованы, например, использование французской ячейки давления. Рекомбинантного белка имеет TEV-расщепляемого С-концевой домен, GFP позволяет белку отслеживаться после индукции (рис. 4). Дрожжи обладают собственным 70kDa белка (вероятно, сукцинатдегидрогеназы 12), флуоресцирует при тех же условиях 11, и это может стать полезной в томNAL стандартные калибровки для относительного уровня экспрессии гена CFTR в целом клеточных экстрактов или микросомах (рис. 3). Как видно из данных, приведенных на рисунке 4, что сроки уборки клетки после индукции галактозой имеет решающее значение. Урожайность падение CFTR стремительно после того, как около 16 часов индукции, так что едва заметного CFTR в клетках дрожжей после 24 часов индукции.

Выход очищенного белка составляет около 1-2 мг CFTR белка на каждые 15 литров культуры ферментер. Восстановление может быть оценена как около 70% от общего CFTR-GFP белка до микросом этапе, и около 25% на восстановление очищенного белка. Характеристика С. CEREVISIAE выраженным CFTR продолжается. Как видно на рис. 4 место белка в клетке можно контролировать с помощью флуоресцентной микроскопии. Хотя большая часть флуоресценции находится на периферии клетки, как ожидалось 10, некоторые из белков показывает точечной локализации, либо, илитолько внутри плазмы мембраны, которая может быть связано с CFTR переработки через поздно Гольджи / эндосом путь 14 или, возможно, отсек вниз по течению от начинающего транспортных везикул с ER 4. Лечение PNGaseF, фермент, который deglycosylates белков, показали минимальные изменения в миграционной группы белка CFTR на SDS-PAGE, подразумевая, что она негликозилированной, или имеет минимальный гликозилирования 15. Эксперименты по фосфорилирования белка продолжаются. В некоторых моющих средств испытания до сих пор, очищенного белка отображает АТФазы (то есть подавляется CFTR-специфического ингибитора 16) по ставкам, которые аналогичны тем, которые ранее опубликованные 2,15. Измерение активности канала CFTR потребует восстановления очищенного белка, который будет означать окончательный этап очистки в моющих средств, который имеет относительно высокую критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ) 17. Дрожжи микросомы containinг CFTR могут быть solublised с несколькими обычно используются моющие средства 18, в том числе моющие средства, такие как додецилсульфата maltoside 2, который, как правило, считается "мягкой". Однако наиболее высокие CMC моющих средств оказались неэффективными для solubilsation, до сих пор, предполагая, что обмен в этих моющих средств должен быть рассмотрен на более позднем этапе в какой-либо очистки схеме.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы благодарим Фонд муковисцидоза (ФФС) для финансирования этой работы через CFTR 3D структура консорциума (грант № FORD08XX0). Мы признаем огромный вклад всех наших коллег в рамках консорциума в этой работе, в частности, в разработке CFTR генов. Мы также признаем, бесценный вклад д-ра. Джеймс Birtley (НЦНИ Демокрита, Греция), Марк Янг (Университет Кардиффа, Великобритания) и Дэвид Дрю (Imperial College, Лондон, Великобритания) на ранних стадиях работы. Мы особенно благодарны д-р Инна Urbatsch (Texas Tech. Университет, Лаббок) за критическое чтение рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0410
Complete supplement mixture without uracil Formedium DCS0169
Bacteriological agar Sigma-Aldrich A5306
D-galactose Fisher BP656-500
D-glucose Fisher D16-500
Pepstatin A Sigma-Aldrich P4265
Leupeptin Merck 108975
Chymostatin Sigma-Aldrich C7268
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) Sigma-Aldrich E3132
Amin–thylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) Sigma-Aldrich A8456
Benzamidine hydrochloride Sigma-Aldrich 434760
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher BP120500
Tris-base Formedium TRIS01
Tris-HCl Fisher P631
D-sorbitol Sigma-Aldrich S1876
Glycerol Fisher 065017
NaCl Sigma-Aldrich S6191
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside Affymetrix D310S
Bromophenol blue Sigma-Aldrich 114391
PageRuler Plus prestained protein standards Fermentas SM1811
NuSep tris-gly 4-20% gradient gels NuSep NB10-420
Instant Blue Coomassie Stain Novexin ISB1L
Glass beads, acid washed Sigma G8772
50ml Sterile Falcon Tubes Sarstedt 62.547.254
2ml Sterile screw-top vials Sarstedt 72.694.005
250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks BD Biosciences 355119
2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks BD Biosciences 355131
2ml microfuge tubes Sarstedt 72.695
0.2μM syringe filter Sartorius FC121
ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 355618
centrifuge tubes Beckman Coulter 357000
1l centrifuge pots Beckman Coulter 969329
Orbital shaking incubator with temperature control New Brunswick Scientific
Deltavision RT restoration microscope Applied Vision
Benchtop centrifuge HERMLE Z300
Benchtop microfuge Fisher 13-100-511
Vortex mixer Star Labs
Typhoon Trio Scanner GE Healthcare 63-0055-87
LAS3000 imaging system Fuji
20l fermenter vessel and control unit Applikon
Constant systems cell disrupter Constant systems
Beadbeater cell disrupter BioSpec 1107900
Mini-beadbeater-16 BioSpec 607
JA-17 rotor Beckman Coulter 369691
Optima L-100 Ultracentrifuge Beckman Coulter 392050
50.2Ti rotor Beckman Coulter 337901

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. CFTR three-dimensional structure. Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).
  2. Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).
  3. Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling. Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).
  4. Kiser, G. L. Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae. Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).
  5. Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).
  6. Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation. Mol. Biol. Cell. 18, 806-814 (2007).
  7. Fu, L., Sztul, E. ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy. Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).
  8. Sun, F. Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants. J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).
  9. Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. CFTR expression and ER-associated degradation in yeast. Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).
  10. Drew, D. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).
  11. Knight, A. W., Billinton, N. Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).
  12. Robinson, K. M., Lemire, B. D. Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit. J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).
  13. Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on. the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).
  14. Yoo, J. S. Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway. J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).
  15. Zhang, L. Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding. Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).
  16. Wellhauser, L. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).
  17. Ramjeesingh, M. A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).
  18. Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).

Tags

Молекулярная биология выпуск 61 мембранный белок муковисцидоз CFTR экспрессии белков кистозный фиброз фонда системы экспрессии зеленый флуоресцентный белок
Выражение и очистка муковисцидоза трансмембранного регулятора проводимости белка в<em> Saccharomyces CEREVISIAE</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., … More

O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (61), e3860, doi:10.3791/3860 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter