Summary
で嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）を表現する試み
Abstract
嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）が変異すると、したがって、このタンパク質にはかなりの関心がhumans.Thereで嚢胞性線維症を生じさせることができるクロライドチャネルであるが、その構造と活性を研究するための努力は困難によって妨げられている1から3蛋白質の十分な量を発現し、精製する。多くの"困難な"真核生物の膜タンパク質と同様に、急成長している生物での発現が望ましいですが、やりがいがあり、酵母S.の酵母は 、これまで少量が得られた組換えタンパク質の急速な劣化が4-9を観察した。酵母における組換えCFTRの処理に関与するタンパク質は6-9に記載されている。本報告では、かなりの量の酵母とその浄化のCFTRの発現のための方法論を記述します。プロトコルは、以前のタンパク質分解の問題は克服することができる方法について説明し、どのように発現レベルのCFTRが大幅に細胞採取の前に特定の期間内に、細胞の成長条件を変更することにより、誘導条件を制御することによって改善することができます。このプロトコル（マウスCFTR発現酵母細胞または酵母プラスミド）に関連付けられているreagantsは、研究を後援している米国の嚢胞性線維症財団を介して配布されます。 CFTRの設計と合成、このレポートで用いコンストラクトを記述した記事が（; Thibodeau、P. ら 、未発表Urbatsch、I.）は別途公開されます。プラスミドを含む酵母（図1） - この記事では、CFTRの構築と酵母細胞の形質転換手法の始まりを説明します。構文は、C末端に融合CFTR緑色蛍光タンパク質（GFP）の配列を持っており、ドリューらによって開発されたシステム。（2008）10に従います 。 GFPは、CFTRの発現と精製は比較的容易に続くことができます。 Joveの可視化機能実装酵母細胞からミクロソームの調製後オール終了すると、我々はミクロソームからのタンパク質の精製のためのいくつかの提案が含まれていますが。読者はそれらに利用可能な蛋白質とローカル機器で実施される最終的な実験に依存し、ミクロソーム精製法に独自の変更を追加したい場合があります。酵母発現CFTR蛋白質は、部分的に本質的なポリヒスチジン精製タグを使用して、金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができる。その後のサイズ排除クロマトグラフィーは、SDS-PAGEとゲルのクマシー染色で判定して、> 90％純粋であると思われるタンパク質が得られます。
Protocol
1。メディアとバッファの準備
- YNB：1リットルの場合は、1リットルの水にウラシルなく、アミノ酸と0.77グラムの完全な補足物なしで6.9グラムの酵母窒素塩基を中断します。オートクレーブ。 4℃で保管してください
- YNBA：400ミリリットルの場合は、ウラシルと350ミリリットルの水に8グラム細菌寒天することなく、アミノ酸なしで0.38グラムの完全な補足の混合物を2.76グラムの酵母窒素塩基を中断します。オートクレーブ。溶解するまで穏やかに50ミリリットルの水と熱で8グラムのグルコースを混ぜます。 0.2μmフィルターで滅菌し、寒天が溶融しながらYNBAに追加します。室温で保管してください。
- 20％グルコース培地：溶解するまで500ミリリットルは、優しく500ミリリットルYNBと熱で100 gのグルコースを混ぜます。滅菌デュラン瓶に0.2μmのフィルターを通過します。室温で保管してください。
- 20％のガラクトース培地：溶解するまで2リットルについては、静かに2リットルYNBと熱で400グラムのガラクトースを混在させること。滅菌デュラン瓶に0.2μmのフィルターを通過します。部屋の温度で保存しature。
- プロテアーゼ阻害剤の在庫：CFTRタンパク質分解4に非常に敏感です。読者が独自の要件を満たすために、このリストを調整したいかもしれませんが、著者は、以下の阻害剤がタンパク質分解を制限するのに有効であることがわかった。凍結融解の問題を減らすために-20℃で100μlアリコートに保管してください。すべての阻害剤は、以下のようにストック溶液から作業濃度に希釈する必要があります。
| 阻害剤 | ストック濃度 | 原料調製 | ワーキング濃度 |
| AEBSF | 200mMの | 1ミリリットルの蒸留水に48mgを溶解し | 0.2mMの |
| ベンズアミジン | 300mMの | 1ミリリットルの蒸留水に36mgを溶解し | 0.3mMの |
| キモスタチン | 4mMの | 1ミリリットル乾燥したDMで2.5mgを溶解するSO | 4μM |
| E-64 | 7 mmの | 1ミリリットルの蒸留水に2.5mgをを溶かす | 7μM |
| ロイペプチン | 20mMの | 1ミリリットルの蒸留水に10mgの溶解 | 20μM |
| ペプスタチン | 15mMの | 1ミリリットルの乾燥DMSO中の10mgのを溶かす | 15μM |
| PMSF | 1 M | 1ミリリットルの乾燥DMSO中の174mgを溶解し | 1mMの |
- DTT（1 M）：1ミリリットルの蒸留水に154 mgのジチオスレイトールを溶解する。 -20℃で保存示されたバッファ内の1:1000希釈で使用してください。
- EDTA（0.5 M）：100mlの水とミックス29.22グラムエチレンジアミン四酢酸。 EDTAのすべてが溶解し、pHが8に達するまで、10 N NaOHを滴下を追加します。水で200mlにメイクアップ、滅菌デュラン瓶に0.2μmフィルターを通過します。室温で保管してください。
- CRB（300mMのトリス-HCl、pHは7.4、ソルビトール0.56 M、1mMのEDTA）：350 mlの水で18.17グラムトリスベースを溶かし、HClの添加によりpHを7.4に調整します。ソルビトール51.35グラムを追加し、水で500mlにボリュームを構成しています。オートクレーブ。 4℃で1ミリリットルEDTAのストック溶液とストアを追加℃に
- CFTR緩衝液（50mMトリス、pH8.0、10％v / vのグリセロール）：500 mlの水に6.06グラムトリスベースを溶かす。 HClでpHを8に調整し、100mlのグリセロールを追加し、水で1 Lに構成しています。 4℃でオートクレーブや店舗
- 50mMのトリス-HCl（pH7.6）で、5％グリセロール、5mMのEDTA（pH8.0）を、0.02％ブロモフェノールブルー、4％SDS、0.05 M DTT：負荷染料の2倍。 -20℃で10ミリリットル、アリコートと店を作る
2。スクリーニング形質転換
このプロトコルは、S.cerevisiae 10の変異体PEP4削除、CFTR-GFP-8His融合遺伝子は、GAL1ガラクトースプロモーター（図1）に酵母プラスミドの下流に挿入されていることと、プラスミドをFGY217細胞に形質転換されていることを前提とら （2008）10で詳細に説明されています。
- 形質転換プレート5から10まで同様で区切られたコロニーを選択します。 20％グルコース培地9mlのYNBと1ミリリットルを含む別の滅菌50mlファルコンチューブに各コロニーを転送します。このステップのために、それは細胞の成長を維持するために、文化の中で2％グルコース（w / v）の最終濃度を持っていることが重要です。軌道振盪インキュベーターで30℃、250 rpmで16時間一晩成長する。
- スクリーニングされたコロニーのそれぞれについて、グリセロールストックを作る。無菌的に標識されたスクリュートップバイアル、0.2 mlの滅菌グリセロール、-80渦簡単に、店舗℃に一晩培養液0.8mlを追加する
- 20％グルコース培地を250μlを含むYNBで50mlの最終容量に残りの一晩培養し、希釈します。高グルコースは、GAL1プロモーター10を抑制することができますので、このステップでは、それが文 化の中で約0.1％（w / w）にグルコース濃度を希釈することが重要です。標識された250ミリリットルの三角の文化を育てるには、250回転、軌道振盪インキュベーターで30℃で0.7から0.8のOD 600にフラスコを困惑。
- 各フラスコに5ミリリットルの20％ガラクトース培地を添加することによって文化を誘導し、16時間で育つ。
- 蛍光顕微鏡を用いてCFTRの発現を確認してください。培養物100μlを取り、溶液中の細胞の移動を制限するために、100μlのグリセロールを追加します。 FITCフィルター（490nmの励起波長と528から538 nmの発光波長）の下に青色レーザーを使用して、デルタビジョンRT復元顕微鏡（または類似の）上で細胞を分析します。 CFTR-GFP融合タンパク質の陽性発現は、酵母細胞の細胞膜での蛍光のリングとして表示する必要があります。非形質転換酵母細胞をコントロールとして使用することができます。
- 転送50ミリリットルのファルコンチューブに文化。ベンチトップ遠心機で10分間3500×gで4℃で遠心して細胞を収穫します。遠心分離機が稼働している一方で、氷の上で約500μlの酸洗浄ガラスビーズと場所を含むスクリュートップスで2 mlのマイクロチューブを準備します。上清を捨て、500から800μlの氷冷CRBの各ペレットを再懸濁 と プロテアーゼ阻害剤。ビーズを含むマイクロチューブに懸濁液を移し、氷上に置きます。
- 精力的に期間の間に氷の上で休んで、30秒の10期間に揺れ/各マイクロチューブをボルテックスして細胞を溶解する。 beadbeaterは別の、例えば3分間作動BioSpecミニbeadbeaterとして用いることができる。
- 5分間3500×gで4℃で卓上マイクロ遠心チューブに配置します。氷上でマイクロ遠心チューブと場所をきれいにする粗膜の人口を含む上清を移す。 500μlの新鮮な氷-COを追加します。LD CRB 各チューブにプロテアーゼ阻害剤とし、膜を蓄積するプロセスを繰り返します。
- 2時間用のベンチトップ型マイクロでは最高速度、4℃で回転させて粗膜を収集します。上清を廃棄し、50μlの氷冷CFTRバッファ内の各ペレットを再懸濁します。
- きれいな微量遠心チューブに、上下にピペッティングして15μlの2倍の負荷色素で各々の懸濁液15μlを混合します。室温で10分間インキュベートします。これはCFTRと他の膜タンパク質はSDS-不溶性凝集体を形成し、また、GFPタグを変性させる原因となりますので、サンプルを沸騰させないようにしてください。
- 4〜20％トリス/グリシン勾配ゲル（NuSep）へPageRulerプラスジウムタンパク質標準（Fermentas）と一緒にサンプルをロードし、40分間または色素フロントがゲルの下部になるまで、150 Vで動作します。
- ゲル内蛍光によって最高を発現する細胞を識別します。このような台風スキャナとして蛍光イメージングシステムに配置します。ゲルuをスキャンする488nmの励起波長と526 nmの発光波長での青色レーザーを歌います。 CFTR-GFP融合は約220 kDaの目に見える必要があります。また、おそらく内因性酵母FADを含有する膜タンパク質11,12（例えば、コハク酸脱水素酵素サブユニットなど）である約70 kDaの目に見える弱い蛍光バンドが存在します。
- 便利な画像閲覧用ソフトウェアパッケージを使用して蛍光スキャンと比較するためにゲルを脱色し、スキャンでは、クマシーでゲルを染色する。クマシー染色ゲルは、ゲルの各トラックに読み込まれて総蛋白量の正規化後の異なるクローンの行のCFTR-GFPの発現レベルの相対評価することができます。
- 新鮮なYNBAへのグリセロールストックから最高発現細胞株（2.2）をストリーク 2〜3日で30℃でプレートとインキュベートします。このプレートを4℃で2週間用に保存することができる
3。大規模な発酵·カルトURE
- 発酵槽の事前培養を準備します。 YNBAから細胞の1cm 2の面積をこすり プレート（2.13）は、滅菌ループを使用して、45ミリリットルYNB、5 mlの20％グルコース培地にOD 600が約0.1になるように追加します。 OD 600が 1に達するまで、軌道振盪インキュベーターで250rpmで、30℃で250ミリリットルの三角フラスコバッフル付で育つ。
- それぞれを含む450ミリリットルYNB、25mlの20％グルコース培地をフラスコ三角フラスコは、困惑2 2リットルの間で文化を分割します。 250回転、軌道振盪インキュベーターで30°C OD 600が 1.2に達するまででにこれらを栽培しています。
- これらの事前の文化が成長している一方で、発酵槽を設定します。 1.1で説明したようにYNBの11.2リットルを行いますが、誘導においてグリセロールの添加を補うためにサプリメントアウトに関しては追加8.28グラムYNBと0.95グラムの低下を解消する。無菌的に滅菌した20リットル発酵容器に11.2リットルYNBと75ミリリットルの20％グルコース培地を追加して、実行中の温度を調整する30℃
- 無菌的に発酵槽に前培養物を追加し、約800 rpmに攪拌速度を設定し、30℃で温度を維持℃に圧縮空気は、約15 DM 3分-1で流れる必要があります。発酵槽培養は、1.2のOD 600に到達すると、無菌的に1.5リットルYNB 20％ガラクトース溶液と1.2リットルのグリセリンを加えることにより誘導する。 25°Cに温度を下げ、16時間培養を栽培しています。
- 蠕動ポンプを用いて氷上で冷却した1リットルを遠心ポットに発酵槽の内容を転送します。大容量ローター（例えば、6リットル）で30分間3500×gで4℃で遠心して細胞を収穫します。プロテアーゼ阻害剤を150mlの氷冷CRBで細胞を再懸濁します。ここから、すべての作業は4℃で実施されるべきで
- それぞれのケースで、氷上でライセートを集め、25、30、32、35 kPaで4回のパスで定数系細胞の破砕機を通過して細胞を溶解する。また、ビーズベアテを使用し酸洗浄0.5 mmのガラスビーズの等量のR（Biospec）とフルパワーで3分間振とうする。 3500 XG、卓上遠心機で15分間4℃で遠心分離して50ミリリットルファルコンチューブ、ペレット細胞の破片にライセートを移します。
- 冷やした遠心チューブに上清を移します。ミトコンドリア削除する遠心機で30分間14,000×gで4℃で遠心します。
- 冷やした遠心チューブに上清を移します。ミクロソームを収集するために超遠心機で90分20万xgで4℃で遠心します。
- 注意深くデカントして上清を廃棄し、各チューブにプロテアーゼ阻害剤および1mMのDTTで2ミリリットルの氷冷CFTRバッファを追加します。穏やかにボルテックスミキサーを用いてCFTRバッファーと混合して各チューブトップアップブラシを使用して、ペレットを再懸濁します。
- 超遠心機で60分の20万xgで4℃で懸濁液を遠心分離し、2 mlの氷冷CFTRバッファwに上清と再懸濁し、ペレットを捨てるi番目のプロテアーゼ阻害剤 絵筆を使って（いないDTT）。
- プール再懸濁したミクロソーム、CFTRバッファー50 mlに最終的な音量を調整し、よく混ぜる。予備のSDS-PAGEゲル分析のために1mlのアリコートを、2.9で説明したように - 2.11。ミクロソームは、フラッシュは、液体窒素中で凍結され、必要とされるまで、-80℃で保存することができます。
- リチウムperfluorooctonoate酸（LiPFO）、tetradecanoly-リゾホスファチジルグリセロール（LPG14）、n-ドデシル-β-D-マルトシド（DDM）：CFTRは、次の洗剤のいずれかを使用してミクロソームから抽出することができます。 CFTRバッファー、プロテアーゼ阻害剤と5％の洗剤（w / w）のでミクロソームを混ぜる。 DDMが使用されている場合も、バッファへのNaClを300mMのを追加します。チューブローテーターで15分間4℃で攪拌してください。
- 超遠心機で1時間、100,000×gで4℃でサンプルを遠心分離します。上清を保持し、SDS-PAGEゲル分析のための小アリコートを取る。 CFTRは現在、固定化金属でsolublised材料から精製することができるアフィニティークロマトグラフィーサイズ排除クロマトグラフィー、続いて。
4。代表的な結果
CFTRを含むプラスミドを持つ酵母の形質転換は100％効率的ではありません。形質転換実験から選択されたコロニーのCFTR発現の代表的な小規模の画面には、タンパク質を発現する4個のコロニーで約1が得られます。プレートから選んだ5つのコロニーの画面からの典型的な結果は、図1のパネルに表示されます。 3。コロニーの一つは、典型的に示すように、250 kDaと130 kDaのマーカーの間に実行されるCFTR-GFP融合タンパク質の発現の強いレベルを示します。 CFTR-GFP蛍光レベルは、図4コロニーで、実験間でかなり異なります。 3は、70kDa程度で本質的な蛍光帯域よりも少なくとも10倍以上の蛍光を示す。 CFTR-GFPの発現レベルは70 kDaのバンドよりも小さい蛍光与えるために表示される場合は、それはおそらく再変換し、コロニーを選択する価値があるCFTR-GFPの発現の高いレベルである。図に示すように。図3Aは、それはCFTR-GFPのバンドはクマシー染色により、細胞抽出液中に識別可能となることも、CFTR-GFPの高い発現レベルで、ほとんどありません。
一度選択したコロニーは、大規模実験で増殖させ、ミクロソームは単離された、ミクロソーム内CFTR-GFPの存在は、図1に示すように、評価する必要があります。 3B。この実験の結果は重要ではなく、発現の誘導の効率を評価するだけでなく、ミクロソームは慎重に準備されていると、そのタンパク質分解が最小化されていることを確認するだけです。図に示す結果。図3Bは、この実験ではCFTR-GFP発現がしかし、この印象は、この中の蛍光検出器の露出によってバイアスされているパネルAに示すように、小規模の実験に比べて（ように本質的な70kDaのバンドの相対判定）やや低いことを意味測定。実験者はcheckiたので、これがあったCFTR構築のタンパク質分解断片の存在のためにNG。そこに130 kDaと100 kDaのマーカーの間にいくつかの蛍光タンパク質分解断片は、この実験ではいくつかの証拠があるが、これらはフルレングスCFTR-GFPのバンドに比べて非常に弱い。ここで説明したプロテアーゼ阻害剤で、我々はセルの破損後のCFTRのタンパク質分解のための少し証拠を見つける。重要なタンパク質分解が観察された場合には、私たちは新鮮なプロテアーゼ阻害剤ストック溶液を作ることをお勧めします。我々はまた、商業的プロテアーゼインヒビターカクテル錠はこのシステムのように効果的ではないことを発見した。図4に示すように16時間（誘導後）を超えて細胞の増殖は減少したCFTRの発現をもたらすでしょう。これはおそらく、おそらくタンパク質の代謝回転、酵母のタンパク質品質管理機構6-9,13のアップレギュレーションに起因するためである。それが可能であれば、最適な時間として、細胞を収穫し、従ってミリアンペアガラクトースで誘導した後にCFTRの発現レベルを監視することをお勧めしますyは1室ごとに異なる。
図1。プラスミドCFTR構造含有酵母 。 CFTR-GFP-8His融合は、ガラクトース（GAL1）プロモーターの制御下で、2μp424GAL1発現ベクターに挿入されます。ベクターはまた、ウラシル選択マーカー（URA）とアンピシリン耐性遺伝子（Amp）が含まれています。
図2。可視化プロトコルをまとめたフローチャートである。
図3。 CFTRの発現および精製の 代表的なSDS-PAGEゲル。パネルには、CFTRの発現についてスクリーニングされた5ランダムに選んだ形質転換体コロニー（レーン1-5）を示しています。 パネルBは 15リットルFERMから単離されたミクロソームを示しています。文化を入力してください。 パネルCは、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを用いた二段階精製後に得られた精製マウスCFTRを示しています。すべてのゲルは、（右）の照明条件下でのGFPのドメインからの刺激的な蛍光を示し（左）とクマシー染色した後にされています。分子量標準の相対的な位置は、左（kDa）のに記載されています。
図4。酵母におけるCFTRの発現のための代表的なデータ。パネルには、ガラクトースによる誘導後のCFTR発現のタイムコースを示しています。細胞抽出物をSDS-PAGEにより分析した、とCFTR-GFPタンパク質のバンドのGFPの蛍光が統合されました。 パネルBは、GFP発現細胞の蛍光顕微鏡16時間後の誘導のための典型的な結果を示しています。一般的に、細胞の一部のみが高いレベルでCFTRを発現する。
Discussion
本論文では、嚢胞性線維症の研究を促進すべきである酵母細胞でネズミのCFTR蛋白質の発現方法を提供する。目的は、嚢胞性線維症財団（経由で利用できるようになりますマウスCFTR DNAコンストラクトのリリースでこの論文をリンクすることであるhttp://www.cff.org/research/CFFT/ ）。他のオルソログは、後で利用できるようになるはずです。 CFTRを含むベクターを用いた酵母細胞の形質転換は簡単ですが、それはCFTRの高発現コロニーをスクリーニングすることが重要です。変数の発現レベルは、いくつかの要因から発生する可能性がありますが、プラスミド細胞当たりのコピー数は、おそらく変動の重要度を占めています。ここで説明する重要なステップでは、CFTR発現酵母細胞およびCFTR含むミクロソーム膜の生産を許可する必要があります。酵母細胞の形質転換、成長、収穫や溶解が習得されたら、purifタンパク質のicationが可能であるべきであり、図3に我々は、有用なベンチマークとして、このケースでは達成可能でなければなりません純度の例を与えている。それは、タンパク質の精製のために詳細な方法論を提供するために、この原稿では我々の意図ではありません。しかし、そこにそのような細胞溶解とミクロソーム精製などS.cerevisae発現系に固有のいくつかの重要な下流の精製工程があり、これらは本稿で詳細に含まれています。それは離れて我々が使用している二つの方法から、別の酵母細胞の破砕方法は、フランス語圧力セルの使用など、用いることができること、しかし、言及されるべきである。組換えタンパク質は、タンパク質が誘導する（図4）の後に追跡することができTEV-開裂可能なC末端GFPのドメインを持っています。酵母は同じ条件で11、この下に蛍光が役に立つ間を提供することができます本質的な70kDaタンパク質（おそらくデヒドロゲナーゼ12コハク酸）が全細胞抽出物またはミクロソームにおけるCFTRの相対発現レベルの内部キャリブレーション標準（図3）。それはガラクトースで誘導後の細胞収穫のタイミングが重要であることを図4に示すデータから明らかである。 CFTRのドロップの収率は急激に誘導の約16時間後、酵母細胞内の任意の検出可能なCFTRは、誘導の24時間後にやっとそこにあるように。
精製タンパク質の収量は15リットル発酵槽培養液ごとに1-2mgを約CFTR蛋白質である。リカバリは、ミクロソームのステージに合計CFTR-GFP蛋白質までの約70％と推定され、タンパク質の精製約25％回復することができます。 S.のキャラクタリゼーション酵母発現CFTRは進行中である。図に見られる。 4、細胞内の蛋白質の場所は、蛍光顕微鏡で監視することができます。蛍光の多くが予想される10個のセルの周囲に発見されていますが、タンパク質の一部が点状の局在を表示、のいずれか、またはただ、おそらく後期ゴルジ体/エンドソーム経路14またはER 4からの輸送小胞の出芽のコンパートメント下流を通じてリサイクルをCFTRが原因である可能性があり、原形質膜の内側。 PNGaseF、タンパク質をdeglycosylates酵素を用いた治療は、それがグリコシル化されていることを意味し、SDS-PAGE上のCFTRタンパク質のバンドの移行に最小限の変化を示し、または最小限のグリコシル化15を有する。タンパク質のリン酸化状態の実験が進行中である。洗剤の一部にこれまでテストされ、精製されたタンパク質は、以前は2,15公開されたものに類似しているレートでATPase活性を（CFTR-特異的阻害剤16によって阻害されている）が表示されます。 CFTRチャネル活性の測定は、比較的高い臨界ミセル濃度（CMC）17を有する洗剤の最終的な精製工程を含意するでしょう精製タンパク質の再構成が必要になります。酵母ミクロソームのcontaininグラムCFTRは、例えば、一般的に"マイルド"であると考えられているドデシルマルトシド2のような界面活性剤を含むいくつかの一般的に用いられる界面活性剤18とsolublisedすることができます。しかし、最も高いCMC洗剤は、これらの界面活性剤にその交換を示唆し、これまでのところ、solubilsationでは不十分であることが判明している任意の精製スキームの後半の段階で考慮されるべきである。
Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
我々はそのCFTR 3次元構造コンソーシアム（承認番号FORD08XX0）を介して、この作業に資金を提供するため嚢胞性線維症財団（CFF）を感謝します。我々はCFTR遺伝子の設計では、特にこの仕事にコンソーシアム内のすべての仲間たちの巨大な貢献を認める。また、博士の貴重な貢献を認める。作業の初期段階ではジェームズBirtley（NCSR Demokritos、ギリシャ）、マーク·ヤング（カーディフ大学、英国）とデビッド·ドリュー（インペリアル·カレッジ、ロンドン、英国）。我々は、特に原稿の重要な読書のために博士伊那Urbatsch（テキサス工科。大学、ラボック）に感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10 | |||
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 | |
| Complete supplement mixture without uracil | Formedium | DCS0169 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| D-galactose | Fisher | BP656-500 | |
| D-glucose | Fisher | D16-500 | |
| Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 | |
| Leupeptin | Merck | 108975 | |
| Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 | |
| Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 | |
| Amin–thylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 | |
| Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP120500 | |
| Tris-base | Formedium | TRIS01 | |
| Tris-HCl | Fisher | P631 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Glycerol | Fisher | 065017 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Affymetrix | D310S | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| PageRuler Plus prestained protein standards | Fermentas | SM1811 | |
| NuSep tris-gly 4-20% gradient gels | NuSep | NB10-420 | |
| Instant Blue Coomassie Stain | Novexin | ISB1L | |
| Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 | |
| 50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 2ml Sterile screw-top vials | Sarstedt | 72.694.005 | |
| 250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355119 | |
| 2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355131 | |
| 2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 | |
| 0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 | |
| ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 | |
| centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 | |
| 1l centrifuge pots | Beckman Coulter | 969329 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | ||
| Deltavision RT restoration microscope | Applied Vision | ||
| Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 | |
| Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 | |
| Vortex mixer | Star Labs | ||
| Typhoon Trio Scanner | GE Healthcare | 63-0055-87 | |
| LAS3000 imaging system | Fuji | ||
| 20l fermenter vessel and control unit | Applikon | ||
| Constant systems cell disrupter | Constant systems | ||
| Beadbeater cell disrupter | BioSpec | 1107900 | |
| Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 | |
| JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 | |
| Optima L-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 | |
| 50.2Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
References
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